Toutes les procédures expérimentales ont été approuvées par le Comité d’éthique animale de l’Université du sport de Pékin (Approbation n° 2022034A). Les rats étaient hébergés individuellement dans le centre vétérinaire de l’Université du sport de Pékin dans des conditions contrôlées (température : 22-24 °C ; humidité : 45 % à 55 % ; cycle clair/obscurité de 12 heures). Des SHR femelles de 11 semaines et des rats WKY normottenses et d’âge similaire sans agents pathogènes (SPF), ainsi que des rats WKY normotensifs appariés par âge, ont été obtenus auprès de Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. (Licence n° SYXK [Pékin] 2021-0053) à des fins de reproduction. Les réactifs et l’équipement utilisés pour cette étude sont listés dans le tableau des matériaux.
1. Animaux expérimentaux et regroupement
Les rats gestants recevaient un régime alimentaire standard pour la reproduction des rongeurs et de l’eau ad libitum. Tous les rats accouchaient spontanément, et leur progéniture était sevrée avec un régime standard pour rongeurs. Pour l’accouplement, des rats femelles et mâles de la même lignée (WKY ou SHR) ont été cologés à un ratio de 1:1. La présence d’un bouchon vaginal et de spermatozoïdes dans un frottis vaginal a été utilisée pour désigner le jour de gestation 1 (GD1). À la confirmation de la grossesse, les rats ont été répartis aléatoirement en quatre groupes : normotendu sédentaire (p-WKY-SED), exercice normotendu (p-WKY-EX), hypertendu sédentaire (p-SHR-SED) ou exercice hypertendu (p-SHR-EX). Des analyses expérimentales ont été réalisées sur des rats au jour de gestation 21 (GD21), des fœtus au jour embryonnaire 21 (ED21), ainsi que sur des enfants mâles et femelles de 3 hommes de chaque groupe.
2. Procédure d’exercice aérobie maternelle
Avant l’accouplement, les rats femelles étaient acclimatées à l’établissement d’hébergement pendant une semaine, suivies d’une période d’adaptation à l’eau de 5 jours comprenant 15 minutes d’exposition quotidienne à une profondeur de 10 cm maintenue à 34-35 °C. Après un accouplement réussi, les rats du groupe d’exercice ont commencé un régime de nage structuré. Le protocole a débuté par une phase d’adaptation de 4 jours dans une eau de 40 cm de profondeur (34-35 °C), où la durée quotidienne de nage a été progressivement augmentée de 20 minutes initiales à 10 minutes chaque jour. Du jour 5 au jour 20, ces rats nageaient 60 minutes par jour, 6 jours par semaine. Pour contrôler le stress potentiel lié à l’immersion dans l’eau, les rats des groupes sédentaires ont été placés dans des eaux peu profondes (10 cm de profondeur, 34-35 °C) pendant la même durée sans nager activement10.
3. Mesure de la pression artérielle
La pression artérielle systolique (SBP), la pression artérielle diastolique (DBP) et la pression artérielle moyenne (MAP) ont été mesurées chez des rats descendants de 3 M (mâles et femelles) à l’aide du système de queue-cuff CODA Monitor en conditions conscientes et au repos. Toutes les mesures ont été effectuées dans un environnement calme entre 8h00 et 12h00, à une température ambiante d’environ 25 °C.
Le coussin chauffant était allumé 1 h à l’avance et réglé à 37-38 °C pour s’assurer que l’appareil atteignait la température requise avant la prise. Un dispositif de retenue de taille appropriée a été choisi en fonction du poids corporel de chaque rat, et l’animal a été délicatement guidé dans le dispositif de retenue. Après fixation, le rat était placé sur la bouillotte pendant 5 minutes pour permettre un flux sanguin suffisant vers la queue. Un brassard d’occlusion (O-Cuff) et un brassard d’enregistrement de pression de volume (VPR-Cuff) de taille appropriée ont été choisis en fonction de la taille de la queue du rat. Pendant l’opération, le brassard en O était soigneusement positionné à environ 1 cm de la base de la queue, suivi du placement du brassard VPR sur la queue. Après la période d’acclimatation de 5 minutes, les mesures de tension artérielle ont été initiées alors que le rat restait conscient et au repos. Chaque rat a suivi cinq cycles d’acclimatation suivis de dix cycles consécutifs de mesure pour enregistrer les données de tension artérielle. Tout au long de la procédure, les animaux étaient étroitement surveillés et rapidement retirés du dispositif de contention à la fin du protocole de mesure.
4. Chirurgie d’infarctus/IR chez les rats
Les rats étaient à jeûne pendant 12 heures avant l’opération, avec un accès libre à l’eau. Le poids corporel était mesuré avant l’anesthésie. L’anesthésie a été induite avec 5 % d’isoflurane et maintenue avec 2 % d’isoflurane pendant la procédure. Chaque rat était placé en position couchée et fixé sur une bouillotte réglée à 37 °C.
L’intubation endotrachéale orale a été réalisée à l’aide d’un cathéter de 16 G, qui a été délicatement inséré dans la trachée et fixé en place. Le cathéter a ensuite été connecté à un système intégré d’anesthésie et de ventilation. Les paramètres de ventilation ont été réglés à une fréquence respiratoire de 70 respirations par minute, un volume de marée de 8 mL/kg, et un ratio inspiratoire/expiratoire de 1:2.
Les électrodes étaient insérées sous-cutanées dans les membres du rat selon le placement standard du plomb : noir pour le membre antérieur droit, vert pour le membre postérieur droit, et rouge pour le membre postérieur gauche. Les électrodes étaient connectées à un système expérimental à fonction biologique et à un bio-amplificateur, et le suivi électrocardiographique (ECG) était réalisé à l’aide du logiciel LabChart.
Les poils de poitrine du rat ont été rasés, et le site chirurgical a été désinfecté à l’alcool. Une incision a été pratiquée sur la peau du côté gauche du sternum, correspondant au cœur. Une dissection contondante a été réalisée pour exposer les côtes. Un écarteur thoracique a été inséré entre la troisième et la quatrième côte pour ouvrir la cavité thoracique. Le péricarde a été soigneusement déchiré et séparé pour exposer complètement le cœur. La grande veine cardiaque qui l’accompagnait a été utilisée comme point de repère. Environ 1 à 2 mm en dessous de l’appendice auriculaire gauche, un 8-0 Une suture a été passée à travers la surface épicardique pour ligature de l’artère coronaire descendante antérieure gauche (LAD). Un petit tube en bois a été placé au site du nœud, et un nœud coulissant a été attaché pour obstruer le flux sanguin. La cavité thoracique a alors été rapidement refermée. La ligature réussie a été confirmée par l’élévation du segment ST lors de l’électrocardiogramme et une cyanose visible dans la région myocardique ischémique.
Après 45 minutes d’occlusion, le nœud coulissant a été desserré et le tube en bois retiré pour initier la réperfusion. L’air était expulsé de la cavité thoracique, qui était alors fermée et suturée. Le site chirurgical a été désinfecté avec de l’iode povidone, complétant ainsi la procédure.
Un modèle MI/RI a ainsi été établi après 24 heures de reperfusion. Une fois la respiration spontanée reprise, le tube endotrachéal a été retiré et le rat a été remis dans une cage propre.
5. Échocardiographie
L’évaluation échocardiographique a été réalisée à l’aide d’un système d’échographie Doppler colorée pour petits animaux équipé d’une sonde à réseau linéaire haute fréquence L22-8K3 (fréquence centrale : 15 MHz). Les rats ont été anesthésés avec 5 % d’isoflurane pour l’induction et maintenus sous 2 % d’isoflurane tout au long de la procédure. Chaque rat était placé en position couchée et fixé sur la plateforme chirurgicale, la température étant maintenue à 37 °C. L’état respiratoire était continuellement surveillé, et le débit d’isoflurane ajusté selon les besoins afin d’éviter une anesthésie trop profonde ou superficielle, qui pourrait compromettre la précision des mesures échographies cardiaques.
Après avoir rasé la zone thoracique, une quantité appropriée de gel couplant à ultrasons a été appliquée. La sonde échographie était positionnée sur la paroi thoracique antérieure gauche pour obtenir des images échocardiographiques en mode M à partir des vues parasternales sur les axes long et court du ventricule gauche. Pour chaque paramètre, la valeur moyenne de six cycles cardiaques consécutifs a été calculée. La fonction cardiaque a été évaluée en mesurant le diamètre interne du ventricule gauche en systole (LVID), le diamètre interne du ventricule gauche en diastole (LVIDd), le raccourcissement fractionné (FS) et la fraction d’éjection (FE).
6. Chirurgie MCAO chez les rats
Les rats jeûnaient 12 heures avant l’opération mais avaient un accès libre à l’eau. Le modèle MCAO a été établi à l’aide d’une méthode de suture Zea-Longa optimisée. L’anesthésie a été induite avec 5 % d’isoflurane et maintenue avec 2 % d’isoflurane. Une fois la relaxation musculaire observée et la respiration ainsi que le rythme cardiaque stabilisés, les rats étaient placés en position couchée et fixés sur un coussin chauffant contrôlé par thermostat.
La région cervicale du rat était régulièrement rasée et désinfectée. Une incision médiane légèrement à gauche du cou a été réalisée, et les couches musculaires ont été disséquées de manière brutale pour exposer et isoler l’artère carotide commune gauche (ACC), l’artère carotide externe (ECA) et l’artère carotide interne (ICA). L’ECA a été ligaturée avec un fil fin de suture, et la CCA et l’ICA ont été temporairement pincées avec des pinces d’artères. Une incision a été réalisée dans l’ECA, et l’embole de suture a été inséré dans la CCA par l’ouverture de l’ECA. Après avoir sectionné l’ECA, il a été doucement tiré vers le bas pour s’aligner avec l’ICA, facilitant ainsi un chemin droit pour l’insertion de l’embole. L’embole a été soigneusement avancé dans le segment intracrânien de l’ACI. L’insertion a été arrêtée en rencontrant une légère résistance, indiquant un positionnement correct. À ce stade, l’embole était inséré à 18-20 mm de la bifurcation de l’ECA et de l’ICA, correspondant à la profondeur pré-marquée, la pointe occultant l’origine de l’artère cérébrale moyenne (MCA).
Le diamètre de la pointe de l’embolie a été choisi en fonction du poids corporel du rat : 0,31-0,32 mm pour les rats <200 g, et 0,38-0,40 mm pour ceux pesant entre 281 et 330 g. Après confirmation du bon emplacement, l’embole a été fixé, les clips d’artère retirés, l’incision cutanée suturée et le site chirurgical désinfecté avec de la povidone-iode.
La pose réussie du point de suture a été confirmée par une réduction de plus de 50 % de la perfusion sanguine du côté affecté. Après 2 heures d’ischémie, l’embolie a été retiré pour initier la réperfusion. Un modèle de lésion ischémie-réperfusion cérébrale a été établi après 24 heures de réperfusion.
Les déficits neurologiques chez les rats ont été évalués 24 heures après MCAO à l’aide du système de notation Zea Longa. Les critères de notation étaient les suivants (Tableau 1).
Seuls les rats présentant des scores de Zea Longa de 1 à 3 ont été inclus dans les analyses suivantes. Les rats avec des scores de 0 ou 4 ont été exclus en raison de l’absence d’occlusion effective ou d’une lésion cérébrale excessive, respectivement.
7. Imagerie par contraste de taches laser (LSCI)
Les rats ont été à jeûne pendant 12 heures avant l’expérience mais avaient un accès libre à l’eau. L’anesthésie a été induite avec 5 % d’isoflurane et maintenue à 2 % d’isoflurane.
Les rats étaient ensuite placés en position couchée et attachés dans un appareil stéréotaxique. Après avoir rasé et désinfecté le cuir chevelu, une incision médiane a été réalisée le long de la suture sagittale pour exposer le crâne. Le tissu conjonctif et le périoste à la surface du crâne ont été soigneusement retirés. Tout en préservant l’intégrité de la dure-mère, les deux côtés du crâne étaient amincis à l’aide d’une perceuse crânienne jusqu’à ce que l’os devienne transparent. Une fenêtre crânienne mesurant 8 mm × 15 mm a été créée, permettant de visualiser clairement les vaisseaux sanguins corticaux au microscope.
Le système LSCI a été activé, et la position et la distance focale de l’appareil ont été ajustées jusqu’à ce que la fenêtre crânienne soit clairement visualisée. Une source lumineuse laser d’une longueur d’onde de 780 nm a été utilisée. La zone d’éclairage était capturée à l’aide d’un dispositif couplé en charge avec un temps d’exposition de 15 ms et un taux d’images de 15 images par seconde. Une surveillance continue était effectuée pendant 15 à 30 secondes pour obtenir des images avec une résolution de 1280 × 960 pixels. Le système a ensuite converti les images originales de speckles en cartes de flux sanguin et en données quantitatives de perfusion.
Le flux sanguin cérébral de base dans les régions d’irrigation MCA des deux hémisphères a été enregistré pour la première fois avant l’ischémie. Le cuir chevelu a ensuite été suturé et désinfecté avant d’initier la procédure MCAO. Le flux sanguin cérébral dans les deux hémisphères était continuellement surveillé immédiatement après l’occlusion, 2 h et 24 h suivant l’ischémie.
Pendant toute la période de surveillance, l’anesthésie a été maintenue avec de l’isoflurane, et la bouillotte a été régulée pour maintenir la température corporelle du rat constante à 37 °C. L’acquisition des données a commencé lorsque l’animal a montré une respiration et un rythme cardiaque stables.
8. Coloration au chlorure de 2,3,5-triphényltétrazolium (TTC)
La solution TTC à 2 % (p/v) a été préparée en dissolvant 0,2 g de poudre TTC dans 10 mL de solution saline tamponnée phosphate (PBS, pH 7,4). La solution était transférée dans un tube centrifugeuse enveloppé de feuille d’aluminium, soigneusement vortexée pour assurer une dissolution complète, puis placée dans un bain-marie préchauffée à 37 °C.
Après 24 heures de reperfusion, les rats ont été anesthésés avec 5 % d’isoflurane et euthanasiés par exsanguination par l’aorte abdominale. Le cœur et le cerveau ont été immédiatement prélevés et rincés soigneusement avec 10 mL de PBS. Les tissus ont été congelés instantanément à −40 °C pendant 30 minutes, puis intégrés dans des moules et coupés coronalement de l’antérieur vers l’arrière à une épaisseur de 2 à 3 mm par tranche. Les tranches ont été incubées dans une solution TTC à 2 %. Les tranches de cœur ont été incubées dans un bain-marie à 37 °C protégées de la lumière pendant 10 minutes, tandis que les tranches de cerveau ont été incubées dans les mêmes conditions pendant 25 minutes. Les tranches étaient retournées toutes les 5 minutes pendant l’incubation pour assurer une teinture uniforme. Après la teinture, les tranches ont été rincées trois fois avec 10 mL de PBS et fixées dans 10 mL de formol à 10 % pendant 24 heures.
Après 24 heures de fixation, les tranches de tissu ont été retirées et appliquées doucement avec de la gaze pour éliminer l’excès d’humidité. Chaque tranche était placée sur une plaque en verre transparente, et les faces avant et arrière étaient scannées. Dans les images scannées, les régions blanches indiquaient un tissu infarcté (ischémique), tandis que les régions rouges représentaient un tissu viable (non ischémique). L’analyse d’image a été réalisée à l’aide du logiciel ImageJ pour calculer le rapport de surface de l’infarctus des tranches myocardique et cérébrales. Zone d’infarctus du myocarde ( %) = (Aire infarctique / Aire totale du myocarde) × 100 % ; Zone d’infarctus cérébral ( %) = (Zone d’infarctus côté MCAO / Surface totale de l’hémisphère ipsilatéral) × 100 %.
9. Notes de sécurité et manipulation des matières dangereuses
L’isoflurane était manipulé à l’intérieur d’une hotte pour éviter toute exposition à l’inhalation et stocké dans un endroit frais et bien ventilé. Le formol et la tentative de cervesser ont été manipulés à l’aide de gants en nitrile et de masques faciaux pour minimiser le contact cutané et le risque d’inhalation. Le TTC a été reconnu comme photosensible et donc stocké et utilisé dans des contenants enveloppés dans du papier aluminium.
La zone chirurgicale a été désinfectée à 75 % d’éthanol, et tous les instruments ont été autoclavés à 121 °C pendant 20 minutes avant utilisation. Les opérateurs portaient des gants et des blouses stériles pour maintenir des conditions aseptiques tout au long des procédures.
Un suivi post-chirurgical a été effectué toutes les 6 heures pendant 24 heures afin d’assurer le bien-être animal. Les animaux présentant une détresse sévère, comme des tremblements continus ou un manque d’apport en nourriture et en eau, ont été immédiatement euthanasiés conformément aux directives éthiques institutionnelles.
Tous les déchets de la TTC et de formolin étaient collectés dans des contenants biohazard étiquetés et éliminés conformément au protocole institutionnel de gestion des déchets dangereux. Les tissus animaux étaient incinérés via l’installation désignée pour les déchets biologiques de l’université. Les matériaux chirurgicaux contaminés étaient autoclavés avant leur élimination.
10. Analyse statistique
Toutes les données ont été présentées en moyenne ± SEM. Les analyses statistiques ont été réalisées à l’aide du logiciel GraphPad Prism 8. Les différences entre les quatre groupes ont été évaluées à l’aide d’une analyse bidirectionnelle de la variance (ANOVA bidirectionnelle ; facteurs : hypertension et exercice). Les comparaisons entre les mâles et les femelles ont été évaluées à l’aide d’un test t de Student à deux queues non appariés. La valeur P < 0,05 était considérée comme statistiquement significative.