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Un cadre génomique stratifié pour la prédiction du sérotype de Salmonella : évaluation de MLST, SeqSero, SeqSero2, SeqSero2S et SISTR dans le sud-ouest de la Chine

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DOI :

10.3791/69117

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9 janvier 2026

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1West China School of Public Health and West China Fourth Hospital, Sichuan University, 2College of Pharmacy, Youjiang Medical University for Nationalities, 3Chengdu Center for Disease Control and Prevention (Chengdu Institute of Health Supervision), 4Sichuan Provincial Centre for Disease Control and Prevention, 5Department of Laboratory Medicine and Port Epidemic Disease Monitoring Key Laboratory of Sichuan Province, Sichuan International Travel and Healthcare Center (Chengdu Customs District Port Clinic), 6Health Promotion and Food Nutrition & Safety Key Laboratory of Sichuan Province, 7Innovation Center of Nursing Research and Nursing Key Laboratory of Sichuan Province, West China Hospital, Sichuan University

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Ce protocole établit un flux de travail génomique stratifié pour la prédiction des sérotypes de Salmonella , utilisant MLST ou SeqSero2S pour la surveillance de routine, SISTR avec le génome central MLST pour la détection des épidémies, et SeqSero2S pour le dépistage rapide. Le protocole a été validé par une analyse multicentrique afin d’améliorer la surveillance en Chine.

Résumé

Un sérotypage précis de Salmonella est essentiel pour une surveillance efficace et une enquête sur les épidémies, car la diversité sérotypée impacte directement la pathogénicité et l’évaluation des risques pour la santé publique. Cependant, les méthodes conventionnelles d’agglutination par lames sont limitées par une faible reproductibilité, une faible intensité de travail et des coûts élevés, ce qui entrave leur application dans des programmes de surveillance à haut débit. Pour répondre à ces limitations, nous avons développé et validé un flux de travail génomique intégrant le typage de séquences multilocus (MLST), la ressource de typage Salmonella In Silico (SISTR), SeqSero, SeqSero2 et SeqSero2S pour la prédiction des sérotypes à partir de données de séquençage du génome entier. Ce protocole a été évalué à travers une analyse multicentrique de 315 isolats de Salmonella collectés dans des sources alimentaires et humaines du sud-ouest de la Chine. Les résultats de cette étude ont démontré une concordance significativement plus élevée entre les approches génomiques (jusqu’à 100 %/99,1 %/90,1 % dans l’ensemble d’entraînement et 100 %/97,1 %/93,1 % dans le jeu de validation pour SISTR/MLST/SeqSero2S, respectivement) par rapport au sérotypage traditionnel. Le flux de travail inclut des recommandations pour sélectionner des méthodes de prédiction appropriées basées sur le contexte de surveillance, en mettant l’accent sur MLST et SeqSero2S pour le suivi de routine, SeqSero2S pour le dépistage rapide, et SISTR avec le génome central MLST pour les enquêtes sur les épidémies. Cette approche facilite l’intégration du sérotypage génomique dans la pratique de la santé publique, réduisant la dépendance à la sérologie traditionnelle et améliorant la reproductibilité et la scalabilité dans les programmes de surveillance de la salmonelle .

Introduction

La salmonelle est l’un des agents pathogènes d’origine alimentaire les plus importants au monde, provoquant une morbidité et une mortalité importantes 1,2. En Chine, elle reste une cause majeure de maladies d’origine alimentaire, avec un nombre limité de sérotypes responsables de la majorité desinfections 3. Une identification précise des sérotypes est cruciale pour la surveillance et les enquêtes sur les épidémies, car la diversité sérotypale est étroitement corrélée à la pathogenicité et aux risques pour la santé publique. Cela est bien reconnu chez les sérotypes courants tels que Salmonella enteritidis et Salmonella typhimurium, mais certains sérotypes moins étudiés, comme Salmonella Panama, sont également une cause importante de propagation mondiale et de maladiesinvasives 4, soulignant le besoin général de capacités robustes de sérotypage. Les méthodes traditionnelles de sérotypage, longtemps reconnues comme la référence d’or, sont des procédés longs et coûteux qui nécessitent plus de 150antisérums 5. Elles sont en outre limitées par une faible reproductibilité6, des flux de travaillaborieux 7, et une variabilité inhérente due à une interprétation subjective des réactionsd’agglutination 8, les rendant ainsi inadéquates pour les programmes de surveillance à haut débit9.

L’avènement du séquençage du génome entier (WGS) a transformé la caractérisation des agents pathogènes en permettant une prédiction rapide et à haute résolution des sérotypes 10,11,12. Plusieurs outils in silico ont été développés, notamment le Multilocus Sequence Typing (MLST), SeqSero13, SeqSero214, SeqSero2S15, et le Salmonella In Silico Typing Resource (SISTR)7,15. Alors que le MLST propose un suivi épidémiologique standardiséet à long terme 16, SeqSero2 et SeqSero2S permettent une analyse directe à partir de lectures brutes et facilitent un dépistage à haut débit des sérotypescommuns 14,15. Inversement, SISTR nécessite des génomes assemblés mais intègre la détection des gènes antigéniques avec le typage multilocus du génome central (cgMLST), offrant une résolution complète pour les enquêtes sur lesépidémies 17. Bien que la caractérisation de Salmonella basée sur le WGS soit de plus en plus adoptée comme preuve principale dans les recherches16, 18, 19, son application en surveillance à grande échelle reste limitée, un écart en partie attribué à des considérations pratiques non abordées qui influencent la pertinence des méthodes. Une enquête mondiale a révélé que seulement 8 % des laboratoires participants utilisent WGS pour la surveillance de routine, la complexité analytique étant un obstaclemajeur 20. Par exemple, une prédiction fiable des sérotypes repose sur une profondeur de séquençage adéquate (généralement >75× pour la rentabilité, idéalement ~200× pour une analyse de haute qualité) et des assemblages génomiques de haute qualité (N50 de contigs > 30 kbp comme minimum rentable, de préférence >100 kbp), en particulier pour des outils dépendants de l’assemblage commeSISTR 21, 22, 23. De plus, le choix des outils doit s’aligner sur les ressources et l’expertise informatiques du laboratoire : des outils open source comme SeqSero2S offrent des alternatives plus rapides pour un criblage rapide en analysant les lectures brutes et en contournant l’assemblage15, qui est très intensif en calcul, tandis que les laboratoires à capacité limitée en bioinformatique peuvent avoir des difficultés d’analyse et de stockage des données. Par conséquent, il n’existe pas suffisamment de données pour déterminer si les tests sérologiques peuvent être réduits lors de la surveillance à grandeéchelle 20,24, ce qui souligne la nécessité d’approches adaptatives aux ressources. Notamment, après la pandémie de COVID-19, il existe une quantité importante d’instruments de séquençage inactif et de qPCR à différents niveaux d’établissements de santé, offrant une opportunité de réutiliser cette capacité pour la surveillance génomique.

Pour combler cette lacune, nous avons réalisé une évaluation multicentrique des outils de sérotypage génomique mentionnés ci-dessus en utilisant 315 isolats de Salmonella collectés à partir de sources alimentaires et humaines dusud-ouest de la Chine 25,26. Sur la base de ces résultats, nous avons développé un flux de travail stratifié qui tient compte des ressources de laboratoire et des besoins de surveillance variés, fournissant des critères clairs pour le choix des outils dans différents contextes. Ce cadre privilégie SeqSero2S pour le dépistage rapide et SISTR combiné avec cgMLST pour les enquêtes sur les épidémies, facilitant ainsi l’adoption d’approches génomiques et réduisant la dépendance aux méthodes traditionnelles de sérotypage. Ici, nous décrivons chaque étape du flux de travail en détail, y compris l’identification des isolats, le séquençage, l’analyse des données et les critères de sélection des outils de prédiction dans différents contextes de surveillance.

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Protocole

La collecte et la manipulation des échantillons fécaux humains ont été réalisées sous l’approbation du Comité d’éthique du Quatrième Hôpital de Chine de l’Ouest de l’Université du Sichuan (Numéro de protocole : HXSY-EC-2022093), conformément à la Déclaration d’Helsinki et aux bonnes pratiques cliniques. Le consentement éclairé a été renoncé conformément aux règlements nationaux de santé publique.

REMARQUE : Toutes les procédures impliquant des cultures vivantes de Salmonella et des échantillons fécaux humains doivent être réalisées dans un laboratoire de biosécurité de niveau 2 (BSL-2) par du personnel formé aux pratiques microbiologiques standard et aux procédures de biosécurité. Portez en permanence un équipement de protection individuelle (EPI) approprié, y compris une blouse de laboratoire, des gants et des lunettes de sécurité. Désinfectez et changez régulièrement les gants contaminés. Décontaminez toutes les surfaces de travail avant et après les expériences avec un désinfectant approprié (par exemple, 70 % d’éthanol, 1 % d’hypochlorite de sodium). Décontaminez tous les déchets liquides et solides contenant des matières biologiques par autoclavage (par exemple, à 121 °C pendant au moins 30 minutes) avant leur élimination. Évitez la génération d’aérosols et d’éclaboussures. Effectuer toutes les procédures pouvant créer des aérosols (par exemple, centrifugation, secouement vigoureux) à l’intérieur d’une armoire de sécurité biologique certifiée.

1. Collecte d’échantillons alimentaires et identification des souches

  1. Prélevez des échantillons alimentaires sur les marchés de détail ou les installations de transformation. Isoler la salmonelle à partir d’échantillons alimentaires conformément à la norme nationale de sécurité alimentaire GB 4789.4 et aux protocoles de confidentialité du Programme de surveillance des maladies transmissibles aux aliments.
  2. Pré-enrichissement :
    1. Pèse exactement 25 g de chaque échantillon alimentaire. Ajoutez 225 mL d’eau peptone tamponnée (BPW) à l’échantillon (rapport de dilution 1:10) et un vortex pendant 30 s pour assurer une homogénéisation complète et une immersion.
    2. Incubez l’échantillon en BPW à 36°C ± 1°C pendant 8 à 18 heures dans un incubateur secouant réglé à 150 tr/min.
      REMARQUE : L’enrichissement préalable dans un bouillon non sélectif augmente significativement la charge en agents pathogènes. Manipulez tous les matériaux suivants (contenants, pipettes, etc.) comme étant hautement infectieux.
  3. Enrichissement sélectif : Après le pré-enrichissement, transférez 1 mL de l’échantillon dans un bouillon tétrathionate (TTB). Incubez le TTB à 42 °C pendant 18 à 24 heures sans secousse.
  4. Isolement : Après l’incubation, rayez la culture enrichie sur les plaques d’agar sélectif suivantes : agar Hektoen Enteric (HE), Agar Xylose Lysine Désoxycholate (XLD) et CHROMagar Salmonella. Incubez les plaques à 36 °C pendant 18 à 24 heures.
    REMARQUE : Lorsque vous striez les plaques, soyez prudent pour éviter la création d’aérosols et la contamination croisée. Sur l’agar HE, les colonies présumées de Salmonella apparaissent généralement de couleur bleu-vert à bleu, avec ou sans centres noirs. L’agar environnant peut prendre une teinte verdâtre similaire. Sur l’agar XLD, les colonies présumées de Salmonella sont généralement rouges avec des centres noirs. Sur CHROMagar, les colonies présumées de Salmonella se caractérisent par leur couleur magenta à mauvave, selon les spécifiations du fabricant. Sur chaque plaque sélective, attendez-vous à des colonies bien isolées après 18 à 24 heures d’incubation. Les plaques envahissantes (>300 colonies) peuvent nécessiter une dilution et une nouvelle strie.
  5. Identification : Examinez les plaques pour détecter des colonies suspectes de Salmonella . Identifier les souches suspectes à l’aide d’un système d’identification automatisé muni d’une carte d’identification Gram-négatif (GN), en suivant les instructions du fabricant pour l’analyse.
    REMARQUE : Assurez-vous que les numéros de lot des cartes GN sont valides et respectent la date d’expiration.
    1. Préparez une suspension bactérienne à partir d’une colonie pure à la turbidité spécifiée (0,50-0,63 selon la norme McFarland) en utilisant une solution saline à 0,45 %.
    2. Chargez la suspension dans la carte GN et effectuez le test. Assurez-vous que le système est réglé pour incuber automatiquement la carte à 35,0 °C ± 2,0 °C et surveillez les réactions biochimiques pendant jusqu’à 8 heures.
    3. Acceptez un résultat de Salmonella enterica ssp. enterica avec une probabilité ≥ de 95 % et un taux de confiance excellent .
  6. Sérotypage : Prélever des colonies individuelles de la plaque d’agar en essaim après incubation nocturne à 37 °C. Effectuer des tests d’agglutination sur lames pour détecter les antigènes O et H. Utilisez des kits antisérum contre la salmonelle disponibles dans le commerce (voir Tableau des matériaux) pour les tests.

2. Collecte d’échantillons humains et identification des souches

REMARQUE : Pour l’isolement de Salmonella à partir d’échantillons fécaux humains, suivez les protocoles de confidentialité du Programme de surveillance des maladies transmissibles aux aliments.

  1. Collecte : Prélever environ 2 g d’échantillons de matières fécales humaines fraîchement vidées. Placez les échantillons fécaux dans des récipients propres, secs et à large bouche. Transportez les échantillons fécaux au laboratoire dans un délai d'1 h à l’aide de boîtes de transport isolées pour maintenir l’intégrité de l’échantillon.
    ATTENTION : Les échantillons fécaux humains peuvent contenir plusieurs agents pathogènes au-delà de la salmonelle. Manipuler tous les échantillons comme potentiellement infectieux et respecter les précautions standard pour la manipulation des matériaux biohazard.
  2. Inoculation : Inoculez les échantillons fécaux collectés directement sur les plaques d’agar sélectives suivantes : CHROMagar Salmonella, agar Salmonella-XLD et agar Shigella (SS).
    REMARQUE : Veuillez consulter l’étape 1.4 pour la morphologie caractéristique de la colonie sur CHROMagar Salmonella et XLD agar. Sur le SS agar, les colonies présumées de Salmonella apparaissent généralement incolores, opaques ou fauves avec des centres noirs. L’agar lui-même reste relativement inchangé.
  3. Identification : Identifier les colonies suspectées de Salmonella comme décrit à l’étape 1.5.
  4. Sérotypage : Effectuer le sérotypage par agglutination par diapositive, comme décrit à l’étape 1.6.

3. Préparation de la bibliothèque et séquençage du génome complet

  1. Culture bactérienne : Strie Salmonella sur agar LB, incuber à 37 °C pendant 12 heures. Choisissez une colonie, inoculez dans un bouillon de 200 mL LB, puis agitez à 150 tr/min (37 °C, 12 heures). Centrifugez à 12 000 × g pendant 10 minutes pour récolter les cellules.
    REMARQUE : Effectuez toutes les étapes de centrifugation avec des rotors ou des gobelets de sécurité scellés pour éviter la génération d’aérosols.
  2. Extraction d’ADN : Extraire l’ADN génomique à l’aide d’un kit d’extraction d’ADN commercial (voir Tableau des matériaux), en suivant le protocole du fabricant.
    ATTENTION : Les réactifs des kits d’extraction d’ADN commerciaux (par exemple, tampons de lyse, protéinase K) peuvent être nocifs s’ils sont inhalés ou au contact de la peau et des yeux. Effectuer l’extraction dans une hotte ou un armoire de sécurité biologique si des réactifs volatils sont utilisés, et porter l’EPI approprié.
  3. Évaluation de la qualité de l’ADN : Purifiez l’ADN génomique et quantifiez à l’aide d’un fluoromètre avec le kit de test à haute sensibilité dsDNA. Vérifier l’intégrité de l’ADN par électrophorèse sur un gel d’agarose à 1 % à 100 V pendant 45 minutes ; l’ADN de haute qualité apparaît sous forme d’une seule bande compacte >20 kbp avec un flou minimalde 27.
    REMARQUE : (Étape critique) Un ADN génomique de haute qualité et de haut poids moléculaire (avec un rapport A260/A280 de ~1,8-2,0) est crucial pour une préparation et un séquençage réussis des bibliothèques.
    ATTENTION : Les colorants d’acides nucléiques utilisés dans l’électrophorèse sur gel d’agarose (par exemple, GelRed, bromure d’ethidium) sont mutagèniques. Portez toujours des gants lors de la manipulation des gels et des solutions de tache, et jetez-les conformément à la réglementation institutionnelle sur les déchets dangereux.
  4. Fragmentation de l’ADN : fragmenter environ 150 ng d’ADN génomique qualifié à une taille moyenne de ~350 pb à l’aide d’un système d’ultrasonication ciblée selon le protocole du fabricant.
  5. Construisez la bibliothèque de séquençage à partir des fragments d’ADN cisaillés à l’aide d’un kit de préparation de bibliothèque commercial (voir Tableau des matériaux). Effectuer la réparation terminale et la phosphorylation 5'des fragments d’ADN cisaillés. Ensuite, ajoutez une base en 'A' aux extrémités 3', et liguez les adaptateurs de séquençage indexés.
  6. Amplifier et enrichir les fragments d’ADN ligés par l’adaptateur via un programme PCR à cycle limité tel que spécifié dans le kit.
  7. Qualifiez et quantifiez la bibliothèque finale en utilisant des méthodes telles que la fluorométrie et l’électrophorèse capillaire.
  8. Effectuer le séquençage en binôme (2 × 150 pb) sur une plateforme de séquençage en suivant les procédures opérationnelles standard.

4. Analyse des données

  1. Contrôle qualité des données brutes de séquençage : effectuer un contrôle qualité initial sur les fichiers bruts FASTQ en utilisant fastp (version 0.23.0) avec les paramètres par défaut. L’objectif est de supprimer les séquences d’adaptateurs et les lectures de faible qualité, générant ainsi des données FASTQ propres pour une analyse en amont.
  2. Assemblez les lectures filtrées de haute qualité dans des génomes brouillons à l’aide de SPAdes (version 3.15.0) avec l’option soigneuse pour réduire les incompatibilités et les indèlescourtes 26.
  3. Utilisez les séquences du génome (fichiers FASTQ / FASTA) comme entrée pour la prédiction des différents sérotypes.
    1. Pour MLST, importez le fichier FASTQ dans le logiciel BioNumerics (version 7.6).
      1. Dans la fenêtre Import Template , cliquez sur Modifier l’analyse syntaxique sous options avancées. Réglez la chaîne d’analyse et la décoration de données sur [DATA]. Appliquer les expressions régulières DATA]_* et [DATA] pour l’analyse des noms de fichiers. Enregistrez le modèle, sélectionnez-le, puis cliquez sur Suivant puis sur Terminer. Confirmez la soumission dans la fenêtre Soumettre une tâche pour téléverser les données. L’outil CEStoreUploader s’ouvre automatiquement pour transférer les données brutes WGS vers le moteur de calcul.
      2. Sélectionnez l’entrée du génome après le téléchargement. Naviguez dans les outils WGS et sélectionnez « TraNetGenotype » pour une prédiction automatique des ST. Dans la boîte de dialogue TraNetGenotype , sélectionnez Salmonella comme type de souche, sélectionnez Analyse sérotype, Analyse de virulence et Analyse de la susceptibilité antimicrobienne, puis cliquez Oui.
    2. Pour SISTR (version 1.1.3 ; https://github.com/phac-nml/sistr_cmd ; Paramètres : tous les paramètres sont par défaut), ouvrez un terminal et naviguez jusqu’au répertoire contenant le fichier génomique assemblé assembly.fasta.
      1. Exécutez la commande suivante pour effectuer la prédiction du sérodar et générer un rapport complet au format CSV : sistr --qc --alleles-output allele-results.json --cgmlst-profiles cgmlst-profiles.csv -f tab -o sistr-output.tab -i assembly.fasta. Cette commande génère un rapport contenant le sérovaire prédit.
        REMARQUE : -qc : Effectue des contrôles de contrôle qualité sur l’assemblage. -i assembly.fasta : Spécifie le fichier FASTA d’entrée. -f csv : Définit le format de sortie comme CSV. -o sistr_results : Définit le nom de base du fichier de sortie (par exemple, sistr_results.csv). -p 4 : Utilise 4 threads CPU pour l’analyse afin d’accélérer le calcul. --alleles-output : enregistre les séquences et informations d’allèles dans un fichier JSON. --cgmlst-profiles : exporte les profils allèles cgMLST vers un fichier CSV.
    3. Pour SeqSero (version 1.0 ; https://github.com/denglab/SeqSero ; Paramètres : tous les paramètres sont par défaut), naviguez vers le répertoire contenant le fichier de données d’entrée. Exécutez la commande suivante avec les paramètres par défaut pour l’analyse : python SeqSero.py -m 4 -i assembly.fasta. L’outil crée un répertoire de sortie contenant le fichier Seqsero_result.txt avec le sérotype prédit.
      REMARQUE : -m 4 spécifie le type d’entrée comme assemblage du génome. -i définit le fichier FASTA d’entrée.
    4. Pour SeqSero2 (version 1.3.1 ; https://github.com/denglab/SeqSero2 ; Paramètres : tous les paramètres sont par défaut). Exécutez la commande suivante : python3 SeqSero2_package.py -m k -t 4 -i assembly.fasta. L’outil envoie le sérotype prédit directement à l’écran terminal une fois terminé. La sortie fournit le sérotype prédit.
      REMARQUE : -m k : spécifie un flux de travail basé sur k-mer pour la prédiction rapide des sérotypes en utilisant des k-mers uniques des déterminants sérotypes. -T 4 : indique le type d’entrée sous forme de séquences assemblées.
    5. Pour SeqSero2S (version 1.1.1 ; https://github.com/denglab/SeqSero2S ; Paramètres : tous les paramètres sont par défaut) : exécutez-le en utilisant le script fourni : python SeqSero2S.py -m k -t 4 -i assembly.fasta. La sortie fournit le sérotype prédit.
      REMARQUE : -m k permet une analyse basée sur k-mer des lectures brutes ou des assemblages génomiques. -t 4 spécifie l’entrée de séquence assemblée.

5. Paramètres critiques et considérations pratiques

REMARQUE : Les considérations suivantes sont cruciales pour la mise en œuvre réussie de ce flux de travail génomique, en particulier dans des contextes à ressources limitées.

  1. Vérifiez que les données brutes de séquençage atteignent une profondeur de couverture suffisante. Une profondeur de séquençage d’environ 100x est généralement suffisante pour une analyse de haute qualité.
    REMARQUE : Pour les laboratoires qui privilégient la rentabilité, une profondeur minimale de séquençage de 75x est recommandée comme un seuil pratique inférieur pour une prédiction sérotype fiable en utilisant MLST ou SeqSero221.
  2. Confirmez que la qualité des lectures brutes est élevée, avec un score Q30 (précision de base des appels de 99,9 %) généralement supérieure à 90 %.
  3. Évaluez la qualité de l’assemblage de nouveau du génome avant de passer aux outils de prédiction sérotypique nécessitant des contenus assemblés. Utilisez la statistique N50 comme indicateur clé.
    REMARQUE : Un N50 d’au moins 100 kbp est recommandé22, tandis qu’un N50 supérieur à 30 kbp doit être considéré comme l’exigence minimale pour une analysefiable 23.
  4. Vérifiez l’exhaustivité de l’assemblage en garantissant un taux de lecture d’au moins ≥98 % lorsque les lectures filtrées sont mappées vers le génome assemblé.

6. Protocole recommandé de prédiction des sérotypes pour la surveillance à haut débit de salmonelle

REMARQUE : Sélectionnez les méthodes de prédiction des sérotypes en fonction du contexte de surveillance, de la précision requise et des ressources de laboratoire disponibles. Pour une surveillance à haut débit de Salmonella , suivez le protocole ci-dessous :

  1. Identification préliminaire : Effectuer un dépistage initial conformément à la norme GB 4789.4 pour confirmer les isolats comme étant des espèces de Salmonella .
    REMARQUE : À ce stade, il n’est pas nécessaire d’identifier le sérotype spécifique des isolats.
  2. Surveillance de routine (mode à haut débit) : Pour la surveillance de routine, puisque BioNumerics n’est plus mis à jour, utilisez MLST28, SeqSero2S ou d’autres plateformes d’analyse génomique validées et conviviales qui bénéficient d’un support technique continu et de mises à jour.
    REMARQUE : Pour MLST : Le schéma à 7 gènes offre un profil standardisé, portable et phylogénétiquement informatif (Type de séquence, ST) idéal pour l’épidémiologie à long terme et la comparaison mondiale des souches. Sa simplicité garantit une analyse rapide et une charge de calcul minimale. Pour SeqSero2S : il offre le double avantage de la prédiction rapide des sérotypes et des résultats MLST intégrés en une seule exécution. Il peut analyser directement les lectures de séquençage brut, contournant l’assemblage du génome pour économiser du temps et des ressources. Même avec des données FASTA assemblées, il est plus rapide que des outils comme SISTR, car il effectue la prédiction des sérotypes de manière indépendante sans recourir à l’analyse computationnelle.
  3. Dépistage rapide (contextes sensibles au temps) : Pour des résultats rapides ou en laboratoire à capacité de calcul limitée, utilisez SeqSero2S pour la prédiction préliminaire du sérotype.
    REMARQUE : Lors des prédictions de SeqSero2S, il est essentiellement recommandé d’interpréter « I_4,[5],12 :i :- » comme Salmonella Typhimurium.
  4. Investigation de l’épidémie (mode haute précision) : Pour le traçage des épidémies nécessitant une haute résolution, utilisez SISTR, qui utilise cgMLST pour compléter la prédiction sérotype et fournir une analyse de cluster haute résolution pour le traçage des sources.
  5. Contrôle qualité et confirmation des résultats incohérents :
    1. Pour les souches de type séquençage courantes, effectuer une vérification aléatoire. Pour les cas non courants, utilisez un ratio de vérification de 20 %. En cas de résultats de sérotypage incohérents, référez les isolats à un laboratoire de niveau supérieur ou de référence pour un résultat définitif.
    2. Pour l’analyse confirmatoire, utiliser plusieurs méthodes validées, notamment : une analyse génomique répétée avec au moins deux outils de prédiction in silico différents ; répété en silico avec au moins deux outils différents ; contextualisation phylogénétique à l’aide de méthodes à haute résolution basées sur WGS (par exemple, cgMLST ou analyse SNP du génome entier)29.
    3. Attribuez le sérotype final sur la base du consensus issu de ces preuves complètes.
      REMARQUE : Le ratio de vérification recommandé de 20 % pour les sérotypes non courants est basé sur l’observation que les outils génomiques maintiennent une forte concordance (93,3 % pour SISTR vs. MLST, 95,0 % pour SISTR vs. SeqSero2S) même parmi les sérotypes non courants (Tableau 1). Ce seuil est rentable et offre une marge de sécurité suffisante pour détecter la faible fréquence des divergences entre les outils génomiques lors de la surveillance de routine.

7. Analyse statistique

  1. Effectuer l’analyse des données à l’aide du logiciel R (version 4.1.2).
  2. Présenter les variables catégorielles comme des fréquences avec des pourcentages.
  3. Comparez les groupes utilisant les tests χ2 pour les données catégorielles30, considérons une valeur P <0,05 comme statistiquement significative.

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Résultats

Le protocole a été validé à l’aide de 315 isolats de Salmonella du sud-ouest de la Chine, dont 213 isolats (2/3) ont servi d’ensemble d’entraînement pour comparer cinq méthodes de prédiction des sérotypes basées sur WGS (MLST, SISTR, SeqSero, SeqSero2 et SeqSero2S) avec les résultats conventionnels du sérotypage, tandis que les 102 isolats restants (1/3) ont servi d’ensemble de validation pour évaluer les performances de MLST, SISTR et SeqSero2S.

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Discussion

Cette évaluation à grande échelle, englobant 315 isolats de Salmonella du sud-ouest de la Chine, démontre la reproductibilité supérieure des méthodes de sérotypage basées sur le SGS par rapport aux approches conventionnelles (84,1 % contre 62,9 % de couverture, P<0,001). Nos résultats valident un flux de travail génomique complet où les étapes initiales critiques de la préparation des échantillons et du contrôle de la qualité de l’ADN (sections 1 à 3) impactent directement la fi...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par des subventions du Tibet and Sichuan Science and Technology Bureau (XZ202301ZY0049G 2024NSFSC0563 à H.Z. et 2024NSFSC0033 à X.P.), du programme de science et technologie du Sichuan (2024JDRC0032 à Y.X.), du projet de l’Institut de santé sur la nouvelle productivité (HN240302C à H.Z.), du projet de revitalisation disciplinaire des sciences de laboratoire de santé publique (2023SY-04 à H.Z.), École de santé publique de Chine de l’Ouest / Quatrième Hôpital de Chine de l’Ouest, Université du Sichuan.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
BioNumerics (version 7.6)Mathématiques appliquéeshttps://bionumerics.software.informer.com/7.6/MLST/prédiction sérotype/analyse phylogénique
CHROMagar SalmonellaBecton, Dickinson and Company214983Milieu chromogénique sélectif pour Salmonella
Fastp (version 0.23.0)Open sourcehttps://github.com/OpenGene/fastpLire le contrôle qualité
Système de séquençage Illumina NovaSeq 6000Illumina20012850Plateforme de séquençage du génome complet
Ultrasonicateur focalisé M220Covaris500295Cisaillement de l’ADN
Kit d’ADN rapide Magbeads pour solMP BiomédicalsMP116560200Kit d’extraction d’ADN génomique
Microsoft Excel 2016MicrosoftKB5002794Gestion des données
NEXTFLEX Rapid DNA-Seq KitRevvity50-255-1124Préparation des bibliothèques de séquençage
Fluoromètre Qubit 2.0Thermo Fisher ScientificQ32866Quantification de l’ADN
Kit de test à haute sensibilité Qubit dsDNAThermo Fisher ScientificQ32851Quantification de l’ADN
R (version 4.1.2)Fondation Rhttps://www.r-project.org/Calcul statistique
Kit antisérum contre la salmonelleInstitut du sérum Statens60898Détection de l’antigène O/H
SeqSeroOpen sourcehttps://github.com/denglab/SeqSeroPrédiction sérotype
SeqSero2Open sourcehttps://github.com/denglab/SeqSero2Prédiction sérotype
SeqSero2SOpen sourcehttps://github.com/denglab/SeqSero2sPrédiction sérotype
SISTROpen sourcehttps://github.com/phac-nml/sistr_cmdPrédiction sérotype
SPAdes (version 3.15.0)Open sourcehttps://github.com/ablab/spadesAssemblage du génome
Agar en essaimBD Biosciences211519Utilisé pour le sérotypage, l’incubation
TBS-380 FluoromètreTurner BioSystemsP/N 3800-003Quantification de l’ADN
Système compact VITEK 2BioMé ; rieux95061-768Système automatisé d’identification microbienne

Références

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