Suivi en temps réel de la dynamique induite par l’acupuncture dans le tissu conjonctif sous-cutané via l’imagerie confocale laser in vivo

Résumé

Cette étude établit l’imagerie confocale laser in vivo comme méthode en temps réel pour suivre la dynamique morphologique induite par l’acupuncture, telle que la vasodilatation et le remodelage du collagène, chez les rats vivants. À l’aide du marquage à la fluorescéine sodique, l’approche capture les réponses tissulaires immédiates et retardées, offrant un nouvel outil pour évaluer quantitativement les thérapies physiques, y compris l’acupuncture et la moxibustion.

Résumé

La surveillance dynamique en temps réel des effets de l’acupuncture est cruciale pour élucider ses mécanismes biologiques, mais les méthodes histologiques traditionnelles ne parviennent pas à capturer les réponses transitoires dans le microenvironnement vivant. Ici, nous avons établi un cadre méthodologique basé sur l’imagerie confocale laser in vivo , permettant une observation à haute résolution et en temps réel des changements morphologiques dans les tissus locaux suite à une intervention d’acupuncture. Après une injection intraveineuse de fluorescéine sodique chez le rat, des altérations dynamiques de la microcirculation et de la matrice extracellulaire (par exemple, l’arrangement des fibres de collagène) ont été suivies pendant l’acupuncture. Les résultats ont démontré que cette méthode distinguait clairement les réactions tissulaires immédiates (e.g., vasodilatation) et retardées (e.g., réponse inflammatoire) induites par l’acupuncture, avec une résolution spatiale de 0,5 μm et une résolution temporelle de 3,5 fps. L’analyse quantitative ultérieure a permis de mesurer objectivement les paramètres morphologiques. Ce protocole, décrit dans cette étude, fournit un outil de visualisation pour les études in vivo des mécanismes d’acupuncture et sert de référence technique pour évaluer les effets d’autres stimuli physiques (par exemple, la moxibustion).

Introduction

L’acupuncture, en tant que pierre angulaire de la médecine traditionnelle, exerce des effets thérapeutiques par le biais de réponses complexes au niveau des tissus 1,2,3,4. Cependant, les connaissances mécanistes restent limitées par l’histologie conventionnelle, qui capture des instantanés statiques mais ne parvient pas à résoudre la dynamique en temps réel des adaptations morphologiques (par exemple, la vasomodulation, le remodelage de la matrice extracellulaire) dans les tissus vivants⁵. Bien que la microscopie intravitale offre un potentiel d’imagerie dynamique, son application dans la recherche en acupuncture est rare, en particulier pour quantifier les réponses spatio-temporelles aux stimuli physiques ^6,7. En revanche, cette approche d’imagerie confocale permet l’extraction quantitative de paramètres structurels et dynamiques, tels que le taux de variation de la vitesse de déplacement des globules rouges et l’arrangement du collagène, dans les tissus profonds (par exemple, les couches musculaires et les points d’acupuncture ST 36/GB 34), surmontant ainsi les limites de la microscopie intravitale conventionnelle en termes de résolution spatiale, d’imagerie volumétrique et de suivi à long terme⁸.

L’imagerie confocale laser est apparue comme un outil puissant pour la visualisation in vivo à la résolution cellulaire 9,10,11,12,13. Pourtant, les études existantes se concentrent principalement sur les tissus superficiels (par exemple, la peau ou la cornée), et peu d’entre elles abordent des cibles d’acupuncture profondes ou intègrent une analyse morphologique quantitative. De manière cruciale, à notre connaissance, il n’existe aucune méthodologie standardisée pour corréler la manipulation de l’acupuncture avec les changements cinétiques des tissus vivants.

Ici, nous comblons cette lacune en établissant une plateforme méthodologique basée sur l’imagerie confocale pour le suivi en temps réel des événements morphologiques induits par l’acupuncture. En utilisant la fluorescéine sodique (administrée par voie intraveineuse à une concentration de 1 %, 0,1 mL/100 g de poids corporel) comme agent de contraste, nous réalisons une surveillance à haute résolution (résolution spatiale de 0,5 μm / résolution temporelle de 3,5 fps) des altérations microcirculatoires et matricielles sur un champ de vision de 450 μm × 450 μm jusqu’à 400 μm de profondeur - de la vasodilatation immédiate aux cascades inflammatoires retardées - pendant la stimulation par acupuncture. Cette approche permet en outre la reconstruction 3D et la quantification des paramètres du réalignement des fibres de collagène, surmontant ainsi les limites de l’histologie des points finaux.

Les considérations pratiques pour la mise en œuvre de ce protocole sont les suivantes : (i) le matériel recommandé comprend un système confocal avec une résolution de ≥0,5 μm et un taux d’acquisition de ≥3 ips, (ii) les limitations typiques incluent le photoblanchiment au-delà de 90 s d’imagerie continue et la sensibilité aux mouvements respiratoires ou tissulaires, et (iii) la pénétration en profondeur peut être réduite dans les tissus très denses ou diffusants. À notre connaissance, ce travail fournit non seulement le premier atlas dynamique de la réorganisation tissulaire évoquée par l’acupuncture, mais crée également un précédent pour l’évaluation des thérapies physiques (par exemple, la moxibustion) dans les systèmes vivants. En convertissant les réponses physiologiques transitoires en mesures quantifiables, nous proposons un nouveau paradigme pour les études mécanistes des thérapies neuromodulatrices.

Protocole

Toutes les procédures ont été approuvées par le Comité d’éthique animale de l’Institut d’acupuncture et de moxibustion de l’Académie chinoise des sciences médicales chinoises (n° D2023-01-29-01). Huit rats Sprague Dawley (SD) mâles (âgés de 8 semaines, 200-220 g) ont été obtenus de Biotechnology Co., Ltd. (numéro de licence SCXK (Jing) 2020-0001). Les animaux ont été logés dans des enclos d’isolement stérilisés dans des conditions contrôlées : cycle lumière-obscurité de 12 h, température de 21 ±± 2 °C, avec accès ad libitum à des granulés de nourriture standard et à de l’eau. Toutes les expériences ont été conformes aux lignes directrices de l’établissement et au Guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire.

REMARQUE : La figure 1 présente un organigramme mettant en évidence les principales procédures.

1. Préparation de l’animal et du traceur : Fluorescéine sodique (FS)

1. Pour préparer une solution de coloration à la fluorescéine sodique (FS) à 1 %, dissoudre 0,1 g de FS dans 10 mL de solution saline stérile (NaCl à 0,9 %). Conservez la solution à température ambiante (RT) pour une utilisation ultérieure.
2. Anesthésie les rats SD par induction d’isoflurane (induction : 5 % d’isoflurane, entretien : 2,5 % d’isoflurane). Épilez les cheveux de la région crânienne (à l’exception de la tête) à l’aide d’une tondeuse électrique, puis appliquez une crème dépilatoire pendant 5 min. Éliminez les résidus de crème et les cheveux en rinçant à l’eau tiède.
   REMARQUE : Maintenez la lame de la tondeuse parallèle à la surface de la peau pendant le fonctionnement pour éviter les lésions cutanées qui pourraient compromettre l’analyse d’imagerie quantitative. De l’eau chaude doit être strictement utilisée pour le rinçage afin d’éviter que l’hypothermie animale n’affecte les résultats expérimentaux.

2. Injection de FS

1. Sécurisez le rat.
   1. Anesthésier les rats épilés par injection intrapéritonéale de 10 % d’uréthane (1 g/10 mL, dans une solution saline) à la dose de 1,0 g/kg.
   2. Une fois l’anesthésie complète obtenue, sécurisez les animaux en position couchée sur la plate-forme d’opération. Appliquez une légère pince des orteils sur la patte arrière à l’aide d’une pince et observez l’absence de réflexe de retrait. Vérifiez la perte du réflexe cornéen en touchant légèrement la cornée avec un embout en coton humide.
   3. Confirmez l’absence de réponse soutenue et la fréquence respiratoire stable avant de procéder à l’intervention. Pendant l’anesthésie, maintenez la température corporelle de l’animal à l’aide d’un coussin chauffant à 37 °C.
      REMARQUE : Une anesthésie complète doit être confirmée pour éviter les mouvements involontaires qui compromettraient le déplacement de la fenêtre d’imagerie.
2. Administrer par voie intraveineuse une solution à 1 % de FS par la veine de la queue à une dose de 0,1 mL par 100 g de poids corporel.
   1. Effectuer l’injection dans la veine caudale à l’aide d’une seringue de 1 mL munie d’une aiguille de 27 G. Essuyez doucement la queue avec de l’eau tiède pour favoriser la vasodilatation, suivie d’une désinfection avec de l’éthanol à 70 %.
   2. Insérez le biseau de l’aiguille à un angle peu profond (≤15°) le long de l’axe longitudinal de la veine. Injecter la solution lentement à un débit de 0,1 à 0,2 mL/min.
   3. Assurer un écoulement technique sans résistance, l’absence d’œdème périvasculaire et confirmer la réussite de l’injection par une décoloration jaune des pupilles, des pennes et des pattes.
      REMARQUE : L’injection intra-artérielle accidentelle doit être strictement évitée.

3. Configuration de l’endomicroscopie laser confocale (pCLE) de la sonde in vivo

1. Activez le système pCLE et vérifiez la propreté du connecteur de la sonde de balayage et de l’embout distal.
2. Nettoyez l’extrémité distale de la sonde (également appelée pointe de balayage) à l’aide d’un coton-tige imbibé de sérum physiologique, puis séchez doucement avec du tissu pour lentilles.
3. Positionnez la sonde laser sur le site d’observation cible (par exemple, la région médiane de la cuisse). Fixez la sonde d’imagerie confocale à l’aide d’une pince réglable, assurant un contact stable avec la surface du tissu sans artefacts de compression, et fixez-la en serrant le bouton de réglage.
4. Connectez la sonde au système pCLE et configurez les paramètres d’acquisition (par exemple, champ de vision [FOV], répertoire de stockage). Les paramètres spécifiques utilisés dans cette expérience sont les suivants :Profondeur : 18 μm ; Laser : 219 mW ; Luminosité : 76 % ; Vitesse : 1920 × 540 ; Gain : 2400 ; Zoom : 1× (464 μm) ; Filtre : LP 515 ; Table de recherche : balayage gris.
   REMARQUE : Les paramètres d’imagerie (profondeur de balayage/puissance laser) ont été optimisés de manière itérative jusqu’à ce qu’une visualisation distincte de l’architecture tissulaire soit obtenue. Une intensité constante est essentielle pour la comparabilité des images longitudinales. L’ajout de gouttelettes salines à 37 °C à l’interface sonde-tissu a éliminé la perte de signal observée lors des itérations initiales. La puissance laser utilisée dans cette étude est inférieure au seuil communément accepté de phototoxicité en imagerie confocale in vivo .

4. Imagerie de la structure organisationnelle avec pCLE et acquisition

1. Positionnez la sonde à la surface de la peau et lancez l’acquisition de données pour visualiser l’architecture des tissus.
   1. Tenez la sonde d’une manière crayonnante ; Manœuvrez-le pour cibler des régions (par exemple, des zones avec un système vasculaire ou un tissu conjonctif fibreux dans le champ de vision), placez l’extrémité distale directement sur la zone d’imagerie, puis stabilisez-le via le bras de la sonde.
2. Tout d’abord, acquérir l’architecture tissulaire de base pendant 1 minute dans des conditions physiologiques, suivie d’un enregistrement de 5 minutes pendant l’intervention d’acupuncture. Mettre fin à l’acquisition après l’intervention. Les fichiers de données sont automatiquement enregistrés dans le répertoire spécifié à l’étape 3.3-3.4.
   REMARQUE : Les fichiers sont enregistrés sous forme d’empilements de calques (.tiff) et d’images individuelles (.tiff).

5. Intervention d’acupuncture

REMARQUE : L’acquisition dans l’étape d’imagerie est effectuée pendant l’intervention.

1. Insérez une aiguille jetable en acier inoxydable de 1 cun (l’unité chinoise de mesure de la longueur est d’environ 13 mm) dans le point d’acupuncture adjacent au tissu observé par la sonde. Connectez un fil à l’aiguille en acier inoxydable et fixez l’autre électrode de référence sur la queue du rat.
2. Appliquez une stimulation par électroacupuncture (EA) en utilisant les paramètres suivants : intensité de 1 mA, onde dense-dispersée (2/15 Hz), pendant 5 min.
   REMARQUE : Maintenez une distance suffisante (>3 mm) entre le site d’insertion de l’aiguille et la sonde pour éviter les tremblements cutanés induits par l’EA qui compromettent la stabilité de l’image.

6. Analyse d’images

1. Ouvrez les piles d’images acquises dans ImageJ. Convertissez l’étalonnage spatial en micromètres et transformez le format d’image en 8 bits pour la compatibilité avec les plug-ins (type > d’image > 8 bits).
   REMARQUE : les dimensions par défaut de l’image sont en pouces (paramètre spécifique au système).
2. Définir la région d’intérêt (ROI) pour : microcirculation : segment capillaire unique, structure matricielle : région des fibres de collagène. Maintenez des retours sur investissement identiques sur des images séquentielles pour une cohérence longitudinale.
3. Analyse de la microcirculation
   1. Sélectionnez la région contenant les globules rouges qui doit être observée et recadrez l’image pour supprimer les autres zones interférentes (Rectangle > Image > Recadrage). Utilisez l’outil de seuil pour segmenter les globules rouges (GR) exclusivement (Image > Ajuster >outil de seuil).
   2. Chargez le plugin MTrack2 . Définissez les paramètres de suivi appropriés en fonction de la taille des RBC (dans cette expérience, 10 à 42 pixels) afin d’exclure les interférences et d’assurer un suivi précis des RBC (Plugin > Tracking > MTrack2).
4. Analyse structurelle matricielle
   1. Chargez le plug-in Directionality , sélectionnez le mode Composants de Fourier et effectuez une analyse statistique sur la proportion de distribution des fibres de collagène sur des orientations de 0° à 180° (Analyser > Directionnalité).

7. Finalisation des données

1. Exportez les données analysées aux formats TIFF/XSL en utilisant la convention de nommage : [Group]_[Date].extension. Sauvegardez tous les fichiers bruts et traités sur un serveur sécurisé désigné. Enregistrer les résultats quantitatifs dans une feuille de calcul récapitulative à des fins d’analyse statistique.

8. Sécurité et gestion des déchets

1. Équipement de protection individuelle (EPI) : Portez des gants en nitrile, une blouse de laboratoire et des lunettes de sécurité lorsque vous manipulez de l’uréthane, de l’isoflurane ou de la fluorescéine sodique.
2. Manipulation de l’anesthésique : Effectuer des procédures impliquant de l’uréthane ou de l’isoflurane dans une hotte pour minimiser l’exposition par inhalation.
3. Précautions concernant les objets tranchants : Jetez immédiatement toutes les aiguilles et tous les objets pointus dans des contenants pour objets tranchants désignés résistants aux perforations.
4. Sécurité de l’électroacupuncture (EA) : Vérifiez l’isolation électrique de l’équipement EA et sécurisez les connexions des fils pour éviter les courants de fuite ou les courts-circuits.
5. Élimination des déchets : Jetez les bouteilles d’isoflurane comme déchets médicaux conformément aux directives institutionnelles. Jetez les déchets contaminés par des colorants (p. ex., écouvillons, mouchoirs) dans des conteneurs scellés pour déchets dangereux. Rassemblez les objets tranchants dans des boîtes d’élimination certifiées pour objets tranchants.
   REMARQUE : Toutes les procédures doivent être conformes aux règlements de l’établissement en matière de sécurité et de santé environnementale.

Résultats

Ce protocole démontre l’utilité de la pCLE pour l’évaluation dynamique en temps réel des effets de l’acupuncture sur la microcirculation et l’architecture de la matrice extracellulaire. Après l’administration intraveineuse de fluorescéine sodique via la veine de la queue, les changements ont été évalués en observant des altérations de la vitesse érythrocytaire dans les capillaires locaux et une réorganisation de l’arrangement des fibres de collagène.

Discussion

Comme le démontrent les résultats, le protocole d’imagerie confocale in vivo établi dans cette étude permet une analyse quantitative simultanée de la dynamique de la matrice microcirculatoire et extracellulaire lors d’une intervention d’acupuncture à l’aide d’équipements standard disponibles dans le commerce et d’un marquage fluorescent de routine. Le succès de ce protocole repose sur deux étapes critiques : le moment précis de l’injection de fluorescéine sodique, la garantie d’...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
1 aiguille d’acupuncture cun	Hwato, Suzhou, Chine	N/A	13 mm/0,25 mm
10 % de fluorescéine sodique	Guangxi Wuzhou Pharmaceutical Co Ltd, Chine	H45021477
Appareil d’anesthésie animale	RWD, Shenzhen, Chine	R620IE
Moniteur de température corporelle	RWD, Shenzhen, Chine	69026
Appareil d’acupuncture électrique	Hwato, Suzhou, Chine	SDZ-III
Crème dépilatoire	Veet, France
ImageJ	Instituts nationaux de la santé, États-Unis	https://imagej.nih.gov/ij/
Sonde in-vivo endomicroscopie laser confocale	Optiscan, Australie	ViewnVivoB30	Diamètre : sonde rigide portative de 4 mm, résistante à la flexion et maintient l’intégrité structurelle dans le temps. Longueur : &ge ; 46 mm. Mode de balayage : capacité de balayage zoom.
L’isoflurane	RWD, Shenzhen, Chine	R510-22-16
Uréthane	Sigma-Aldrich, États-Unis	94300