Article de méthode

Modèle organoïde tumoral tridimensionnel dérivé du patient pour le dépistage in vitro des cellules T du récepteur chimérique antigénique

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DOI :

10.3791/69113

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30 décembre 2025

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1Department of Oncology, Shenzhen Qianhai Shekou Free Trade Zone Hospital, 2Department of Pharmacology, Joint Laboratory of Guangdong-Hong Kong Universities for Vascular Homeostasis and Diseases, School of Medicine, Southern University of Science and Technology, 3Department of Digestive Disease, Shenzhen Qianhai Shekou Free Trade Zone Hospital, 4Department of Human Cell Biology and Genetics, School of Medicine, Southern University of Science and Technology, 5Department of Surgical Endoscopy, Shenzhen People's Hospital (The First Affiliated Hospital, Southern University of Science and Technology; The Second Clinical Medical College, Jinan University), 6Department of Medicine and Therapeutics, Faculty of Medicine, The Chinese University of Hong Kong, 7Institute of Digestive Disease, State Key Laboratory of Digestive Disease, Faculty of Medicine, The Chinese University of Hong Kong

Dans cet article

Résumé

Ce protocole établit un modèle de co-culture in vitro utilisant des organoïdes tumoraux dérivés du patient et des cellules T (CAR-T) récepteurs chimériques de l’antigène afin d’évaluer l’activité cytotoxique spécifique des cellules CAR-T contre les cellules tumorales solides.

Résumé

La thérapie par cellules du récepteur chimérique antigénique T (CAR-T) a atteint une efficacité clinique passionnante dans les cancers hématologiques, mais la thérapie par cellules CAR-T pour les tumeurs solides nécessite encore un développement supplémentaire. Les organoïdes tumoraux dérivés du patient sont des modèles de maladies in vitro qui conservent l’hétérogénéité du patient et ont été utilisés pour tester l’efficacité et la sécurité de la chimiothérapie et des médicaments ciblés. Cette méthode décrit un modèle de test d’efficacité in vitro de co-culture d’organoïdes tumoraux avec des cellules CAR-T. Les échantillons de cancer colorectal provenant de patients sont construits en organoïdes tumoraux à structure tridimensionnelle (3D) dans une matrice membranaire basale. Les organoïdes tumoraux peuvent croître de manière stable et être transmis en continu. Les organoïdes tumoraux matures sont séparés de la matrice par lavage et centrifugation, et les cellules CAR-T sont ajoutées à différents rapports effecteur/cible (E :T) pour former un système de co-culture immuno-organoïde. Après 6 à 24 heures, la morphologie et les structures intercellulaires des organoïdes sont observées par imagerie en champ clair. Cette expérience réalise également une coloration des cellules mortes dans le système de co-culture, ce qui peut refléter la viabilité des organoïdes et évaluer l’effet cytotoxique des cellules CAR-T sur les organoïdes tumoraux. Cette expérience peut observer efficacement l’interaction entre les cellules CAR-T et les organoïdes tumoraux 3D, et les résultats peuvent être utilisés pour évaluer l’activité tumultaire des cellules CAR-T.

Introduction

La thérapie par cellules du récepteur chimérique antigénique T (CAR-T) a montré un succès clinique remarquable dans le traitement des cancershématologiques 1. Cependant, son application dans les tumeurs solides reste limitée en raison de plusieurs obstacles majeurs, notamment l’hétérogénéité tumorale et la perte d’antigènes, les barrières physiques et chimiques au sein de la masse tumorale, ainsi que le microenvironnement tumoralimmunosuppresseur 2,3. Ces défis contribuent à l’efficacité limitée de la thérapie par cellules CAR-T dans les milieux tumoraux solides.

L’évaluation in vitro de l’efficacité des cellules CAR-T est une étape cruciale lors du développement préclinique. Les modèles les plus couramment utilisés sont des lignées cellulaires tumorales, qui peuvent soit exprimer des antigènes associés à la tumeur spécifiques, soit être modifiées pour transporter des gènes rapporteurs tels que la luciférase 4,5. Par conséquent, les résultats des tests conventionnels basés sur des lignées cellulaires ne prédisent souvent pas les résultats cliniques. Les modèles tumoraux dérivés du patient offrent une alternative prometteuse pour évaluer plus précisément la fonction du CAR-T dans le contexte des tumeurs solides.

Bien que plusieurs études aient commencé à utiliser les PDTO pour l’évaluation des cellules CAR-T, des défis subsistent pour établir des protocoles de co-culture standardisés, robustes et accessibles qui équilibrent efficacement la préservation de l’architecture tumérale 3D avec une interaction efficace cellule immunitaire-cellule tumorale. Les organoïdes tumoraux dérivés du patient (PDTO) sont des modèles tridimensionnels (3D) de maladies ex vivo générés à partir des tissus ou cellules tumorales du patient. Les PDTO ont été établies avec succès pour un large éventail de types de tumeurs, notamment les cancers colorectals, du sein, du pancréas et du poumon. Ces structures conservent l’architecture histologique, les profils moléculaires et l’hétérogénéité fonctionnelle de la tumeurd’origine 6. Aux côtés des cellules tumorales primaires et des xénogreffes dérivées du patient (PDX), les PDTO représentent une plateforme précieuse pour modéliser les caractéristiques pathologiques spécifiques à chaquepatient 7. Comparées aux lignées cellulaires tumorales conventionnelles ou aux cultures primaires, les PDTO reproduisent plus fidèlement l’environnement tumoral in vivo, présentant des compositions cellulaires complexes et une organisationstructurelle 8. Ils maintiennent également la stabilité génomique et préservent les schémas d’expression génique sur des passages prolongés, permettant une évaluation plus précise des réponses thérapeutiques 9,10. Les PDTO ont été utilisés avec succès dans des études sur la biologie tumorale, le dépistage de drogues et la médecine de précision, et sont de plus en plus reconnus pour leur utilité dans les tests d’immunothérapie, notamment l’identification de nouvelles cibles CAR, l’optimisation de la conception de CAR et l’évaluation de lacytotoxicité 6,11,12,13 . Une limitation courante de la culture organoïde est sa dépendance aux composants de la matrice extracellulaire (ECM) comme Matrigel (désormais appelé matrice membranaire basale [BMM]) pour le maintien de la structure 3D, ce qui peut freiner l’infiltration des cellules immunitaires dans les tests de coculture. Pour garantir la cohérence et une interaction cellulaire optimale en co-culture, des organoïdes dans une plage de taille définie (par exemple, 100-200 μm de diamètre) sont généralement sélectionnés.

Ce protocole décrit une plateforme de co-culture pour évaluer la cytotoxicité des cellules CAR-T à l’aide de PDTO dérivés du cancer colorectal. Les échantillons de tumeurs des patients sont dissociés enzymatiquement et cultivés dans le BMM pour générer des organoïdes 3D. Une fois matures et étenduses, les organoïdes de taille uniforme sont isolés et marqués par fluorescence. Ils sont ensemencés dans des plaques multi-puits et co-cultivés avec les cellules CAR-T à des rapports effecteur/cible (E :T) variables. Une caractéristique clé de cette approche est le retrait délibéré des PDTO du BMM avant la co-culture, permettant un accès direct et sans entrave des cellules CAR-T aux organoïdes tumoraux tout en maintenant leur intégrité 3D en suspension. Après 24 heures, la microscopie en champ clair révèle une désintégration progressive de la PDTO, caractérisée par une morphologie 3D perturbée, un rétrécissement des cellules tumorales et une perte de viabilité. L’imagerie à cellules vivantes et la microscopie à fluorescence visualisent davantage les interactions entre les cellules CAR-T marquées fluorescentement et les cibles tumorales. Des tests quantitatifs sur la mort cellulaire sont utilisés pour évaluer la cytotoxicité. Cette co-culture immunitaire à base d’organoïdes offre une plateforme robuste et spécifique au patient pour évaluer l’efficacité antitumorale des cellules CAR-T ex vivo, permettant une optimisation thérapeutique et un soutien à la traduction clinique.

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Protocole

Des organoïdes dérivés des patients atteints de cancer colorectal ont été utilisés. Des fragments de tissu tumoral ont été prélevés chez des patients naïfs au traitement présentant un adénocarcinome colorectal primaire (CCR) confirmé histologiquement. Tous les tissus ont été prélevés à partir d’échantillons de biopsie endoscopique collectés lors des procédures diagnostiques standard à l’hôpital de la zone franche Qianhai Shekou de Shenzhen. Tous les tissus donneurs ont été confirmés comme CRC par examen histopathologique par des pathologistes institutionnels. Le protocole suit les directives institutionnelles. Des consentements éclairés écrits ont été obtenus de tous les patients. L’étude a été approuvée par le Comité d’éthique de l’hôpital de la zone franche Qianhai Shekou de Shenzhen (2024-009-01K).

1. Culture PDTO

  1. Préparation des tissus
    1. Placez les fragments de tissu tumoral prélevés par biopsie coloscopique de patients présentant un adénocarcinome colorectal primaire (CCR) confirmé histologiquement dans un tube stérile de 50 mL.
    2. Ajoutez 30 mL de solution de lavage de tissu froid composée de la solution salée équilibrée de Hanks (HBSS), de l’albumine sérique bovine à 1 % (BSA), de 100 U/mL de pénicilline, de 0,1 mg/mL de streptomycine, de 50 μg/mL de gentamicine, de 5 μg/mL d’amphotéricine B et d’un inhibiteur kinase associée à la Rho-associée à 10 μM (Y-27632).
    3. Placez le tube sur de la glace et faites balancer doucement pendant 5 minutes pour laver le mouchoir.
    4. Répétez l’étape 1.1.3. Deux fois de plus avec une nouvelle solution de lavage pour mouchoirs.
  2. Digestion des tissus
    1. Retirez le tissu nécrosique ou adipeux et découpez la tumeur en fragments de tissu.
    2. Température de 8 mL de milieu digestif (milieu DMEM, collagénase 500 U/mL IV, 1,5 mg/mL collagénase II, 20 μg/mL d’hyaluronidase, 0,1 mg/mL dispase type II, 10 μM Y-27632, et sérum bovin fœtal à 1 %) à 37 °C.
    3. Transférez les fragments dans le tampon de digestion et incubez à 37 °C dans un bain-marie. Faites tourner doucement le tube à la main pendant ~10 secondes toutes les 5 minutes pour faciliter la pénétration des enzymes.
      REMARQUE : Ajustez le volume tampon de digestion selon la taille du bloc tissulaire. En général, 8 à 10 mL sont suffisants pour des biopsies endoscopiques.
    4. Observez au microscope après 15 minutes pour vérifier le statut de dissociation. Si des fragments de tissu subsistent, poursuivez la digestion jusqu’à un maximum de 30 minutes.
    5. Lorsque des grappes sont visibles, pipettez doucement (5 à 10 fois) à l’aide d’une pipette de 10 mL pour dissocier mécaniquement. Centrifugez à 350 × g pendant 5 minutes.
    6. Jetez le surnageant ; resuspendez le granule dans 10 mL de solution de lavage et centrifugez à 350 × g pendant 5 minutes. Répétez le lavage deux fois.
      REMARQUE : Les PDTO commencent généralement à former des structures sphériques compactes entre 3 et 5 jours après la culture. Les organoïdes ont montré une prolifération robuste et ont atteint une taille adaptée à l’expérimentation (environ 100 à 200 μm de diamètre) entre le 10e et le 14e jour. Le passage était effectué tous les 7 à 10 jours pour maintenir une croissance saine et prévenir la surconfluence ou la nécrose centrale. En général, un tampon de digestion de 8 à 10 mL est utilisé par biopsie (fragments de 2 mm³), garantissant un TrypLE Express à une concentration de travail finale de 1×.

2. Construction des PDTO

  1. Incorporation matricielle
    1. Placez 200 μL de BMM (pré-refroidi à 4 °C) dans un tube propre et pipetez la pelote de la cellule au moins 10 à 15 fois à l’aide d’une pointe de pipette pré-refroidie jusqu’à ce que la suspension paraisse homogène, sans amas visibles.
    2. Distribuez environ 30 μL de gouttelettes dans chaque puits d’une plaque à 24 puits. Écouver à 37 °C pendant 10 minutes pour solidifier.
    3. Ajoutez 500 μL de milieu de culture organoïde (milieu avancé DMEM/F12, contenant 50 μg/mL de R-spondine 1, 10 μg/mL de Noggin, 500 μg/mL d’EGF, 100x HEPES, 100x Glutamax, 500x Normocine, 500x Gentamicine/amphotéricine B, 50x N2, 100x B27, 500 mM n-acétylcystéine, 1 M Niacinamide, 5 mM inhibiteur Alk 4/5/7, 30 M inhibiteur p38, 100 μM Gastrin, et 100 μM de prostaglandine E2) par puits.
      REMARQUE : Utilisez environ 30 μL de BMM par gouttelette ; ajustez en fonction de la densité cellulaire.
  2. Entretien de la culture
    1. Culture des organoïdes à 37 °C avec 5 % deCO-2 ; Change de médium tous les 3 jours.
    2. Surveillez quotidiennement la formation des organoïdes. Attendez-vous à de petits sphéroïdes au troisième jour.
    3. Évaluer l’établissement réussi de l’organoïde entre les jours 6 et 10. Le temps de formation (entre 3 et 14 jours) dépend de la viabilité et de la tige des tissus.

3. Passage des PDTO

  1. Désagrégation
    1. Pré-refroidissez la centrifugeuse à 4°C. Retirez le médium et ajoutez 1 mL de HBSS bien froid et pipettez doucement 3 à 5 fois pour perturber le BMM.
      REMARQUE : Les organoïdes bien développés peuvent être observés à l’œil nu sous forme de petits points blancs.
    2. Transférez la suspension dans un tube stérile de 15 mL et centrifugez à 350 × g pendant 5 minutes.
  2. Dissociation enzymatique
    1. Jetez le surnageant et ajoutez 1 mL de TrypLE. Placez dans un bain-marie à 37 °C pendant 2 minutes.
    2. Ajouter 2 mL de HBSS pour neutraliser le TrypLE ; Centrifuge à 350 × g pendant 5 minutes.
    3. Retirez le surnageant et remettez 2 mL de HBSS. Centrifuge à nouveau à 350 × g pendant 5 minutes.
  3. Re-plongement
    1. Ajouter du BMM frais au pellet dans un ratio de 1:3-1:6 (granule organoïde : BMM, v/v) ; Suspendez-le doucement. Chaque gouttelette contient environ 30 μL de volume final. Placer des gouttelettes dans une nouvelle plaque à 24 puits ; Incubez à 37 °C pendant 10 minutes.
    2. Ajoutez 500 μL de milieu de culture par puits et incubez à 37 °C avec 5 % deCO2.
    3. Examinez les puits quotidiennement ; observez un réassemblage 3D en environ 48 heures.
    4. Après 3 à 5 passages, sélectionnez des organoïdes sains pour des analyses en aval ou la cryopréservation.

4. Co-culture des cellules CAR-T et des PDTO

  1. Préparation du milieu de co-culture
    1. Compléter le milieu de culture organoïde de base avec 10 ng/L d’IL-2 et 0,05 mM de β-mercaptoéthanol pour soutenir la viabilité du CAR-T.
      REMARQUE : Le support de base prend en charge la structure 3D et la viabilité des PDTO.
  2. Préparation de l’EDTO
    1. Retirez les gouttelettes de BMM contenant des PDTO matures (par exemple, jours 4-6) de la plaque de culture à l’aide d’un grattoir à cellules stériles ou d’une pointe de pipette.
    2. Transférez le mélange BMM/PDTO dans un tube conique de 15 mL.
    3. Ajoutez 5 à 10 mL de HBBS glacé ou de solution de lavage en mouchoir (comme décrit à l’étape 1.1.2) dans le tube. Inversez doucement 5 à 10 fois pour déloger les organoïdes du BMM.
    4. Laissez reposer le mélange sur la glace pendant 5 minutes. Le BMM deviendra liquide, tandis que les PDTO dissociés resteront en suspension.
    5. Aspirez soigneusement le contenant le surnageant BMM, en laissant la pelote PDTO derrière lui. Évitez de déranger la pastille.
    6. Répétez les étapes 4.2.3 à 4.2.5 deux fois supplémentaires pour garantir la suppression complète de la BMM.
    7. Après le lavage final, prélever le surnageant contenant du PDTO et centrifuger à 300 × g pendant 5 minutes à 4 °C.
    8. Aspirez le surnageant et resuspendez la pelote PDTO dans 1 à 2 mL de milieu de culture organoïde ou de coculture.
    9. (Optionnel pour le comptage) Préparez une suspension monocellule.
      1. Si un comptage précis est nécessaire, transférez les organoïdes resuspendus dans un nouveau tube et incubez avec du TrypLE Express préchauffé à 37 °C pendant 3 à 5 minutes, suivi d’un pipetage doux pour obtenir une suspension unicellulaire. Procéder au comptage cellulaire (par exemple, à l’aide d’un hémocytomètre ou d’un compteur cellulaire automatisé).
        REMARQUE : Cette étape dissocier les organoïdes et n’est utilisée qu’à des fins de comptage avant le re-plaquet.
    10. Sélection de la taille et standardisation : Pour garantir une taille organoïde cohérente pour la coculture, faites passer les PDTO en suspension (de l’étape 4.2.8) à travers une tamoire de cellules de 70 μm placée sur un tube conique de 50 mL. Cette étape élimine de gros agrégats organoïdes et débris, représentant une fraction de taille standardisée adaptée à une co-culture uniforme.
    11. Centrifugez la suspension organoïde standardisée à 300 × g pendant 5 minutes à 4 °C.
    12. Aspirez le surnageant et resuspendez les PDTO standardisés dans un volume approprié de milieu de co-culture préchauffé.
    13. Comptez les PDTO standardisés (par exemple, en utilisant un hémocytomètre au microscope, en comptant le nombre d’organoïdes par champ).
      REMARQUE : Le comptage est basé sur le nombre d’organoïdes, pas sur le nombre de cellule.
    14. Semez les PDTO standardisés dans la plaque multi-puits souhaitée (par exemple, une plaque U-bottom à 96 puits) au nombre cible par puits.
    15. Ajoutez des cellules CAR-T aux puits aux rapports effecteur/cible (E :T) désirés.
  3. Étiquetage des PDTO
    1. Pré-refroidissez la centrifugeuse à 4 °C. Aspirez le milieu ; Ajoutez 1 mL de HBSS pour déloger les gouttelettes.
    2. Transférez dans un tube centrifugeuse de 15 mL, ajoutez 4 mL de HBSS, et pipettez doucement. Centrifugez à 350 × g pendant 5 minutes.
    3. Jetez le surnageant, ajoutez 5 mL de HBSS, et pipettez doucement. Centrifugez à nouveau à 350 × g pendant 5 minutes.
    4. Préparez la solution de travail Hoechst 33342.
    5. Resuspendre le pellet dans une solution Hoechst 33342 de 1 mL (concentration finale 5 μg/mL). Mélangez doucement par inversion 3 à 5 fois pour assurer une pénétration uniforme de la teinture. Protège-toi de la lumière en enveloppant le tube dans du papier aluminium. Incubez à 37 °C pendant 10 minutes. Après la teinture, lavez-le deux fois avec du HBSS pour enlever l’excès de teinture.
  4. Plaquage des PDTO
    1. Estimer la densité organoïde avec un rapport gouttelettes/puits de gel de 1:5 ; resuspendre dans un milieu de coculture à environ 1 × 103 organoïdes/mL.
    2. Ajouter 100 μL par puits dans une plaque à 96 puits ; inclure au moins triplicates par condition.
      REMARQUE : Ne faites pas de comptage cellulaire à ce stade ; les organoïdes restent intacts.
  5. Co-culture CAR-T
    REMARQUE : Ce protocole se concentre sur la co-culture et l’évaluation de l’efficacité des cellules CAR-T avec les PDTO. La génération et la caractérisation des cellules CAR-T utilisées dans cette étude sont décrites à la Section 8.
    1. Prélève les cellules CAR-T en phase logarithmique. Colorez avec du bleu de Trypan pour confirmer la viabilité >95 %.
    2. Centrifugeuse à 350 × g pendant 5 minutes ; Reposer dans un milieu de co-culture.
    3. Ajustez les concentrations à 4 × 106/mL, 2 × 106/mL, et 1 × 106/mL.
    4. Ajouter 100 μL de suspension CAR-T par puits selon la conception expérimentale. Ajoutez 100 μL de milieu de co-culture pour contrôler les puits.
    5. Incubez la plaque à 37 °C, 5 % de CO2 pendant 6 à 24 heures.

5. Coloration des cellules mortes

  1. Coloration verte SYTOX
    1. Pour chaque 1 × 105 cellules, préparez 100 μL de solution colorante Nuclear Green en diluant 1 μL de SYTOX Green (1000x) dans 1 mL de tampon pour test.
    2. Aux moments de co-culture de 6 et 24 heures, ajoutez 100 μL de solution de coloration SYTOX Green par puits. Incubez à 37 °C pendant 20 minutes dans le noir.

6. Acquisition d’images

  1. Aspirez le surnageant et ajoutez 100 μL de DMEM/F12.
  2. Capturez des images en champ clair et en fluorescence à l’aide d’un microscope (par exemple, confocal) :
    Hoechst 33342 (PDTO) : excitation (Ex)/émission (Em) = 350 nm/461 nm
    mCherry (CAR-T) : Ex/Em = 587 nm/610 nm
    SYTOX Green (cellules mortes) : Ex/Em = 504 nm/528 nm
  3. Capturez au moins des images tripliquées par puits, en vous concentrant sur le champ central.

7. Analyse des données

  1. Lancement d’ImageJ (version 1.54, NIH, https://imagej.nih.gov/ij/) ; importez les images du canal SYTOX Green. Réglez manuellement le seuil pour distinguer les signaux de fluorescence du fond (Image > Ajustez > seuil).
  2. Utilisez la fonction Analyser > Mesurer pour calculer la densité intégrée. Exportez les données comme .csv pour une analyse statistique ultérieure dans un logiciel d’analyse statistique approprié (par exemple, GraphPad Prism).
  3. Régler un seuil pour séparer les signaux de fluorescence du fond de fond.
  4. Sélectionnez l’ensemble du champ ; exécutez Analyse > Mesure pour calculer l’intensité totale du signal de fluorescence.
  5. Exportez les données et effectuez des analyses statistiques pour comparer les traitements et les témoins à 24 heures.

8. Génération et caractérisation des cellules CAR-T

  1. Conception de la construction CAR
    REMARQUE : Les cellules CAR-T utilisées dans cette étude ciblent B7-H3 (codée par le gène CD276), un antigène fréquemment surexprimé dans le cancercolorectal 14. La construction CAR se compose de :
    Domaine extracellulaire : Un fragment variable à chaîne unique (scFv) dérivé d’un anticorps monoclonal contre le clone B7-H3 376.96.
    Domaine charnière et transmembranaire : domaine articulaire CD8α et domaine transmembranaire.
    Domaine co-stimulateur : humain CD28.
    Domaine de signalisation : CD3ζ humain.
  2. Génération de cellules CAR-T
    1. Isolation : Isolez les cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMC) des pelages buffy sains du donneur à l’aide de centrifugation14 au gradient de densité de Ficoll-Paque.
    2. Activation : Activer les PBMC humains avec des anticorps anti-CD3/CD28 liaisons plaque pendant 48 h dans des milieux à cellules T complétés avec 10 ng/mL d’IL-7 et 5 ng/mL d’IL-15. Préparez le milieu des lymphocytes T en mélangeant des volumes égaux (250 mL chacun) de RPMI 1640 et de Click’s Media, et complétés avec 10 % de sérum bovin fœtal (FBS), 1x GlutaMAX, et 1 % de pénicilline-streptomycine (Pen/Streptococique).
    3. Transduction : Transduire les lymphocytes T activés avec un surnageant rétroviral à l’aide d’une plaque recouverte de rétronectine comme décritprécédemment 15.
    4. Expansion : Prélèvement et culture des lymphocytes T 3 jours après la transduction dans un milieu complet de cellules T humaines contenant IL-7 et IL-15 pendant 7 à 9 jours supplémentaires avant la caractérisation et les tests fonctionnels.
  3. Caractérisation des cellules CAR-T
    1. Expression CAR : Évaluer l’expression de CAR 5 à 7 jours après la transduction par cytométrie en flux à l’aide d’une protéine B7-H3-Fc recombinante, suivie d’un anticorps secondaire marqué fluorescentement contre Fc14 humain. L’efficacité typique de transduction (cellules CAR+) varie de 80 % à 90 %.
    2. Phénotype : Caractérisez les sous-ensembles des lymphocytes T (par exemple, CD4+, CD8+, etc.) par cytométrie en flux à l’aide d’anticorps contre CD3, CD4, CD8, CD45RA, CCR7, etc.14.
    3. Validation fonctionnelle (pré-co-culture optionnelle) : Avant les expériences de co-culture, validez fonctionnellement les cellules CAR-T en co-cultivant avec des lignées cellulaires cibles B7-H3 et B7-H3 négatives et en mesurant la libération de cytokines (par exemple, IFN-γ par ELISA) ou la cytotoxicité (par exemple, en utilisant la cytométrieen flux 15).
  4. Préparation à la co-culture (Analyse PDTO)
    1. Utilisez les cellules CAR-T pour la co-culture pendant leur expansion en phase logarithmique (généralement entre les 10 et 14 jours après l’activation). Avant utilisation, lavez les cellules deux fois avec du HBSS pour retirer l’IL-7/IL-15 et resuspendez-les dans le milieu de co-culture décrit à l’étape 4.1.
    2. Confirmez la viabilité à >95 % en utilisant une coloration Trypan Blue.
    3. Points de contrôle visuels : Vérifiez la présence de petits amas sphériques (50-100 μm) aux jours 3-5 et des sphéroïdes matures (100-200 μm) aux jours 10-14.

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Résultats

Les organoïdes du cancer colorectal ont été prélevés avec succès à partir d’échantillons de biopsie endoscopique (Figure 1), l’identité tumorale ayant été confirmée par un diagnostic pathologique (Figure 2). Les fragments tumoraux cultivés dans le BMM ont commencé à former des structures 3D en moins de 24 heures. Les organoïdes de première génération (P0) ont été utilisés entre les jours 7 et 14. Les organoïdes présentaient des ...

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Discussion

Cet article présente une méthode pour évaluer l’effet cytotoxique des cellules CAR-T sur les PDTO, combinant imagerie en champ clair et coloration fluorescente pour évaluer la viabilité organoïde. Cette approche bimodale permet une visualisation robuste de la mort cellulaire tumorale dans un système modèle 3D et fournit une évaluation semi-quantitative de la cytotoxicité CAR-T.

Un composant critique de ce protocole est le milieu de culture. Parce que les cellu...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent ne pas avoir de conflit d’intérêts.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par le Programme national clé de recherche et développement de Chine (2022YFC2304400, 2022YFC2304401), le projet Science et Technologie du système médical et de santé de Nanshan (NSZD2024046, NS2024105) et le Fonds de recherche médicale de Shenzhen (D2401023).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Tube de 15 mLSAINING3030100
Plaque à 24 puitsCORNING3524
Tube de 50 mLSAINING3030000
Plaque à 96 puitsCORNING3599
DMEM avancé/F12GibcoC11330500BT
Inhibiteur d’Alk 4/5/7MCEHY-10432  ;
B27Gibco17504044
Armoire de biosécurité (Classe II)Thermo FisherN/A
Albumine sérique bovineSigma AldrichA9056
Plat de culture cellulaireBIOFILTCD010060
CentrifugeuseEppendorf5810R
Médium de ClickFUJI FILM9195
Incubateur à CO2YamataIP610
Colaganase IISolarbioC8150
Colagnase IVSigma AldrichC9407
Microscope laser confocalZeissLSM900
Milieu cryoconservateurZENOAQCELLBANKERTM2
Tampon de digestionRéactifs préparés en interneN/AComposition fournie dans le manuscrit
Shaker numériqueMIULABHS-25
Dispase type IISigma-aldrichD4693
DMEMGibcoC11995500BT
Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28Thermo Fisher11131D
EGFPeproTechAF-100-15-500UG
Sérum bovin fœtalGibco1631389
GastrinGlpBioGA20228
Gānamicine/amphotérítine BGibcoR0151
GlutamaxGibco35050061
La solution équilibrée de sel de HanksGibcoC14175500BT
HEPESGibco15630080
Hoechst 33342  ;BeyotimeC1027
HyaluronidaseSolarbioH8030
IL-15Peprotech200-15-10UG
IL-2NovoprotéineCK24-10
IL-7Peprotech200-07-10UG
ImageJNIH (open source)https://imagej.nih.gov/ij/
Inversé  ; Microscope fluorescentMshotMF52-N
MatrigelCorning356231
N2Gibco17502048
n-acétylcystéineSigma AldrichA7250-5G
NiacinamideSigma AldrichN0636-100G
NogginPeproTech120-10C-20
NormocineInvivoGenANT-NR-1
Milieu de culture organoïdeRéactifs préparés en interneN/AComposition fournie dans le manuscrit
Inhibiteur de P38MCEHY-10295  ;
Pénicilline-StreptomieGibco15140122
Prostaglandine E2MCEHY-101952  ;
Inhibiteur de kinase associée à la Rho & nbsp ;Cellules souches72304
RPMI 1640HyCloneSH30809.01B
R-spondin 1PeproTech120-38-20UG
Remplissages pour pipettes S1Thermo Scientific9501
Pipette sérologiqueBIOFILGSP-010-050
Pipette à canal uniqueEppendorf3123000063
Pipette à canal uniqueEppendorf3123000055
Pipette à canal uniqueEppendorf3123000098
Pipette à canal uniqueEppendorf3123000022
Scalpels jetables stérilesTech-SSSD10
SYTOX GreenBeyotimeC1181S
TexMACS MoyenMiltenyi Biotec130-097-196
Réservoir d’eau du thermostatBluepardBWS-10
Bleu de TrypanPhygenePH0519
TrypLE ExpressGibco12605028
&beta ;-mercaptoéthanolGibco21985023

Références

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Criblage de cellules CAR TOrgano des tridimensionnelsOrgano des d riv s de patientsCo culture d organo des immunitairesOrgano des de cancer colorectalMatrice de membrane basaleMarquage des cellules mortesActivit antitumoraleEssai de cytotoxicit

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