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Article de méthode

Établir un modèle porcin pour étudier la préservation dynamique et la transplantation de la greffe d’œil entier

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DOI :

10.3791/69179

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25 novembre 2025

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1Center for Engineering in Medicine and Surgery, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School, 2Shriners Children's Boston, 3Plastic Surgery Research Laboratory, Department of Plastic and Reconstructive Surgery, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School, 4Department of Plastic, Reconstructive and Aesthetic Surgery, Hospices Civils de Lyon, 5Department of Plastic, Reconstructive and Aesthetic Surgery, CHU de Rennes, University of Rennes, 6Faculty of Medicine and Health Sciences, University of Antwerp, 7Bioengineering Research Group, Cardiff Metropolitan University, 8Collaboration for the Advancement of Sustainable Medical Innovation, University College London, 9Division of Plastic Surgery Research, Vascularized Composite Allotransplantation Program Development, Cedars-Sinai Hospital

Dans cet article

Résumé

Un modèle détaillé et reproductible de transplantation complète de l’œil porcin (WET) est décrit, de la prélèvement chirurgical à l’initiation de la perfusion machine, permettant l’étude de la préservation dynamique de la WET lors de la transplantation.

Résumé

La toute première greffe de l’œil entier (WET) chez l’humain a ravivé un nouvel espoir chez les patients ayant perdu la vue à cause d’une lésion ophtalmique majeure, mais d’importants défis restent à relever avant que la restauration de la vision par la WET ne devienne réalisable. Parmi ceux-ci, l’un des défis les plus critiques est la préservation ex vivo . Le globe oculaire, en particulier ses composantes neuronales telles que la rétine et le nerf optique, subit une dégénérescence rapide et irréversible en quelques minutes à moins qu’une préservation adéquate ne soit assurée. Le stockage statique à froid (SCS) reste la référence en allotransplantation composite vascularisée (VCA), mais n’est pas adapté à la préservation ex vivo à l’humidité en raison de son incapacité à supprimer ou soutenir suffisamment le métabolisme, entraînant une perte de viabilité et de fonction du greffon. La perfusion sous-normotherme de machines (SNMP) s’est imposée comme une alternative prometteuse au SCS, offrant le potentiel non seulement de préserver les greffons mais aussi de les reconditionner. Notre groupe a réussi à traduire SNMP de la transplantation d’organes solides à plusieurs modèles VCA, démontrant sa faisabilité et ses avantages. Nous rapportons ici l’application de SNMP pour préserver un WET chez les porcs, détaillant le modèle anatomique et le protocole de préservation. Cette approche représente une avancée majeure dans l’optimisation des techniques de conservation et de transplantation de l’humidité.

Introduction

Les allotransplantations composites vascularisées (ACV) représentent une avancée significative en chirurgie reconstructive, offrant des résultats esthétiques et fonctionnels inégalés pour les patients présentant des lésionscomplexes 1,2. Cependant, la perte de vision liée au globe oculaire reste une source majeure d’altération des blessures au visage. La récente première greffe complète de l’œil (WET) a ravivé un nouvel espoir chezles patients 3,4. Bien que la vue n’ait pas été retrouvée, l’imagerie fonctionnelle a démontré une activation corticale en réponse à la stimulation lumineuse, et l’électrorétinographie (ERG) a indiqué une réponse atténuée mais reconnaissable des photorécepteurs à la lumière5. Malgré des exploits techniques exceptionnels, il reste encore des défis importants à relever pour faire de la WET fonctionnelle une réalité clinique. Le globe oculaire est très sensible à l’ischémie, et la rétine ainsi que le nerf optique subissent une dégénérescence irréversible dans les minutes suivant le temps d’ischémie chaude (WIT), à moins que des niveaux d’oxygénation et de pH adéquats ne soientmaintenus 6. Ainsi, la WET pose des défis spécifiques au sein du champ VCA, et plusieurs facteurs doivent être pris en compte, notamment les segments postérieur et antérieur, ainsi que les composantes extraoculaires. En particulier, la musculature est essentielle pour obtenir des résultats fonctionnels réussis, car elle est très susceptible aux lésions d’ischémie chaude, aggravées par la réperfusionischémique 7,8. La privation d’oxygène entraîne des dommages cellulaires et la libération de motifs moléculaires associés aux dommages (DAMPs). Lors de la reperfusion, ces DAMPs activent le système immunitaire du receveur, déclenchant une inflammation et une infiltration cellulaire immunitaire. Cet environnement inflammatoire accélère le rejet en favorisant la présentation des antigènes et l’activation des lymphocytesT 9. En plus de surmonter des défis tels que la reconnexion du nerf optique, la WET nécessitera des techniques de perfusion ex vivo optimisées pour prévenir les dommages résultant de la WIT ou du stockage statique à froid (SCS) et finalement atteindre la restauration de lavision 5,7,9,10,11.

La perfusion machine (MP) est bien établie dans la transplantation d’organes solides comme méthode de prévention des lésions ischémie-réperfusion 12,13,14, la perfusion machine subnormotherme (SNMP) démontrant des résultats supérieurs à la SCS dans divers modèles 15,16,17. Nous avons réussi à traduire SNMP à travers des modèles animaux allant des rongeurs18, 19 auxporcs 20, 21, 22 et, récemment, des primates nonhumains 23. Le SNMP a non seulement prouvé son efficacité pour conserver les greffons pendant de longues durées, mais a également montré un potentiel pour le reconditionnement des greffons et la mitigation des blessures ischémiques chaudes, permettant une replantation sûre jusqu’à 24 heures après l’acquisitionde 24,25 heures. Grâce à sa capacité à maintenir partiellement le métabolisme cellulaire, le SNMP ouvre également de nouvelles voies en transformant la phase de préservation en une plateforme diagnostique, thérapeutique et de préconditionnement pouvant être intégrée dans les protocoles de replantation et de transplantation en VCA. Nous avons développé un protocole SNMP optimisé spécifiquement adapté aux VCA et l’avons appliqué à ce scénario complexe de greffe d’œil globale.

Dans cette étude, le SNMP est utilisé pour la préservation dynamique et oxygénée des organes à température ambiante (environ 20 °C). Cette technique utilise une pompe péristaltique et un oxygénateur pour faire circuler et oxygéner le perfusat. Un modèle porcin est utilisé, ce qui est très pertinent pour les études sur la transplantation et la préservation de la WET en raison de ses similitudes physiologiques avec les humains, de la taille comparable des vaisseaux et de l’absence unique d’une paroi orbitairelatérale 26,27,28. Cette caractéristique le rend particulièrement adapté aux expériences ex vivo et aux études d’allotransplantation, car l’artère carotide externe et l’artère ophtalmique sont directement connectées, permettant d’obtenir le WET uniquement via l’artère carotide externe et les veines jugulaires sans nécessiter de dissection intracrânienne pour les expériences ex vivo et in vivo replantation orthotopique ou hétérotopique. Le prélèvement est effectué après un décès circulatoire, en accord avec les protocoles de don après la mort cardiaque et permettant un retard dans l’extraction jusqu’à la prélèvement d’autres organes solides. Ce modèle explore donc davantage le potentiel des SNMP pour reconditionner des greffons très sensibles après une ischémie chaude et soutient le développement de techniques de préservation des WET au sein de laboratoires de transplantation établis qui se concentrent déjà sur d’autres organes, en respectant les principes « 3-R » de raffinement, réduction etremplacement 29,30. De plus, il reste pertinent pour les achats à rythme cardiaque suivant des étapes similaires. L’objectif est d’établir un modèle de préservation fiable basé sur les pédicules carotidien et jugulaire externes et d’évaluer sa faisabilité pour une préservation dynamique. Des étapes procédurales détaillées sont fournies, incluant la collecte de pots-de-vin, la préservation et les aspects clés de la mise en œuvre du SNMP.

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Protocole

L’approbation institutionnelle pour cette étude a été obtenue du comité local de soins et d’utilisation des animaux institutionnels (protocole #2024N000205). Tous les travaux sur les animaux suivaient les directives31 de l’Animal Research : Reporting of In Vivo Experiments et étaient conformes aux recommandations du Bureau américain de révision des soins et de l’utilisation des animaux (ACURO)32. Tous les WET ont été acquis auprès de porcs en instance de prélèvement d’organes terminaux, selon les principes « 3-R» 33. Les animaux pesant entre 30 kg et 50 kg ont été euthanasiés par exsanguination après avoir reçu 100 UI/kg d’héparine, et des greffes de WET à gauche ont été utilisées pour les expériences. Les bons WETs servaient de points de contrôle. L’obtention d’organes a eu lieu après l’autopsie avec moins de 180 minutes d’ischémie tiède. Voir le tableau des matériaux pour les détails sur tous les réactifs et équipements utilisés dans le protocole.

REMARQUE : Les données étaient enregistrées dans un tableau Excel (par exemple, Excel), et des analyses statistiques étaient réalisées à l’aide d’un logiciel statistique approprié (par exemple, GraphPad Prism). Le risque alpha était fixé à 5 % et à deux queues. Pour chaque variable surveillée, la moyenne et l’erreur standard de la moyenne étaient déterminées. Le test de Spearman a été utilisé pour étudier les corrélations entre les paramètres de perfusion.

1. Préparation à la perfusion machine (1 jour avant l’expérience)

  1. Installez le système de perfusion machine34 (voir Figure 1).
    1. Assemblez les composants du système de perfusion : pompe, oxygénateur, piège à bulles, capteur de pression continue et capteur de poids.
      REMARQUE : La longueur du tube doit être respectée au minimum nécessaire pour assembler tous les composants de l’installation. Une fois assemblé, gardez à l’esprit que l’étalonnage de la pression est spécifique au système, en particulier aux longueurs de tube.
    2. Reliez le système sous forme de circuit semi-fermé à recirculation afin de pomper le perfusat du réservoir vers l’oxygénateur, puis vers l’entrée de greffon (artère carotide). L’écoulement veineux s’écoule de nouveau dans le réservoir (Figure supplémentaire 1 et Vidéo supplémentaire 1).
    3. Fixez le capteur de pression au tuyau d’entrée.
    4. Placez la greffe sur la plateforme tridimensionnelle (imprimée en 3D) positionnée sur la balance électronique.
    5. Connectez à la fois la balance et le capteur de pression au microcontrôleur.
    6. Reliez le microcontrôleur à l’ordinateur de l’opérateur pour une surveillance en temps réel et un enregistrement continu des données.
    7. Préparez la caméra thermique pour la surveillance de la température.
      REMARQUE : La surveillance du poids, en tant que substitut à la formation d’œdème, est cruciale car elle constitue un indicateur précoce de lésions du greffon lors de la perfusion35.
  2. Nettoyez soigneusement les composants du circuit avant d’initier la perfusion et portez une attention particulière à l’oxygénateur, en particulier s’il a été utilisé plusieurs fois.
    1. Commencez par rincer tous les tuyaux séparément avec de l’éthanol à 70 %, puis avec de l’eau déionisée stérile.
    2. Montez le système et faites circuler 2 L d’eau stérile déionisée pour rincer l’oxygénateur à un débit de 50 à 100 mL/min s’il a déjà été utilisé.
      REMARQUE : Pour les études de replantation d’animaux vivants, utilisez un nouvel oxygénateur stérile et stérilisez tous les autres composants de perfusion avec de l’oxyde d’éthylène (ETO)
  3. Préparez la solution de perfusée. Pour la perfusion sous-normotherme des machines, utilisez une solution Steen+ optimiséeVCA 24,34,36. Au total, utilisez 1,5 L par greffe, suivant la composition détaillée précédemmentrapportée de 34.
  4. Ajoutez une solution d’hydroxyde de sodium au perfusate pour obtenir un pH de 7,5 à 7,6. Fixez cette valeur initiale délibérément élevée, car le pH diminuera pendant la circulation lorsque le mélange de carbogènes (95 % d’oxygène, 5 % de dioxyde de carbone) se dissout.
  5. Calibrez les capteurs de poids et de pression pour garantir des mesures précises.
    1. Ajustez la balance pour tenir compte du poids de la plateforme.
    2. Pour mesurer précisément la pression vasculaire, calibrez le système selon le manomètre et le débit utilisés : mesurez la pression du système pour chaque taille de cathéter pouvant être utilisée à des intervalles réguliers de débit (tous les 0,5 mL, de 0 à 20 mL/min).
    3. Lors des expériences, pour calculer la pression artérielle, on soustraie la pression d’étalonnage de la pression totale mesurée. Le tableau d’étalonnage utilisé dans ces expériences est donné à titre d’exemple (Figure supplémentaire 2).
      REMARQUE : L’étalonnage est spécifique à chaque configuration. Répétez l’étalonnage après tout changement de tube, d’oxygénateur ou de perfusé, car ces modifications peuvent modifier la pression du système.

2. Acquisition post-mortem de WET

REMARQUE : Pour simuler le don après un décès cardiaque et/ou l’obtention post-mortem, l’animal doit être euthanasié conformément aux directives locales de l’IACUC. Privilégiez l’exsanguination à l’injection intraveineuse de pentobarbital afin d’éviter toute toxicité liée aux médicaments qui pourrait interférer avec l’étude.

  1. Gardez l’animal euthanasié en position couchée. Rasez et frottez la tête et le cou et placez des rideaux stériles.
    REMARQUE : Le modèle anatomique est présenté à la Figure 2, et un guide de dissection étape par étape est fourni dans le Fichier Supplémentaire 1.
  2. Dessinez les marques cutanées du lambeau.
    1. Assurez-vous que les marques consistent en une ligne autour de l’orbite, à 2 cm du rebord orbitaire, et une incision étendue de 1 cm sous le canthus latéral vers le cou.
    2. Effectuer l’incision avec un scalpel n°23 à travers la peau et les tissus sous-cutanés jusqu’à l’os aux parties supérieure et inférieure de l’orbite, y compris le périoste. Aux côtés antérieur et postérieur du lambeau, assurez-vous que l’incision atteigne le plan fascial.
  3. Commencez la dissection avec la face antérieure de l’orbite à l’aide de ciseaux Stevens et d’une pince Adson.
    1. Élever le contenu orbital dans un plan subpériosté vers les parois orbitales à l’aide d’un élévateur périosté.
    2. Identifier et diviser les structures proches de la paroi orbitaire à l’aide d’un scalpel à lame n°15, incluant les insertions des muscles obliques et le plexus veineux orbitaire, qui sort de l’orbite pour rejoindre la veine frontale.
      REMARQUE : La veine frontale s’écoule dans la veine faciale, ce qui peut être sacrifié pour gagner du temps, à condition que la branche anastomotique avec la veine ophtalmique soit préservée.
  4. Poursuivre la dissection sur l’aspect postérieur de l’orbite. Avec un scalpel, réséquer le muscle masséter à son insertion zygomatique, suivi de la branche ascendante de la mandibule avec un coupe-os de Liston. Désarticuler manuellement le condyle en faisant tourner le fragment de mandibule vers l’extérieur.
  5. Divisez le ligament orbitaire s’étendant du processus zygomatique jusqu’à l’os frontal pour accéder à la portion orbitaire du muscle temporal. Réséquer le muscle temporal.
  6. Avec un élévateur périosté, créez un tunnel subpériosté sous l’arc zygomatique vers le bord orbitaire antérieur. Utilisez une scie alternative pour couper l’os. Identifiez l’artère ophtalmique située dans la partie inférolatérale du cône orbitaire sous le muscle temporal.
  7. Réséquez l’arc zygomatique et les parois orbitaires antéro-inférieures à l’aide d’un rongeur.
    REMARQUE : Ces étapes donnent accès à l’aspect inferolatéral du cône orbitaire et à son pédicule vasculaire.
  8. Identifier et disséquer avec de fins ciseaux Stevens et des pinces microchirurgicales les deux branches de l’artère ophtalmique au fur et à mesure qu’elles pénètrent dans le contenu orbitaire.
    REMARQUE : La plupart des vaisseaux (artère carotide externe et veine jugulaire superficielle) se trouvent sous la mandibule, à l’exception de la veine faciale, qui est superficielle à la mandibule.
  9. Après avoir isolé la longueur désirée de l’artère carotide externe et de la veine jugulaire, complétez la dissection en sectionnant le nerf optique, les nerfs oculomoteurs et le pédicule vasculaire à l’aide d’un scalpel.

3. Préparation à la perfusion

  1. Sur une table de chevet, dilater l’artère carotide à l’aide d’un dilatateur microchirurgical et insérer un angiocathéter. Fixez la canulation avec des liens en soie 3-0.
    REMARQUE : Dans ce protocole, un angiocathètère 18-G était utilisé pour toutes les artères. Si le pédicule artériel est court, il faut veiller à ne pas insérer le cathéter trop loin afin d’éviter la canulation sélective d’une seule des deux branches ophtalmiques. La veine jugulaire n’a pas besoin d’être canulée sauf si un système de perfusion en boucle fermée est utilisé, ce qui n’était pas le cas dans ce protocole.
  2. Pour rincer l’artère carotide, utilisez une seringue de 10 mL montée avec un capteur de pression identique à celui utilisé pour la perfusion. Utilisez 10 mL d’héparine (100 UI/mL) pour laver les vaisseaux afin que l’écoulement soit dégagé. Restez en dessous de 35 ± 5 mmHg, car une forte pression peut entraîner des lésions microvasculaires et une défaillance de perfusion.

4. Perfusion sous-normotherme des machines

  1. Reliez l’artère canulée du greffon au tube d’entrée du système de perfusion machine et placez le greffon dans le scal.
  2. Démarrez la pompe réglée à 2-4 mL/min.
    REMARQUE : Le débit et la pression de perfusion dépendent du protocole utilisé. Pour l’ACV, un schéma stable et à faible débit est utilisé pour prévenir les dommages capillaires et la formation d’œdèmes.
  3. Évaluer les paramètres de viabilité à chaque moment prédéfini, tant à l’entrée qu’à la sortie, à l’aide d’une seringue de 1 mL et en analysant les échantillons avec la machine du système de gaz sanguin (par exemple, métriques de gaz sanguins [pH, pCO2,pO 2, lactates, excès de base, bicarbonate], glucose, sodium, potassium, calcium, chlorure). Cela nous permet de calculer l’état métabolique du greffon selon les équations présentées dans le tableau 1.
    REMARQUE : Dans ce protocole, la perfusion dure 18 heures, et les échantillons de l’afflux et de l’écoulement sont prélevés toutes les heures pendant les 6 premières heures, puis toutes les 3 heures pendant les 12 heures restantes.

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Résultats

Un test de faisabilité préliminaire a été réalisé sur une période de 6 heures de SNMP, suivi de 2 heures de perfusion machine normotherme (PNN) avec du sang total afin d’évaluer la bonne reprise de l’ensemble du greffon et de simuler la replantation. Pendant la phase SNMP, un écoulement régulier a été observé, et la simulation de réperfusion sanguine totale a démontré une recoloration réussie de l’ensemble du greffon. Les paramètres de perfusion ont également confirmé la faisabilité de l...

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Discussion

Plus de vingt ans après les premiers cas cliniques, l’ACV continue de faire face à d’importants défis de préservation immunologique et ex vivo , limitant sa disponibilitégénéralisée à 37. Ces défis sont encore plus marqués dans le cas du WET, qui offre des perspectives passionnantes pour la restauration de la vision mais présente des obstacles uniques, tels que la réussite de la reconnexion du nerf optique, la préservation de la fonctionnalité des segment...

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Déclarations de divulgation

Certains auteurs déclarent des intérêts concurrents. Les Drs Uygun, Lellouch et Cetrulo ont déposé des demandes de brevet pertinentes pour cette étude. Les Drs Korkut Uygun et Basak Uygun ont un intérêt financier et siègent au conseil consultatif scientifique de Sylvatica Biotech Inc., une entreprise axée sur le développement de technologies de préservation des organes à taux élevé de zéro. Les intérêts concurrents pour les enquêteurs du MGH sont gérés par le MGB conformément à leurs politiques de conflit d’intérêts. Tous les auteurs restants déclarent qu’il n’y a pas de conflit d’intérêts.

Remerciements

Ce travail a été partiellement financé par les National Institutes of Health sous la subvention n° R01AR082825 (BEU), R01EB028782 (KU), DoD RTRP RT240044 (KU, AGL, CLC), Shriners Children’s 84308 (YB), et ARPA-H sous-subvention FY25.1065.001 (CLC), ainsi que par la National Science Foundation sous la subvention n° EEC 1941543 (KU). HO et YB ont reçu des financements de la Fondation des Gueules Cassées. Le soutien de la Société Française de Chirurgie Plastique, Reconstructrice et Esthétique (SOFCPRE, France) à HO et YB est grandement reconnu.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Pinces AdsonOutils scientifiques finement11019-12Outil chirurgical
Système d’oxygénation Affinity PixieMedtronicBBP241Oxygénateur
Angiocath (24 G)Becton Dickinson381112Cathéter de canulation
Albumine sérique de BovinSigma-AldrichA9647Composante de perfusation
Chlorure de calcium dihydréSigma-Aldrich223506Composante de perfusation
Dioxyde de carbone, oxygèneAirgasUN3156Mélange de dioxyde de carbone oxygène   ; GAS  ;
Cathéter 24 GDutscher921048Canulation artérielle
D-(+)-Glucose monohydrateSigma-Aldrich49159Composante de perfusation
DexaméthasoneSigma-AldrichD2915Composante de perfusation
DextranThermosciences406271000Composante de perfusation
Pinces dilatatricesAROSurgical11.946.1102Outil chirurgical
Excel  ;MicrosoftTableau Excel
Injection d’héparine sodiqueEugia Pharma63739-953-25Composante de perfusation
Humulin Insuline régulière humaineLilly0002-8215-01Composante de perfusation
Hydrocortisone sodique succinatePfizer0009-0011-03Composante de perfusation
LigaclipEthiconMCS20Clips vasculaires chirurgicaux
Coupe-os ListonOutils scientifiques finement16104-19Outil chirurgical
Chlorure de magnésium hexa-hydrateSigma-AldrichM9272Composante de perfusation
MasterFlex L/SCole-Parmer77200-32Pompe à rouleaux
Pinces microchirurgicalesOutils scientifiques finement11253-20Outil chirurgical
Élévateur périostéAROSurgical46.415.18Outil chirurgical
Polyéthylène glycol 35000Sigma-Aldrich25322-68-3Composante de perfusation
Chlorure de potassiumSigma-Aldrich7447-40-7Composante de perfusation
Moniteur de pression, portable, PM-P-1Instrumentation des systèmes vivantsPM-P-1Capteur de pression
Prism  ;GraphPadv. 10.1.1Logiciels d’analyse statistique
Radnoti  ; Chambre de conformité du piège à bullesRadnoti130149Piège à bulles
RAPIDPoint 500Siemens500Système de gaz sanguins
Scie réiproquanteStryker5100-37Outil chirurgical
RongeurOutils scientifiques finement16002-18Outil chirurgical
Lame de scalpel (n15)Outils scientifiques finement10015-00Outil chirurgical
Lame de scalpel (n23)Outils scientifiques finement10023-00Outil chirurgical
Suture en soie 3-0EthiconP683HSuture
Bicarbonate de sodiumSigma-AldrichS5761Composante de perfusation
Chlorure de sodiumSigma-AldrichS9888Composante de perfusation
Hydroxyde de sodiumSigma-Aldrich72068Composante de perfusation
Phosphate de sodium monobasique dihydrate   ;Sigma-Aldrich71505Composante de perfusation
Ciseaux StevensAROSurgical07.367.13Outil chirurgical
Seringue 1 mLBD309659Acquisition d’échantillons
Seringue 10 mLDutscher300912Rinçage de greffe
Caméra thermiqueFlir Onehttps://www.flir.fr/products/flir-one-gen-3/?vertical=condition+monitoring&segment=solutionsSurveillance de la température de perfusion
Tubulure (n° ; 16)Masterflex13-310-282Installation de perfusion machine
Chlorhydrate de vancomycineSlate Run Pharmaceuticals70436-021-82Composante de perfusation

Références

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