Production efficace de lymphocytes T du récepteur chimérique de l’antigène (CAR) avec des transgènes dépassant 10 kb à l’aide de vecteurs lentiviraux

Résumé

Ici, nous présentons un flux de travail optimisé pour produire des lymphocytes T du récepteur chimérique des antigènes (CAR) avec de grands transgènes dépassant 10 kb en utilisant des vecteurs lentiviraux.

Résumé

L’intégration de multiples récepteurs dans les lymphocytes T du récepteur chimérique des antigènes (CAR) s’est imposée comme une stratégie puissante pour prévenir la rechute antigène-négative et réduire la toxicité sur cible ou hors tumeur. Cependant, la fabrication de cellules CAR T multi-récepteurs reste un défi, car augmenter la taille des transgènes lentiviraux réduit significativement les titres viraux et les taux de transduction des lymphocytes T. Les flux de production actuels reposent souvent sur le tri cellulaire pour enrichir les cellules T transduites à partir de productions à faible rendement. Cependant, les techniques de tri cellulaire n’augmentent pas le nombre absolu de cellules CAR T et n’ajoutent pas de complexité supplémentaire au processus de fabrication déjà complexe. Par conséquent, ces limitations entravent la traduction clinique des cellules CAR T multi-récepteurs et restreignent le développement d’immunothérapies de nouvelle génération.

Ici, nous présentons un flux de production détaillé, étape par étape, optimisé pour générer des cellules CAR T avec de grands transgènes lentiviraux. Grâce à ce flux de travail, nous démontrons des augmentations de l’efficacité de transduction dépendantes de la taille sur une gamme de tailles de transgènes, avec l’amélioration la plus marquée allant jusqu’à 14,8 fois observée pour un vecteur lentiviral de 10,1 kb. Il est important de noter que le flux de travail soutient une expansion robuste des cellules T et élimine le besoin de tri des cellules. En surmontant les limites de taille actuelles dans le transfert de gènes lentiviraux, ce flux de travail permet la génération efficace de cellules CAR T multi-récepteurs, facilitant ainsi le développement d’immunothérapies avancées.

Introduction

Les lymphocytes T du récepteur antigénique chimérique (CAR) ont révolutionné le domaine de l’immunothérapie. Cependant, malgré leur succès remarquable, des défis cruciaux subsistent, notamment l’immunosuppression médiée par le microenvironnement tumoral (TME), les rechutes tumorales antigènes négatives et les toxicités sur cible/hors^{tumeur 1,2}. L’ingénierie des cellules CAR T avec plusieurs récepteurs synthétiques, tels que les doubles CAR, les constructions combinées de CAR et TCR, ou les récepteurs à commutateur de cytokines, a le potentiel de surmonter ces^{obstacles 3,4}. Dans les cancers du sang, équiper les lymphocytes effecteurs T de doubles CARs permet de cibler simultanément deux antigènes distincts, tels que CD19 et CD20⁵, réduisant ainsi le risque de fuite d’antigènes tumoraux. Dans les tumeurs solides, les toxicités sur cible ou hors tumeur peuvent être atténuées en incorporant, par exemple, des circuits synthétiques de récepteurs Notch (synNotch) qui permettent une expression logique de CAR et améliorent la précision^{de ciblage} 6,7,8,9,10,11,12,13 . Cependant, la production de cellules CAR T portant plusieurs récepteurs reste difficile en raison de l’augmentation sous-jacente de la taille du transgène. Les vecteurs lentiviraux de troisième génération auto-inactivants dérivés du virus de l’immunodéficience humaine (VIH) de type 1 constituent la référence actuelle pour la production de cellules CAR T à l’échelle^{de recherche et clinique 14}. Pour générer des cellules CAR T, les vecteurs lentiviraux sont conçus avec des cassettes d’expression CAR personnalisées, flanquées de séquences de répétition terminale longue (LTR), qui assurent l’intégration dans le génome des cellules T. La capacité maximale d’emballage effective (EPC) des vecteurs lentiviraux actuels est d’environ 9,2 kilobases (kb) de LTR à LTR, correspondant à la taille du génome natif du VIH-1. À mesure que les titres lentiviraux diminuent semi-logarithmiquement avec l’augmentation de la longueur du^{vecteur 15}, l’ingénierie de grands transgènes avec plusieurs récepteurs réduit drastiquement les rendements de production lentivirale et finit par entraver la fabrication des cellules CAR^{T 16}. Bien que les techniques de tri cellulaire, telles que le tri cellulaire activé par magnétique ou fluorescence (MACS ou FACS, respectivement), puissent être utilisées pour enrichir les cellules T CAR à partir de productions à faible rendement, ces méthodes n’augmentent pas le nombre absolu de cellules T CAR et n’ajoutent pas de complexité supplémentaire à un processus de fabrication déjà complexe. En conséquence, les défis de fabrication des cellules CAR T avec de grands transgènes lentiviraux restent un obstacle majeur tant à la recherche préclinique qu’à l’application clinique.

Nous avons récemment mis en place un flux de travail de production des cellules CAR T optimisé pour les lymphocytes T effecteurs portant de grands transgènes lentiviraux, tels que le système synNotch (svsNotch) à vecteur^{unique 17}. Ici, nous détaillons la méthodologie dans un protocole étape par étape pour faciliter son adoption large. À titre de preuve de concept, nous démontrons des améliorations dépendantes de la taille de l’efficacité de la transduction sur des tailles de transgènes lentiviraux allant de 5,7 kb à 9,2 kb et 10,1 kb. Dans l’ensemble, ce flux de travail optimisé améliore les taux de transduction jusqu’à 14,8 fois, éliminant ainsi le besoin de tri cellulaire et permettant la génération efficace de lymphocytes T effecteurs dont la taille des transgènes dépasse 10 kb.

Protocole

Les lymphocytes T humains ont été obtenus via le Core d’immunologie humaine de l’Université de Pennsylvanie, qui fonctionne selon les principes des bonnes pratiques de laboratoire avec des procédures opérationnelles standard établies et/ou des protocoles pour la réception, le traitement, la congélation et l’analyse des échantillons, conformes aux directives éthiques de MIATA et de l’Université de Pennsylvanie.

REMARQUE : Un aperçu schématique du flux de travail optimisé pour la production de lentivirus et de cellules CAR T est présenté à la Figure 1. Une comparaison des étapes clés d’optimisation avec le flux de travail standard actuel est résumée dans le tableau 1. Toutes les cultures cellulaires ont été maintenues à 37 °C dans un incubateur humidifié avec 5 % de_CO2 à l’aide d’un milieu à cellules T (MTC) composé de RPMI-1640 complété avec 10 % de sérum fœtal inactivé par la chaleur (FBS), 10 mM de tampon HEPES, 2 mM de L-alanyl-L-glutamine (voir Tableau des matériaux), 100 U/mL de pénicilline et 100 U/mL de streptomycine.

Figure 1 : Flux de travail optimisé pour la production de lentivirus et de cellules CAR T avec de grands transgènes. Représentation schématique de la production de lentivirus (en haut) et de la génération de cellules CAR T (en bas), mettant en évidence les étapes clés et les optimisations qui améliorent les titres viraux et l’efficacité de la transduction. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

		Flux de travail standard	Flux de travail optimisé
Virus	Enveloppe virale	VSV-G	Cocal-G
	Transfection	L2000	L30001
	Récolte de la Légende	24h 2 + 48h 2	30-36 h3
T-lymphocyte	Navire	Flasque T25	Plaque plate à fond plat à 96 puits
	Rapport surface/volume	Variable	5,12 cm2/mL4
	Adjuvant	Aucun	SF1085
13 μL L3000 par 1 μg d’ADN, aucun changement de milieu
2centrifugation à 106 800 x g pour 2,5 h, tube à fond rond
3centrifugation à 12 300 x g pendant la nuit, tube à fond conique
4Supplémentation supplémentaire de milieux après transduction
555 μg/mL

Tableau 1 : Comparaison des flux de travail standards et optimisés. Optimisations clés du flux de travail amélioré par rapport au flux de travail standard actuel. Ce tableau a été adapté avec la permission de Rommel et ^al.17.

1. Production de lentivirus

1. Maintien des cellules HEK293T
   1. Assurez-vous que HEK293T cellules sont réparties uniformément, exemptes de grappes et à une confluence de 50-70 % (rendement typique : 1,0-1,5 × 10⁷ cellules par flasque T150).
   2. Aspirez le surnageant, ajoutez 20 mL de PBS à température ambiante (RT) sur le dessus de la fiole pour éviter de déloger les cellules, faites doucement tourner le PBS sur les cellules, puis aspirez le lavage.
   3. Ajoutez 3 mL de Trypsine-EDTA à 0,05 % et incubez pendant 15 à 30 secondes en RT tout en inclinant la fiole de gauche à droite. Surveillez le détachement de cellule.
   4. Ajoutez 7 mL de MTC froide, resuspendez les cellules contre le fond de la fiole pour générer une suspension monocellule, puis transférez dans un tube de 50 mL. Lavez la fiole avec 10-20 mL de TCM froid et ajoutez le lavis dans le même tube.
   5. Centrifugez les cellules (300 × g, 5 min, 4 °C), aspirez le surnageant, resuspendez dans 10 mL de MTC, puis comptez les cellules.
   6. Placez les cellules HEK293T dans les flasques T150 à 3 × 10,⁶ cellules par flasque pour le passage tous les 2 jours (par exemple, lundi et mercredi) ou à 1 × 10,⁶ cellules par flasque pour le passage tous les 3 jours (par exemple, plaque le vendredi pour le passage le week-end) en utilisant 30 mL de MTC préchauffé à 37 °C.
2. Transfection des cellules HEK293T pour la production de lentivirus
   REMARQUE : Effectuez une petite expérience pilote pour déterminer la densité d’ensemencement qui donne systématiquement une confluence de 70 à 80 % après 2 jours. Assurez-vous que HEK293T confluence cellulaire ne dépasse pas 80 % au moment de la transfection (voir Discussion). La transfection a été optimisée à l’aide d’un médium essentiel minimal à sérum réduit et de réactifs commerciaux pour lipofection (L3000 et P3000, voir Tableau des matériaux).
   1. Prélever HEK293T cellules par trypsinisation comme décrit ci-dessus et plaquer 4 × 10⁶ cellules par flasque T150 avec 30 mL de MTC préchauffés à 37 °C.
   2. Après 2 jours, confirmez que les cultures sont réparties uniformément et confluentes à 70-80 %.
   3. Réchauffez 50 mL de médium essentiel minimum sérique à RT. Décongelez les plasmides lentiviraux, mélangez doucement et faites une rotation rapide. Utilisez des réactifs de lipofection vortex pulsés, faites un effet rapide, et laissez-les à RT.
   4. Préparez des mixages maîtres ADN. Pour chaque flasque, combinez dans cet ordre : 2 mL de milieu essentiel minimal sérique réduit, 39 μg de plasmides d’emballage lentiviral (18 μg de pTRP Gag-Pol, 18 μg de pTRP RSV-Rev, 3 μg de pTRP Cocal-G), 15 μg de plasmide de transfert et 108 μL de réactif P3000 (2 μL d’ADN P3000/μg). Augmentez l’échelle selon les besoins et augmentez les montants finaux d’au moins 10 % pour compenser les pertes liées à la pipette. Vortex pulsé, rotation rapide, et stockage chez RT.
   5. Préparez des mixages maîtres L3000. Pour chaque flasque, combinez dans cet ordre : 1,84 mL de milieu essentiel minimum sérique réduit et 162 μL de L3000 (3 μL d’ADN L3000/μg). Augmentez l’échelle selon les besoins et augmentez les montants finaux d’au moins 10 % pour compenser les pertes liées à la pipette. Vortex pulsé, rotation rapide, et incubation en RT pendant 5 minutes.
   6. Après 5 minutes, ajoutez 2 mL de mélange maître L3000 par flacon au mélange master ADN correspondant pour obtenir une dilution approximative de 1:2. Ajoutez lentement le mélange L3000 en partant du fond du tube sans toucher ses côtés. Mélangez soigneusement en pipettant et incubez 15 minutes à la RT.
   7. En attendant, retirez soigneusement 6 mL de surnageant de chaque culture HEK293T et étiquetez chaque flasque.
   8. Après 15 minutes, transfecter chaque culture en inclinant la fiole vers le haut et en libérant lentement 4 mL de mélange de transfection dans le surnageant situé sur la face supérieure de la fiole pour éviter de déloger les cellules. Pippette lentement deux fois vers le haut/bas, remets la fiole à sa position d’origine, fais-la doucement tourner, remets-la dans l’incubateur et note le temps.
      REMARQUE : Laissez les cultures intactes jusqu’à la récolte du lentivirus. Contrairement à la recommandation du fabricant de remplacer le surnageant HEK293T contenant le mélange de transfection L3000 par un milieu de culture frais après la^{transfection 18}, omettre cette étape permet de préserver des titres lentiviraux plus^{élevés 17}.
3. Prélèvement, concentration et congélation des surnatants lentiviraux
   REMARQUE : Conservez les surnatants lentiviraux sur la glace ou à 4 °C lors de toutes les étapes de traitement pour éviter leur dégradation.
   ATTENTION : Les vecteurs lentiviraux sont classés comme matières infectieuses. Respectez les précautions de biosécurité appropriées, notamment l’utilisation d’équipements de protection individuelle (par exemple, gants doubles, blouses jetables). Décontaminez toutes les surfaces de travail avec de l’eau de Javel à 10 % suivie d’un éthanol à 70 %. Désinfectez les consommables contaminés et les déchets liquides avec 10 % d’eau de Javel avant leur élimination comme déchets bio-dangereux, conformément aux directives institutionnelles de biosécurité.
   1. Nettoyez l’équipement d’ultracentrifuge (seaux, tubes coniques et adaptateurs coniques) avec de l’eau de Javel à 10 %, puis rinçez à l’eau. Séchage rapide à l’air, puis pulvérisé à 70 % d’éthanol et séchage à l’air libre sous une hotte de culture tissulaire.
   2. Pré-refroidissez l’ultracentrifuge avec le rotor inséré à 4 °C.
   3. Prélever les surnadants lentiviraux 30 à 36 heures après la transfection en les transférant dans des tubes de 50 mL. Clarifiez les surnatants par centrifugation (500 × g, 5 min, 4 °C), filtrez à travers un filtre à pores de 0,45 μm, puis conservez sur glace.
   4. Insérez des adaptateurs coniques dans les seaux, transférez les surnatants filtrés dans des ultracentrifugeuses coniques, puis chargez-les dans les seaux. Équilibrez les seaux opposés avec du TCM froid, en veillant à ce que les différences de poids restent inférieures à 0,1 g.
   5. Concentrez les surnadants par ultracentrifugation à 12 300 × g pendant la nuit à 4 °C.
   6. Le lendemain matin, retirez soigneusement les seaux et conservez-les sur la glace.
   7. Préparez une boîte avec de la glace sèche pour la congélation et des cryovials marqués pour l’aliquotation.
   8. Sous une hotte de culture tissulaire, ouvrez chaque seau et retirez le tube d’ultracentrifuge à l’intérieur avec une pince. Pour chaque tube, procédez comme suit :
   9. Aspirez soigneusement le surnageant jusqu’à 0,5 pouce du fond du tube et décantez le liquide restant dans une plaque à 6 puits. Tapotez doucement le tube pour enlever un peu de liquide résiduel.
   10. Ajoutez 300 μL de MTC froide, resuspendez doucement pendant 30 secondes, puis transférez la suspension sur un cryovial.
   11. Lavez le tube avec 200 μL de TCM froid et ajoutez le lavis au même cryovial.
   12. Mélangez doucement et aliquotez 60 μL pour le titrage des lentivirus (voir étape 1.4), plusieurs aliquotes de 100 μL pour la production de cellules CAR T, et un tube supplémentaire avec le volume restant comme reste. Congelez immédiatement les aliquotes sur de la glace sèche. Transférer les aliquotes à -80 °C pour un stockage à long terme.
4. Titrage du lentivirus concentré utilisant les lymphocytes T primaires
   REMARQUE : Environ 1 × 10⁵ Les lymphocytes T sont nécessaires par dilution par lentivirus. Par exemple, six lentivirus avec huit dilutions chacun nécessitent : 6 × 8 × 1 × 10⁵ = 4,8 × 10⁶ Les lymphocytes T. Des cellules supplémentaires doivent être préparées pour compenser la perte par pipetage. Les lymphocytes T sont stimulés à l’aide de billes d’activation magnétiques recouvertes d’anticorps anti-CD3 et anti-CD28 (voir Tableau des matériaux).
   1. Activation des lymphocytes T (jour 0)
      1. Prérequis : Garder les cellules T humaines purifiées CD4⁺ et CD8⁺ en MTC prêtes.
      2. Comptez les cellules T CD4⁺ et CD8⁺ et combinez-les à un ratio 1:1.
      3. Lavez les billes d’activation comme suit : ajouter 1 mL de MTC dans un tube, resuspendre les billes par vortex, et transférer la quantité requise pour obtenir un ratio de 3 pour 1 entre billes et cellules T. Placez le tube dans un support magnétique et laissez les billes former une boule le long de la paroi du tube. Après 30 s, aspirez soigneusement le surnageant, retirez le tube du support magnétique, puis resuspendez les billes dans 1 mL de MTC. Répétez le lavage deux fois de plus.
      4. Ajoutez des billes d’activation aux lymphocytes T et ajustez la concentration finale à 1 × 10⁶ cellules/mL avec la MTC préchauffée à 37 °C.
      5. Mélangez bien et transférez la suspension dans un réservoir de réactif. Cellules de plaques dans des plaques à fond plat à 96 puits avec 100 μL de MTC par puits utilisant une pipette multicanal. Mélangez soigneusement toutes les 1 à 2 minutes pour éviter que les perles ne se déposent.
   2. Transduction des lymphocytes T (jour 1)
      REMARQUE : Pour les lentivirus à transgènes importants (par exemple, 9 kb de LTR à LTR), préparez 6 conditions en utilisant des dilutions sérieuses 1:2 (non diluées, 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32). Pour les lentivirus avec des transgènes plus petits (par exemple, 7 kb de LTR à LTR), 8 conditions avec des dilutions sérielles 1:4 sont requises. Utilisez les puits restants comme témoins non transduits (UTD).
      1. Décongelez 60 μL de chaque lentivirus concentré à la RT et stockez sur glace.
      2. Préparez une série de dilution dans une plaque à fond arrondi à 96 puits : ajoutez 60 μL de lentivirus à la rangée supérieure, ajoutez 30 μL de MTC froide à chaque rangée en dessous, transférez 30 μL du haut vers la deuxième rangée et mélangez (dilution 1:2), transférez 30 μL de la deuxième à la troisième rangée et mélangez (dilution 1:4). Continuez jusqu’à ce que six conditions soient préparées au total (non diluées, 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32). Utilisez immédiatement pour la transduction.
      3. Entre 23 et 26 heures après la stimulation par biles, transduire les lymphocytes T avec 25 μL par puits de lentivirus depuis la plaque de dilution à l’aide d’une pipette multicanal. Ajoutez 25 μL de MTC aux puits de contrôle UTD.
   3. Alimentation par cellules T (jour 3)
      1. Ajoutez doucement 125 μL de MTC préchauffé à 37 °C dans chaque puits à l’aide d’une pipette multicanal.
   4. Débloquage des cellules T et analyse de cytométrie en flux (jour 5)
      1. Préparez trois ensembles de tubes à bouchons à vis de 1,5 mL pour chaque condition et retirez les couvercles. Placez deux des trois ensembles dans un support magnétique.
      2. Resuspendez chaque puits et transférez les cellules dans le premier ensemble de tubes pour permettre aux billes de former une boule le long de la paroi du tube. Après 30 s, transférez soigneusement les surnatants dans le second jeu de tubes. Attendez 30 secondes (les billes ne devraient plus être visibles), puis transférez les surnatants dans le troisième ensemble de tubes et conservez-les sur glace.
      3. Colorez les lymphocytes T pour le marqueur de transduction approprié (par exemple, anti-CD19 CAR ou anti-HER2 synNotch) avec des anticorps (voir Tableau des matériaux) et analysez l’expression des marqueurs par cytométrie en flux.
      4. Identifier les conditions avec des taux de transduction inférieurs à 30 %, correspondant approximativement à la plage linéaire entre le volume du virus et le taux de transduction.
      5. Calculez les titres lentiviraux à l’aide de la formule suivante :
         Titre (TU/mL) = (nombre initial de lymphocytes T x pourcentage de cellules transduites x facteur de dilution)/volume viral (mL)
         par exemple, une expression CAR à 20 % avec une dilution 1:32 du stock lentiviral :
         (100 000 cellules x 0,2 x 32) / (0,025 mL) = 2,56 × 10⁷ TU/mL

2. Production de cellules T CAR

REMARQUE : Les quantités de départ typiques pour la production de cellules T CAR sont de 1 à 5 × 10^{cellules T 6} par groupe. Augmenter de 50 % le nombre de cellules dans le groupe témoin UTD, car ce groupe sera également utilisé pour normaliser les niveaux de transduction dans les expériences en aval. Attendez-vous à 5 à 6 doublements de population tout au long de l’extension. La transduction des lymphocytes T a été optimisée en utilisant un copolymère en bloc comme amplificateur ( voir Tableau des matériaux) et avec des rapports de culture surface/volume spécifiques dans des plaques à fond plat à 96^{puits 17}.

1. Préparation d’une solution d’amélioration de 100 mg/mL
   1. Ajoutez 5 g d’améliorateur de copolymère dans une bouteille en plastique, puis ajoutez 45 mL d’eau ultrapure. Remuez toute la nuit à RT.
   2. Transférez la solution dans un cylindre gradué et ajustez le volume à 50 mL avec de l’eau ultrapure.
   3. Filtrez la solution à travers un filtre à pores de 0,22 μm et conservez-la à 4 °C.
2. Activation des lymphocytes T (jour 0)
   1. Prérequis : Garder les cellules T humaines purifiées CD4⁺ et CD8⁺ en MTC prêtes.
   2. Comptez les cellules T CD4⁺ et CD8⁺ et combinez-les à un ratio 1:1.
   3. Lavez les billes d’activation comme suit.
      1. Ajoutez 1 mL de MTC à un tube, resuspendez les billes par vortex, et transférez la quantité nécessaire pour obtenir un ratio de 3 pour 1 entre les billes et les cellules T. Placez le tube dans un support magnétique et laissez les billes former une boule le long de la paroi du tube.
      2. Après 30 s, aspirez soigneusement le surnageant, retirez le tube du support magnétique, puis resuspendez les billes dans 1 mL de MTC. Répétez le lavage deux fois de plus.
   4. Ajoutez des billes d’activation aux lymphocytes T et ajustez la concentration finale à 1 × 10⁶ cellules/mL avec la MTC préchauffée à 37 °C.
   5. Mélangez bien et transférez la suspension dans un réservoir de réactif. Cellules de plaques dans des plaques à fond plat à 96 puits avec 50 μL de MTC par puits utilisant une pipette multicanal. Mélangez soigneusement toutes les 1 à 2 minutes pour éviter que les perles ne se déposent.
3. Transduction des lymphocytes T (jour 1)
   REMARQUE : Sélectionnez les quantités de lentivirus en fonction des résultats de la titration préalable, afin de garantir que les niveaux finaux de transduction sont comparables entre les groupes (généralement entre 20 % et 30 %). Pour éviter les multiples intégrations lentivirales, maintenez des niveaux maximaux de transduction ≤ 30 %. Les lentivirus à transgènes volumineux nécessitent généralement soit un virus non dilué, soit une dilution 1:4-1:8. Ajustez la taille des groupes pour éviter les restes de lentivirus, car chaque cycle de gel-dégel réduit les titres lentiviraux. Utilisez des mélanges maîtres lentiviraux immédiatement après la préparation.
   1. Décongelez les quantités requises de lentivirus concentré à RT et conservez sur glace.
   2. Préparez un stock de travail d’un amplificateur de 2 mg/mL dans la MTC froide en mélangeant, par exemple, 100 μL d’amplificateur (100 mg/mL) avec 4,9 mL de MTC.
   3. Préparez des mélanges maîtres de lentivirus en fonction des résultats de titration et ajoutez un amplificateur à une concentration finale de 275 μg/mL. Augmentez les volumes finaux d’au moins 10 % pour compenser la perte par pipetage. Par exemple, pour obtenir une dilution 1:16 avec 100 puits :
      Volume total : 100 puits × 12,5 μL de lentivirus × 110 % = 1 375 μL
      1:16 dilution : 1 375 μL/ 16 = 85,9 μL de lentivirus
      Amplificateur : 189 μL (275 μg/mL final)
      Mélange final master : 1 100 μL de MTC + 85,9 μL de lentivirus + 189 μL d’amplificateur = 1 375 μL
   4. Entre 23 et 26 heures après la stimulation par biles, transduit les lymphocytes T avec 12,5 μL par puits de mélange maître de lentivirus à l’aide d’une pipette multicanal, ce qui donne une concentration finale d’amélioration de 55 μg/mL. Ajoutez 12,5 μL de MTC aux puits de contrôle UTD.
4. Alimentation par cellules T (jour 3)
   1. Ajoutez doucement 125 μL de MTC préchauffé à 37 °C dans chaque puits à l’aide d’une pipette multicanal.
5. Dégradation des cellules T (jour 5)
   REMARQUE : Préparez un réservoir stérile et trois ensembles de tubes de 50 mL pour chaque culture. Limitez le volume total de lavage à ≤ 20 % du volume de culture des lymphocytes T afin d’éviter de diluer les cellules en dessous de 8 × 10⁵ cellules/mL.
   1. Concentrez chaque culture dans un réservoir stérile à l’aide d’une pipette multicanal, lavez les plaques d’origine avec du TCM, puis ajoutez le lavage au réservoir. Transférez chaque suspension de cellules dans le premier ensemble de tubes de 50 mL.
   2. Placez les tubes dans un support magnétique pour permettre aux billes de former une boule le long de la paroi du tube. Après 30 s, transférez soigneusement les surnatants dans le second ensemble de tubes et placez-les dans le support magnétique. Attendez 30 secondes (les billes ne devraient plus être visibles), puis transférez les surnatants dans le troisième ensemble de tubes et stockez-les dans l’incubateur.
   3. Comptez chaque culture et normalisez à 8 × 10⁵ cellules/mL avec la MTC préchauffée à 37 °C. Placez dans le récipient de culture approprié selon le volume final (Tableau 2).
   4. Laissez les lymphocytes T se reposer pendant un jour, puis commencez les repas quotidiens à partir du 7e jour (voir étape suivante).
6. Alimentation par cellules T (jour 7 et jour après jour)
   REMARQUE : Les lymphocytes T se doublent environ toutes les 24 à 36 heures et subissent 5 à 7 doublements de population avant de se reposer. Surveillez les volumes des cellules T à l’aide d’un compteur de cellules basé sur l’impédance électrique (voir Tableau des matériaux) afin d’identifier le moment optimal pour la cryopréservation.
   1. Regroupez chaque culture, mélangez bien et comptez les cellules.
   2. Normaliser chaque culture à 8 × 10⁵ cellules/mL avec la MTC préchauffée à 37 °C, puis replacer dans le récipient de culture approprié (Tableau 2).
   3. Poursuivre l’expansion jusqu’à ce que le volume moyen de la cellule tombe en dessous de 320^{μm 3}, puis passer à l’étape de cryopréservation.
7. Validation de la transduction des lymphocytes T à l’aide de la cytométrie en flux
   REMARQUE : La transduction des lymphocytes T peut être évaluée à tout moment entre le jour 5 et le jour de la cryopréservation. Les niveaux d’expression diminueront au cours de l’expansion afin qu’une mesure précoce assure une séparation claire des fractions négatives et positives lors de l’analyse par cytométrie en écoulement.
   1. Prélever 2 × 10 cellules^{T 5} de chaque culture.
   2. Colorez les lymphocytes T pour le marqueur de transduction approprié (par exemple, anti-CD19 CAR ou anti-HER2 synNotch) avec des anticorps (voir Tableau des matériaux) et analysez l’expression des marqueurs par cytométrie en flux
8. Cryoconservation des lymphocytes T (généralement entre les jours 10 et 12)
   REMARQUE : La cryoconservation a élargi les lymphocytes T juste avant ou après leur état de repos pour améliorer la viabilité lors de la décongélation. Un volume moyen de 320^μm3 peut servir de seuil pour la cryopréservation. Lorsque le volume cellulaire descend en dessous de 300^{μm 3}, les lymphocytes T cessent de se diviser et leur nombre total commence à diminuer. Assurez-vous que tous les groupes disposent d’un volume comparable au moment de la cryopréservation, ce qui peut nécessiter une journée supplémentaire de culture pour certains groupes. Congelez les cellules à un taux constant de -1 °C par minute à l’aide de contenants de congélation appropriés (par exemple, des contenants de congélation à cellules sans alcool, voir Tableau des matériaux).
   1. Regroupez chaque culture dans un tube approprié (par exemple, 500 mL), comptez les cellules et stockez-les dans l’incubateur.
   2. Calculez le nombre total de cellules et les quantités aliquotes souhaitées.
   3. Les cellules centrifugeuses (300 × g, 10 min, 4 °C) aspirent les surnatants et remettent chaque culture en suspension dans un milieu congelant contenant 50 % de milieux sans sérum, 40 % de FBS inactivé thermiquement et 10 % de diméthylsulfoxyde (DMSO) à 2 × 10⁷ cellules/mL ( voir Tableau des matériaux).
   4. Des cellules aliquotes dans les cryoviales (250 μL à 1 mL, correspondant à 5-20 × 10⁶ cellules par fiole). Placez les cryovials dans un récipient de congélation cellulaire et conservez-les à -80 °C toute la nuit.
   5. Transférez les cryovials dans de l’azote liquide pour un stockage à long terme.
9. Dégel des lymphocytes T
   REMARQUE : Pour chaque groupe de cellules T, préparez un tube contenant 50 mL de MTC préchauffé à 37 °C afin de diluer le DMSO dans le milieu de congélation après dégel. Réchauffez plus de TCM pour le dressage.
   1. Décongelez rapidement les cryovials à 37 °C dans un bain-marie ou sous de l’eau chaude courante.
   2. Dès que le liquide est visible, passez à une hotte de culture tissulaire, ajoutez 500 μL de MTC préchauffé, mélangez doucement et transférez les cellules dans les tubes préparés contenant 50 mL de MTC.
   3. Lavez le cryovial avec 500 μL de TCM et ajoutez le lavage dans le même tube.
   4. Incubez les cellules pendant 10 minutes en temps de réanimation.
   5. Les cellules centrifugeuses (300 × g, 10 min, température ambiante), aspirent les surnatant et resuspendent les cellules à 4 × 10⁶ cellules/mL.
   6. Placez les cellules dans le vaisseau de culture approprié (Tableau 2).
   7. Faites reposer les cellules toute la nuit dans l’incubateur avant de poursuivre les expériences en aval.

Navire	Volume minimal	Volume maximal
96-puits	0,1 mL/puits*	0,25 mL/puits
48-puits	0,2 mL/puits	1 mL/puits
24-puits	0,5 mL/puits	2 mL/puits
12-puits	1 mL/puits	4 mL/puits
6-puits	2 mL/puits	6 mL/puits
T25 (horizontal)	3 mL	8 mL
T75 (horizontale)	8 mL	20 mL
T150 (horizontale)	20 mL	60 mL
* Le volume de culture est temporairement réduit à 50 μL/puits pour améliorer la transduction des lymphocytes T

Tableau 2 : Volumes recommandés de milieux de culture pour les dilatations des cellules CAR T. Volumes minimaux et maximaux de milieux de culture à travers les formats de vaisseaux couramment utilisés lors de l’expansion des cellules T.

Résultats

Pour démontrer les améliorations obtenues grâce au flux de travail optimisé (Figure 1) sur une large gamme de tailles de transgènes, nous avons sélectionné trois tailles de vecteurs lentiviraux : 5,7 kb (CD19 CAR), 9,2 kb (HER2-MSLN svsNotch) et 10,1 kb (HER2-MSLN-CBG svsNotch) (Figure 2A). Les lentivirus ont été produits soit dans des conditions standard, soit optimisées (Figure 2B : STD vs. opt et Tableau 1).

Pour le plus petit vecteur de 5,7 kb, seule une amélioration modérée de la transduction des lymphocytes T a été observée dans un lot de production (Figure 2B : haut, 73 % contre 88 % avec un virus non dilué). De manière constante, les titres lentiviraux n’ont augmenté que modestement d’environ 1,5 fois (Figure 2C : haut, 2,86 × 10⁸ TU/mL contre 4,35 × 10⁸ TU/mL). En revanche, le vecteur de 9,2 kb a montré une performance nettement améliorée, avec des taux maximaux de transduction des lymphocytes T augmentant d’environ 5,4 ou 3,8 fois selon le lot (Figure 2B : milieu, 8,3 %/16,6 % contre 45,1 %/63,1 % en utilisant le virus non dilué) et une amélioration des titres fonctionnels d’environ 3,3 fois (Figure 2C : centre ; 3,1 × 10⁶ TU/mL contre 10,1 × 10⁶ TU/mL). L’effet le plus fort a été observé avec le vecteur à 10,1 kb, où les taux de transduction ont augmenté d’environ 12,4 ou 9,8 fois (Figure 2B : bas, 1,4 %/1,5 % contre 17,3 %/14,7 % en utilisant le virus non dilué) et les titres fonctionnels se sont améliorés d’environ 10 fois (Figure 2C : fond, 0,24 × 10⁶ TU/mL contre 2,41 × 10⁶ TU/mL).

Ensuite, les lymphocytes T provenant de donneurs sains ont été transduits avec des vecteurs lentiviraux produits dans des conditions standard ou optimisées, en utilisant les flux de travail correspondants (Figure 3 et Tableau 1). Pour comparer les efficacités de la transduction, des quantités égales de lentivirus ont été utilisées dans chaque flux de travail, et la dose virale a été ajustée pour maintenir des taux de transduction à 30 % ou moins afin d’éviter plusieurs événements d’intégration. Comparé aux lymphocytes T transduits selon des conditions standard et une production standard de lentivirus, la transduction a augmenté en moyenne de 5,1 fois pour le vecteur de 5,7 kb, de 13,3 fois pour le vecteur de 9,2 kb, et de 14,8 fois pour le vecteur de 10,1 kb (Figure 3A et tableau supplémentaire 1). Les cultures de cellules T sélectionnées générées avec le flux de travail optimisé ont été étendues jusqu’à atteindre un état de repos (Figure 3B, C). Les doublements de population variaient de 5,3 à 6,7, selon le donneur de cellules T (Figure 3B). Les mesures quotidiennes du volume des lymphocytes T ont montré un minimum de débris cellulaires, n’indiquant aucun signe de toxicité lors des expansions. Avant la cryopréservation, les taux de transduction étaient évalués par coloration pour l’expression du récepteur CAR/synNotch ou par mesure de la fluorescence mTag-BFP2¹⁹ (Figure 3C et Figure supplémentaire 1). Les taux de transduction étaient de 31,2 % pour le vecteur 5,7 kb (noir ; dilution lentivirus 1:512), 29,8 % pour le vecteur 9,2 kb (rouge ; dilution lentivirus 1:16), et 20,2 % pour le vecteur 10,1 kb (bleu ; dilution lentivirus 1:4). Des données fonctionnelles supplémentaires validant la performance des lymphocytes T svsNotch et CAR T sont présentées dans notre étude^{compagnon 17}. Il est important de noter que les lymphocytes T effecteurs produits avec le protocole optimisé n’ont montré aucune différence dans les doublements de population ou le phénotype des lymphocytes T par rapport à ceux générés avec le flux de travail^{standard 17}.

Figure 2 : Production de lentivirus en suivant des flux de travail standards et optimisés. (A) Aperçu schématique des vecteurs lentiviraux avec des tailles de transgène^{correspondantes 17}. Haut : Un CAR par rapport au CD19 (CD19 CAR) est exprimé par le promoteur du facteur d’élongation humain alpha-1 (EF1α), avec une taille totale du transgène d’environ 5,7 kb. Milieu et bas : Un récepteur synNotch HER2 est co-exprimé soit avec une protéine reporter bleue-fluorescente (BFP2) (milieu) soit avec une luciférase verte de scarabée clic (CBG) (bas) via un peptide auto-cliquant 2A (P2A) par le promoteur EF1α. L’expression d’un CAR (MSLN) ciblant la mésothéline (MSLN) est contrôlée par un promoteur du cytomégalovirus minimal (CMV) spécifique à GAL4 (GAL4-CMV). Les tailles totales des transgènes sont d’environ 9,2 kb pour le svsNotch HER2-MSLN (centre) et 10,1 kb pour le svsNotch HER2-MSLN-CBG (bas). SIN = vecteur auto-inactivant ; LTR = longue séquence de répétition terminale. (B) Transduction des lymphocytes T avec des dilutions sérieuses de lentivirus générées sous des conditions standard (STD) et optimisées (opt) en utilisant les vecteurs décrits dans (A). Deux productions indépendantes (cercles et triangles) par vecteur avec deux lots chacun, et deux donneurs distincts de lymphocytes T par lot. Les taux de transduction ont été moyennés chez les donneurs de cellules T. (C) Les titres fonctionnels des productions de virus standard (std, cercles ouverts) et optimisées (opt, cercles fermés) indiqués dans (B). Les données ont été générées à partir de deux productions indépendantes de lentivirus, chacune avec deux lots, et utilisant deux donneurs distincts de cellules T par lot. Toutes les barres d’erreur indiquent la moyenne ± DS. La signification statistique a été calculée à l’aide d’un test t à deux queues par paires. *p < 0,03, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Cette figure a été adaptée avec la permission de Rommel et ^al.17. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 3 : Production de cellules T CAR avec des flux de travail standards et optimisés. (A) Multiplication des taux de transduction des lymphocytes T avec le flux de travail optimisé (opt) par rapport au flux de travail standard (std) (voir aussi Tableau S1). Les données ont été obtenues à partir de deux ou trois expansions indépendantes de lymphocytes T en utilisant des donneurs distincts et deux productions indépendantes de lentivirus. (B) Doublements de population des expansions des cellules T générés à l’aide du flux de travail optimisé. Pour chaque vecteur, deux expansions indépendantes des lymphocytes T provenant de donneurs normaux distincts (ND) sont montrées, chacune utilisant une production de lentivirus distincte. (C) Graphiques de cytométrie en flux montrant l’expression des récepteurs CAR, BFP2 et synNotch dans les lymphocytes T effecteurs élargis au jour 7 (10,1 kb) ou au jour 10 (5,7 kb et 9,2 kb) (voir aussi Figure supplémentaire 1). Toutes les barres d’erreur indiquent la moyenne ± DS. La signification statistique a été calculée à l’aide d’un test t à deux queues. *p < 0,03, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Cette figure a été adaptée avec la permission de Rommel et ^al.17. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure supplémentaire 1 : Stratégie de gating pour évaluer l’expression de CAR, récepteur synNotch et BFP2, liée à la Figure 3C. Des graphiques représentatifs de cytométrie en flux montrant la stratégie de gating utilisée pour déterminer l’expression de CAR, synNotch et BFP2 dans les cultures de lymphocytes T étendus. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Tableau complémentaire 1 : Taux de transduction à travers les expansions individuelles des lymphocytes T, en lien avec la Figure 3A. Les taux de transduction des expansions des cellules T générés grâce aux flux de travail standards et optimisés. Ce tableau a été adapté avec la permission de Rommel et ^al.17. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

Ici, nous présentons un protocole étape par étape détaillant un flux de production optimisé pour les cellules CAR T avec de grands transgènes lentiviraux, tels que les cellules T svsNotch. Ce flux de travail élimine le besoin de tri cellulaire et permet la génération efficace de lymphocytes T effecteurs portant de grands transgènes lentiviraux. Grâce à ce flux de travail, nous produisons régulièrement des lymphocytes T effecteurs avec des transgènes lentiviraux de 9-10 kb et des taux de transduction maximaux de 60-70 % (9 kb) ou 15-20 % (10 kb).

Lors du dépannage des faibles titres viraux ou des taux de transduction, plusieurs facteurs clés doivent être pris en compte. Premièrement, la qualité des cellules HEK293T. Il est important que HEK293T cellules soient traversées selon un calendrier régulier et ne puissent jamais dépasser 50-70 % de confluence. D’après notre expérience, les vecteurs lentiviraux produits à partir de cellules HEK293T auparavant envahies présentent des titres réduits, même lorsque les cellules semblent morphologiquement récupérées. Nous générons régulièrement des vecteurs viraux à haut titre en utilisant HEK293T cellules au-delà du passage 30, ce qui indique que des taux de passage plus élevés sont tolérés si les cellules sont correctement maintenues. En plus de la qualité cellulaire, la confluence des cellules de HEK293T au moment de la transfection est un facteur critique. Nous avons observé une diminution des titres lentiviraux lors de la transfection des cellules HEK293T à une forte confluence (90-100 %).

Deuxièmement, le respect strict des temps, des concentrations et des volumes spécifiés dans ce protocole est essentiel, car de nombreuses étapes ont été soigneusement optimisées lors d’une étude^{précédente 17}. Par exemple, l’amplificateur de copolymères (voir Tableau des matériaux) a été ajusté pour maximiser les taux de transduction sans toxicité détectable. Bien que des concentrations plus élevées puissent encore augmenter la transduction, elles provoquent également des toxicités et réduisent l’expansion des lymphocytes T. De même, la récolte de surnatants lentiviraux en dehors de la fenêtre recommandée de 30 à 36 heures (par exemple, à 24 h ou 48 h) a permis de produire des titres plus faibles dans une expérience temporelle^{correspondante 17}. En revanche, il n’est pas nécessaire de respecter strictement un ratio 1:1 CD4-CD8 T cellulaires, car nous n’avons pas observé de différences significatives dans l’efficacité de la transduction lors de l’utilisation de cellules T en vrac avec des distributions CD4/CD8 variables. Cependant, des écarts par rapport à ce ratio peuvent influencer la durée de l’expansion et le nombre de doublements de population. Par conséquent, nous maintenons généralement le ratio 1:1 CD4-CD8 pour assurer la cohérence entre les expériences.

Les futures initiatives d’optimisation pourraient se concentrer sur des stratégies supplémentaires pour améliorer la transduction des lymphocytes T avec des transgènes lentiviraux encore plus grands, telles que des formulations de milieux spécialisés ou des schémas de cytokines adaptés. Étendre ce flux de travail à d’autres types de cellules immunitaires, y compris les cellules tueuses naturelles et les macrophages, pourrait élargir ses applications thérapeutiques. Il est important de noter que la traduction clinique de ce flux de travail peut également contribuer à réduire les coûts de fabrication des produits de thérapie cellulaire modifiée par lentivirus.

Le protocole complet étape par étape présenté ici fournit une référence pratique pour produire des cellules CAR T avec de grands transgènes lentiviraux et pose les bases pour le développement de nouveaux cellules CAR T contre les cancers solides et sanguins.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Anticorps - VOITURE anti-CD19	Cytoart	200101	CAR anti-CD19 (idiotype), conjugué AF647, 1:100
Anticorps - anti-HER2 synNotch	R& Systèmes D	FAB95471G	Anti-Trastuzumab (idiotype), conjugué AF488, 1:80
Javel	Clorox	Javel germicide
Conteneur de congélation de cellules	Biocision	FTS30	Sans alcool
Centrifugeuse (grande)	Thermo Scientific	Legend XTR
Centrifugeuse (mini)	Fisher Scientific	Sprout Plus
Centrifugeuse (petite)	Eppendorf	5425
Compteur Coulter	Beckman Coulter	Multisizer 4	Compteur de cellules basé sur l’impédance électrique qui détermine le nombre et le volume cellulaire
Tubes cryogéniques	Thermo Scientific	375418
Diméthylsulfoxyde (DMSO)	Technologie de signalisation cellulaire	12611P
DPBS (sans calcium, sans magnésium)	Gibco	14190-136
Dynabeads (CD3/CD28)	Gibco	40203D	Billes d’activation utilisées pour la stimulation des lymphocytes T
Éthanol	Laboratoires de décontamination	200 démonstrations
FBS (inactivation thermique)	Avantor (VWR)	97068-091
Cytomètre en débit	BD	LSRFortessa (647177)
Congélateur (-80 °C ; C)	Panasonic	MDFU76VA-PA
Congélateur (azote liquide)	MVE HEco	1500-190
Frigo (4 & deg ; C)	Fisher Scientific	Isotemp
Gants (nitrile)	Drisse	55082
Supplément GlutaMAX	Gibco	35050-061	L-alanyl-L-glutamine  ;
HEPES (1 M)	Gibco	15630-080
Glace (sèche)	N.A.	N.A.
Glace (mouillée)	N.A.	N.A.
Seau à glace	Fisher Scientific	07-210-108
Blouse de laboratoire (jetable)	Kappler	PVS112WH-MD
Plasmides d’emballage lentiviral	Propriétaire	N.A.	pTRP Gag-Pol, pTRP RSV-Rev, pTRP Cocal-G
Plasmides de transfert lentiviral	Propriétaire	N.A.	par exemple pTRPE svsNotch
Réactif de transfection Lipofectamine 3000	Invitrogen	L3000015	Réactif commercial pour lipofection ; contient la lipofectamine 3000 (L3000) et son réactif améliorateur (P3000)
Pied magnétique (grand)	Stemcell	FacileSept 18103	Pour 5 mL/15 mL
Pied magnétique (petit)	Invitrogen	DynaMag-2 12321D	Pour des tubes de 1,5 mL
Barre-agitateur magnétique	Fisher Scientific	14-513-82	Kit de barre agitatrice
Plateforme magnétique de remuage	Thermo Scientific	S88857100
Cylindre de mesure (100 mL)	VWR	76019-316  ;
MQ eau	Merck	Q-POD	Eau d’ultrapue ; utilise le filtre final Millipak 40 Express, 0,22 micron (MPGP04001)
Pipette multicanal	Fisher Scientific	voir les commentaires	30-300 & micro L :  ; FBE1200300 ; 5-50 & micro ; L :  ; FBE1200050
Opti-MEM (avec L-glutamine, rouge phénol)	Gibco	31985-070	Milieu essentiel minimal à sérum réduit utilisé pour la transfection d’ADN
Pénicilline-Streptomycine (10 000 U/mL, 10 000 & micro ; g/mL)	Gibco	15140-122
Piquettes	Fisherbrand	voir les commentaires	50 mL : 13-678-11F ; 25 mL : 13-678-11 ; 10 mL : 13-678-11E ; 5 mL : 13-678-11D
Pipettes (aspirantes)	Faucon	357558	2 mL
Pipette	Gilson	PIPETMAN P10/P20/P200/P1000
Contrôleur de pipette	Hirschmann	Pipetus Z314951
Pointes de pipette	Thomas Scientific	voir les commentaires	1000 & micro ; L : 1159M42 ; 200 & micro ; L : 1159M40 ; 20 & micro ; L : 1159M43 ; 10 & micro ; L : 1159M41
Bouteille de stockage en plastique (500 mL)	Corning	430282
Réservoir de réactifs	Celltreat	3054-2007
RPMI-1640 (avec L-glutamine, rouge de phénol)	Gibco	11875-085
Échelle	Ohaus	Pionnier	Précision minimale de 0,1 g requise
Filtre Steriflip (0,45 & micro ; m)	Millipore	SE1M003M00
F 108 synperonique (SF108)	Sigma-Aldrich	07579-250G-F	Copolymère en bloc utilisé pour améliorer la transduction des cellules T
Flasque de culture tissulaire - T150	Corning	430825
Flasque de culture tissulaire - T25	Corning	430639
Flasque de culture tissulaire - T75	Corning	430641U
Hotte de culture tissulaire	Thermo Scientific	Série 1300 A2
Incubateur de culture tissulaire	Thermo Scientific	Heracell 150i
Plaque de culture tissulaire - 6 puits	Corning	3516
Plaque de culture tissulaire - fond plat à 96 puits	Faucon	353072
Plaque de culture tissulaire - fond rond à 96 puits & nbsp ;	Faucon	353077
Trypsine-EDTA (0,05 %)	Gibco	25300-054
Tubes - bouchons à vis de 1,5 ml.	Sarstedt	72692005
Tubes - 15 mL	Faucon	352099
Tubes - 5 mL	MSP	62-1028-2
Tubes - 500 mL	Corning	431123
Tubes - 50 ml	Faucon	352098
Ultracentrifuge	Beckman Coulter	Optima XPN-100
Rotor ultracentrifuge avec godets	Beckman Coulter	SW 32 Ti
Adaptateurs de tubes ultracentrifuge (pour tubes coniques)	Seton Scientific	4230
Tubes ultracentrifuges (coniques)	Seton Scientific	5067
Vortex	Fisher Scientific	02215414
Bain d’eau (37 & degré ; C)	Fisher Scientific	Isotemp 210	Utilisé avec des perles Lab Amor (Gibco) au lieu de l’eau
X-VIVO-15	Lonza	04-418Q	Milieu sans sérum utilisé pour congeler les lymphocytes T