Une méthode affinée d’administration intratrachéale de la bléomycine à base d’aérosols pour des modèles murins reproductibles et mini-invasifs de mucoviscidose pulmonaire

Résumé

Nous présentons ici un protocole pour modéliser la fibrose pulmonaire chez la souris en utilisant la bléomycine aérosolisée délivrée via la trachée. Cette méthode optimisée permet une administration uniforme, quantitative et précise sans incision chirurgicale, améliorant la reproductibilité et la fiabilité de la fibrose induite par la bléomycine.

Résumé

La fibrose pulmonaire se caractérise par un dépôt progressif de tissu cicatriciel fibrosique dans le parenchyme pulmonaire, entraînant un échange gazeux sévèrement altéré. Elle est à l’origine d’un spectre de maladies pulmonaires interstitielles chroniques, notamment la fibrose pulmonaire idiopathique, une affection associée à un pronostic extrêmement mauvais. Compte tenu du manque de thérapies efficaces, des modèles murins robustes sont essentiels pour élucider les mécanismes pathologiques sous-jacents et évaluer de nouvelles interventions antifibrotiques. La fibrose pulmonaire induite par la bléomycine reste le modèle expérimental le plus largement utilisé. Les voies d’administration courantes chez la souris incluent les injections intraveineuses et intrapéritonéales, l’instillation invasive à la trachée ouverte et le goutte-à-goutte non invasive de la trachée. Cependant, les méthodes chirurgicales invasives provoquent souvent des lésions tissulaires secondaires, ce qui peut compromettre la reproductibilité et la stabilité du modèle. Inversement, le goutte-à-goutte trachéale non invasif entraîne généralement une distribution inégale de la bléomycine sur les lobes pulmonaires et présente un risque d’asphyxie, réduisant ainsi la reproductibilité et augmentant les défis techniques. Pour remédier à ces limites, une méthode affinée de délivrance intratrachéale basée sur des aérosols est développée, plus simple sur le plan opérationnel, peu invasive, hautement reproductible et éthiquement supérieure en réduisant significativement la détresse animale. À l’aide d’un laryngoscope de petit animal pour visualiser directement la rima glottide, une aiguille aérosolisante spécialisée est insérée dans la trachée, nettement plus étroite que le diamètre trachéal de la souris. La solution de bléomycine est administrée sous une pression précisément contrôlée, générant un aérosol fin. Cela garantit une distribution uniforme et efficace de l’agent dans tout le parenchyme pulmonaire. De plus, on peut cibler sélectivement le poumon gauche ou droit en dirigeant l’aiguille vers la bronche appropriée. La relation dose-réponse de ce modèle optimisé est largement caractérisée par un suivi systématique des changements de fonction pulmonaire, des manifestations histopathologiques et de la teneur en hydroxyproline pulmonaire. Ce protocole expérimental affiné devrait faciliter la standardisation en laboratoire, accélérant finalement le développement et la validation préclinique de nouveaux traitements antifibrotiques.

Introduction

La fibrose pulmonaire (FP) est un groupe de maladies mortelles caractérisées par des lésions progressives du parenchyme pulmonaire et une réparation anormale, dont la fibrose pulmonaire idiopathique (IPF) représente entre 30 % et 40 %, l’âge médian du diagnostic étant de 65 ans, et plus de 80 % d’entre eux ayant plus de 60 ans^{de plus de 60 ans. 2}. À mesure que le vieillissement mondial s’intensifie, l’incidence de la FPI augmente d’année en année, avec une incidence mondiale de 3 à 9/100 000/an, et selon une étude menée aux États-Unis chez les personnes de plus de 65 ans, l’incidence dans cette population a grimpé à 93,7/100 000/^{an 3,4}.

Le premier modèle historiquement développé de mucoviscidose pulmonaire fut le modèle induit par la bléomycine, souvent utilisé dans le milieu universitaire, avec la meilleure caractérisation et le modèle animal le plus largement utilisé actuellement⁵, reprenant de nombreuses caractéristiques de la FPI et d’autres ILD fibrotiques, notamment l’inflammation pulmonaire, les lésions épithéliales, la prolifération des fibroblastes et le dépôt excessif de la matrice extracellulaire^{(ECM) 6}. De plus, la fibrose pulmonaire aiguë et chronique peut être modélisée selon la dose et la fréquence d’administration de la bléomycine. Il a été rapporté que les poumons entrent dans une phase inflammatoire aiguë dans les 5 à 7 jours suivant l’exposition à la bléomycine, suivie d’une phase fibrosique commençant vers le 7e jour. Au jour 21, un remodelage fibrosique prononcé est généralement observé, permettant au modèle de récapituler à la fois la réponse inflammatoire précoce et la pathologie fibrosique de stade avancé de manière définie^{temporellement 7} (Figure 1A). Cela permet d’étudier l’ensemble du processus pathologique, de la lésion initiale au stade fibreux, ce qui est très important pour le développement des médicaments et les études des mécanismes à tous les^{stades 8,9}.

Les voies de modélisation de la bléomycine sont diverses et peuvent être administrées localement ou systémiquement, y compris les voies endotrachélique, nasale, intraveineuse et intrapéritonéale. La plus couramment utilisée est une injection endotrachéale. L’inconvénient est qu’elle crée des incisions chez les souris, ce qui affecte le taux de survie des souris^{modélisées 10}. Des améliorations ont ensuite été apportées pour permettre l’utilisation d’une aiguille permanente pour l’intubation trachéale et l’injection goutte à goutte chez^{la souris 11}. Cependant, le médicament injecté par la seringue ne peut être distribué dans les poumons que sous forme de blocage, ce qui peut entraîner une répartition inégale de la bléomycine dans chaque lobe pulmonaire, provoquant une surdensité locale et affectant la stabilité du modèle murin. De plus, des cartouches de nébuliseur à chambre ont été utilisées pour l’administration de la bléomycine, mais la quantité d’aérosol inhalé dans chaque souris ne peut pas être quantifiée précisément, et le temps d’induction unique est^{long, 12}. Par conséquent, une méthode affinée d’administration intratrachéale de bléomycine à base d’aérosols est développée pour des modèles murins reproductibles et mini-invasifs de mucoviscidosse pulmonaire. La bléomycine est aérosolisée, permettant une dispersion et un dépôt uniformes dans les poumons, ce qui améliore la récapitulation de la pathologie pulmonaire. On espère que l’émergence de cette méthode accélérera la recherche sur des médicaments capables de guérir complètement la fibrose pulmonaire.

Protocole

Toutes les procédures animales ont été menées selon des directives institutionnelles approuvées par le Comité de Soins et d’Utilisation Institutionnels des Animaux (IACUC). Des mesures appropriées de bien-être animal ont été mises en œuvre tout au long de l’expérience. Des mâles C57BL/6 souris âgées de 6 à 8 semaines, pesant environ 25 g, ont été sélectionnés pour l’expérience. Le tableau des matériaux liste tous les animaux, réactifs et équipements utilisés dans cette étude ainsi que leurs sources commerciales.

1. Sélection et acclimatation des animaux

1. Hébergez toutes les souris dans des conditions spécifiques sans agents pathogènes avec un cycle clair/obscur de 12 heures et un accès à volonté à la nourriture et à l’eau.
2. Acclimatez les souris à l’installation pendant 5 à 7 jours avant d’initier le modèle à base d’aérosols.

2. Préparation de la solution de bléomycine

ATTENTION : La bléomycine est un agent antitumoral cytotoxique. Effectuez toutes les étapes dans un placard de biosécurité certifié tout en portant des EPI appropriés.

1. À l’aide d’une seringue stérile de 1 mL, prélève 3 mL de chlorure de sodium stérile à 0,9 % et injecte-le dans un flacon contenant 15 U de chlorhydrate de bléomycine.
2. Faites doucement tourner le flacon jusqu’à ce que la poudre soit complètement dissoute pour obtenir une solution de fond de 5 U/mL.
3. Aliquote la solution d’origine dans des tubes microcentrifuge stériles de 1,5 mL. Préparez des solutions de travail de 3,75 U/mL et 2,5 U/mL en les diluant avec du sérum stérile.
   REMARQUE : Pour une souris de 25 g, ces concentrations correspondent respectivement à des doses de 7,5 U/kg et 5 U/kg. Ajustez les concentrations si le poids de la souris varie.
4. Conservez les solutions fonctionnelles à 4 °C pendant jusqu’à 1 semaine ou à -80 °C pendant jusqu’à 1 mois. Dégelez et portez à température ambiante avant utilisation.

3. Délivrance intratrachéale de béleomycine par aérosol

1. Préparation et administration de l’anesthésie
   1. Préparez la solution anesthésiante de travail en dissolvant 0,1 g de poudre de pentobarbital sodique dans 10 mL de solution physiologique stérile. Filtrez avec un filtre à membrane PES de 0,22 μm. Conservez la solution à 4 °C dans un environnement protégé par la lumière et utilisez-la dans les 3 jours suivant la préparation.
   2. Administrez une solution de pentobarbital sodique par injection intrapéritonéale à l’aide d’une seringue de 1 mL avec une aiguille de calibre 26, à une dose de 60 mg/kg de poids corporel. Si la profondeur ou la durée de l’anesthésie est insuffisante, ajustez la dose en fonction de la réponse de l’animal sous la supervision du vétérinaire traitant.
   3. Évaluez la profondeur de l’anesthésie plusieurs minutes après l’injection en pinçant fermement l’orteil et en confirmant l’absence de réflexe de retrait avant de procéder aux procédures suivantes.
2. Préparation de l’appareil de délivrance d’aérosols
   1. Préparez l’appareil de délivrance d’aérosols, en veillant à ce que l’aiguille de nébulisation, la seringue de nébulisation et le pilier de dosage soient tous présents et stériles (Figure 1B).
   2. Immergez la seringue d’administration en aérosol dans une solution saline stérile. Aspirez lentement le liquide et faites une pause de 8 secondes. Expulsez le liquide rapidement. Répétez cela trois fois pour remplir et rincer le système.
   3. Remplissez la seringue avec du sérum physiologique après l’expulsion finale. Fixez l’aiguille aérosolisante, en veillant à ce que la jonction soit remplie de solution saline.
   4. Immergez l’aiguille assemblée dans du sérum physiologique et répétez le cycle d’aspiration-pause-expulsion trois fois de plus pour éliminer les bulles d’air.
      REMARQUE : Pour confirmer la préparation, expulsez le sérum sur un fond sombre. Assurez-vous que la solution saline rapidement éjectée forme une brume en éventail sur un fond sombre.
3. Procédure d’administration d’aérosols intratrachéaux
   1. Amorçant l’aiguille aérosol avec la solution de travail de la bléomycine en l’aspirant et en l’expulsant trois fois avec des pauses de 8 secondes.
   2. Insérez un pilier de dosage de 25 μL au-dessus du pilier de 50 μL pour calibrer le volume. Aspirez le volume requis (50 μL). Expulsez tout excès de liquide.
      REMARQUE : Cette configuration de dosage assure une livraison cohérente en minimisant l’erreur humaine.
   3. Placez la souris anesthésiée sur la plateforme d’intubation, accrochez les incisives supérieures et fixez les membres pour les stabiliser (Figure 1C).
      REMARQUE : Confirmez les mouvements rythmiques de la poitrine. Si l’animal semble actif, administrez une dose anesthésique supplémentaire.
   4. Utilisez des pinces courbes pour retirer doucement la langue. Insérez un petit laryngoscope pour animaux afin d’exposer la glotte (Figure 1D).
   5. Insérez l’aiguille aérosolisante verticalement à travers la glottite. Administrez rapidement l’aérosol de la bléomycine (Figure 1E).
      REMARQUE : Orientez la pointe de l’aiguille vers le poumon désiré pour une livraison ciblée. Évitez d’y insérer trop profondément pour éviter les traumatismes. La pointe de l’aiguille du nébuliseur doit être positionnée près du point de bifurcation (première bifurcation) de la trachée de la souris sans toucher pour obtenir le meilleur effet de modélisation. Si la pointe est insérée uniquement au centre de la trachée, l’aérosol peut seulement frapper la paroi trachéale, formant de grosses gouttelettes qui sont crachées ou avalées. Si la pointe est trop proche de la bifurcation trachéale, il existe un risque de dommages trachéaux.

4. Récupération post-intervention

1. Placez la souris sur un tapis chauffant pour maintenir la température corporelle. Observez la souris en continu jusqu’à ce qu’elle se remette de l’anesthésie (généralement 1 à 2 heures).
2. Effectuez une pincement de l’orteil pour vérifier vos réflexes et confirmer que la souris est vivante.
3. Effectuez un suivi clinique quotidien pendant 21 jours, incluant le poids corporel, le niveau d’activité, le toilettage et les signes respiratoires.
4. Euthanasiez les animaux lorsque l’un des critères suivants est rempli : (i) > perte de poids corporel de 20 % par rapport à la référence pré-traitement, ou ≥15 % de perte accompagnée d’autres signes cliniques de détresse ; (ii) détresse respiratoire sévère persistante au repos (respiration laborieuse ou abdominale, tachypnée ou bradypnée marquée, poussée nasale ou respiration bouche ouverte), avec ou sans cyanose des extrémités ; (iii) incapacité à obtenir de la nourriture ou de l’eau, léthargie marquée ou une apparence moribunde (aucune réponse à la manipulation et/ou à la perte du réflexe de redressement) ; ou (iv) une déshydratation sévère, une hypothermie ou d’autres signes de détérioration irréversible selon le jugement du vétérinaire traitant. Lorsque ces objectifs humains sont atteints, il faut euthanasier les animaux par overdose de pentobarbital sodique (≥150 mg/kg, i.p.), suivi d’une méthode physique secondaire (par exemple, luxation cervicale), afin d’assurer la mort et de minimiser la douleur et la détresse.

5. Mesure de la fonction pulmonaire terminale et collecte de tissus

1. Au jour 21, anesthésiez la souris avec 90 mg/kg de la même solution anesthésique pour induire une anesthésie profonde et supprimer la respiration.
2. Confirmez l’anesthésie complète par pincée d’orteil. Exposez la trachée en coupant la peau et en séparant les muscles.
3. Faites une petite incision biseautée dans la trachée et insérez l’aiguille d’intubation. Sécuriser avec une ligature chirurgicale.
4. Transférez la souris dans le ventilateur de mécanique pulmonaire contrôlé par ordinateur pour petits animaux. Initiez la ventilation mécanique et assurez-vous d’éviter la respiration spontanée. Utilisez le système de ventilation pour mesurer les paramètres de la fonction pulmonaire.
5. Effectuer une perfusion du ventricule droit avec 5 à 10 mL de solution saline stérile jusqu’à ce que les poumons paraissent blanchis.
6. Disséque tout le poumon. Fixez le poumon gauche dans du formol neutre tamponné pendant 24 heures.
7. Immergez le tissu pulmonaire fixe dans la paraffine, sectionez-le, et effectuez une coloration H&E, la coloration trichrome de Masson, ainsi que la coloration immunohistochimique pour COL1A1 et α-SMA.
8. Placez le poumon droit dans un tube d’homogénéisation de 2 mL avec des billes. Ajoutez de l’eau selon le protocole du kit d’hydroxyproline. Homogénéisez et procédez à l’analyse.

Résultats

Dans cette étude, nous avons proposé une méthode d’administration intrabronchique basée sur des aérosols pour induire la fibrose pulmonaire chez la souris à l’aide de la bléomycine. Lors des expériences préliminaires, un colorant vert était aérosolisé et administré aux poumons de différentes souris. Le colorant présentait un motif de distribution tacheté dans tout le poumon, indiquant que l’administration intrabronchique basée sur des aérosols permettait une dispersion uniforme de l’agen...

Discussion

Cette étude a proposé un modèle optimisé de nébulisation trachéale non invasive de la fibrose pulmonaire induite par la bléomycine chez la souris. Un petit laryngoscope animal a été utilisé pour localiser la glotte, et une minuscule aiguille de nébulisation a été insérée dans les voies respiratoires de la souris. Une pression a été appliquée manuellement pour nébuliser le médicament dans les poumons, réduisant ainsi l’inconfort et l’asphyxie associés à l’aiguille de rétention utilisée da...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
0,22 & mu ; Filtre à seringue polyéthérsulfone M	Cytosci	CSTPE3320
1 mL de seringue jetable	BD	300481
Tube microcentrifuge de 1,5 mL	Servicebio	EP-150-M
Tube de lyse renforcé de 2,0 mL	Servicebio	HT-200-M
4 & deg ; Réfrigérateur de laboratoire C	Meiling	BCD-402WPCX
Tube centrifugeuse conique de 50 mL	Servicebio	EP-5001-J
-80 ° ; C Congélateur ultra-basse température	Haier Biomedical	DW-86L828J
Éthanol absolu	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	100092683
Solution de différenciation acide	Servicebio	G1039
Pulvérisateur aérosol pour l’intubation des petits animaux	Shanghai Yuyan Instruments Co., Ltd	Yan-30012
Ensemble d’instruments chirurgicaux de base	Shanghai Yuyan Instruments Co., Ltd	YAN-21A3
Solution de chlorhydrate de bléomycine	Hanhui Pharmaceutical Co., Ltd	H20055883
Réactif de bleussement	Servicebio	G1040
Ventilateur de mécanique pulmonaire pour petits animaux contrôlé par ordinateur	EMKA Biotech Beijing Co., Ltd.	FX-2
Ruban isolant électrique	3M	1500
Solution de coloration à l’éosine Y	Zhuhai Baso Biotech Co., Ltd	BA4022
Encre de marquage verte	Pilote	Chiku-rin
Solution de coloration à l’hématoxyline	Servicebio	G1004
Kit de quantification de l’hydroxyproline	Abcam	ab222941
Hotte à écoulement laminaire	HDL	DL-CJ-1N
Laryngoscope pour les procédures de petits animaux	Shenzhen Bilead Biology Technology CO., LTD	DXSHJ0
Microscope optique	Nikon	E100
Solution de décirage à faible toxicité	Servicebio	G1128
Kit de coloration trichrome de Masson	Zhuhai Baso Biotech Co., Ltd	BA4079B
Lecteur de microplaques avec détection d’absorbance	Agilent	Synergie H1
Formol tampon neutre	Servicebio	G1101-3ML
Milieu de montage neutre	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	10004160
Anticorps monoclonal recombinant du lapin anti-COL1A1	Huabio	HA722517
Centrifugeuse réfrigérée	Eppendorf	5424R
Eau sans RNase	Generalbiol	TYJC002
Plateforme d’intubation trachéale pour petits animaux	Shanghai Yuyan Instruments Co., Ltd	CG-02M
Solution stérile de chlorure de sodium à 0,9 %	China Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd	H12020024
Homogénéiseur tissulaire	Servicebio	KZ-III
Xylène	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	10023418
Talons de meulage en zircone	Servicebio	G0203