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Dissection des muscles de vol indirect de Drosophila melanogaster pour les approches microscopiques

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DOI :

10.3791/69185

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7 novembre 2025

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1Division of Biological and Biomedical Systems, School of Science and Engineering, University of Missouri Kansas City

Dans cet article

Résumé

La drosophile est un modèle puissant pour comprendre les mécanismes fondamentaux de la myogenèse. Ce protocole de dissection et de préparation des hémisections du thorax permet l’analyse microscopique des muscles en vol indirect à partir des stades nymphal et adulte. Ce protocole permet l’imagerie confocale de la morphologie cellulaire, de la localisation des protéines, de la structure musculaire et de multiples autres aspects de la myogenèse.

Résumé

Les muscles de vol indirect (IFM) de Drosophila melanogaster constituent un modèle génétique puissant pour explorer les principes fondamentaux de la myogenèse. Le mécanisme contractile et de nombreux composants du sarcomère sont conservés des mouches aux vertébrés, ce qui permet d’étudier les processus cellulaires de la régulation transcriptionnelle et du traitement de l’ARN au métabolisme et à la mécanobiologie qui dirigent et affinent le développement musculaire. Beaucoup de ces voies cellulaires sont altérées dans les myopathies humaines, et les études IFM fournissent des informations pertinentes sur l’étiologie moléculaire des maladies musculaires. En particulier, les mouches sont bien adaptées à la microscopie pour analyser la morphologie et la fonction des myofibres et des sarcomères tout au long du processus de myogenèse IFM, de la spécification des myoblastes à la formation, à la maturation et à l’entretien des myofibrilles. Ici, un protocole est présenté pour la dissection des IFM de D. melanogaster à des points temporels nymphaux et adultes pour les approches microscopiques. Des protocoles illustrés sont fournis pour la dissection de l’hémithorax des IFM de la nymphe tardive et de l’adulte, ainsi que pour la dissection à livre ouvert des IFM de la nymphe précoce. Les procédures de fixation, de coloration et de montage d’échantillons ainsi que les artefacts de dissection courants sont décrits, avec des données représentatives démontrant la compatibilité de la dissection IFM avec différents réactifs de fixation. Ces protocoles sont appliqués pour étudier l’allèle hypomorphe SmnE33 du motoneurone de survie de la protéine de liaison à l’ARN (Smn) 26 h après la formation de la puparium (APF), 72 h APF, et chez les IFM adultes, fournissant de nouvelles informations sur un modèle d’atrophie motrice spinale (SMA) et illustrant l’utilité générale de ce protocole. Ce protocole détaillé facilite l’accès au système de modèle IFM et l’acquisition de données de microscopie de haute qualité pour étudier les principes de la myogenèse.

Introduction

Les animaux ont des centaines de muscles qui contrôlent différents mouvements, de la marche à la facilitation de la parole en passant par la préhension d’un outil. Pour soutenir un tel éventail de fonctions, les muscles diffèrent en termes de taille, d’attachement, de capacité contractile, de métabolisme et d’expression génique1. L’un des principaux objectifs du domaine de la biologie musculaire est de comprendre comment ces différences structurelles et fonctionnelles apparaissent au cours du développement et sont modifiées dans les maladies musculaires2. La contraction musculaire est alimentée par des sarcomères construits avec des filaments minces contenant de l’actine ancrés au niveau du disque Z qui s’interdigitent avec des filaments épais contenant de la myosine bipolaire ancrés à la ligneM 3. Les sarcomères sont organisés de bout en bout en myofibrilles, et cette disposition régulière dans le muscle strié apparaît sous forme de bandes claires et sombres alternées au microscope4, fournissant une méthode visuelle pratique pour surveiller les changements dans l’assemblage et l’organisation des sarcomères. En combinaison avec la génétique et les approches biochimiques, la microscopie a fourni des informations importantes sur les processus cellulaires tels que la régulation transcriptionnelle, le traitement de l’ARN, le métabolisme et la mécanotransduction 5,6,7 qui instruisent et affinent le développement et la fonction musculaires. Beaucoup de ces processus cellulaires sont perturbés dans les myopathies humaines et les troubles neuromusculaires 8,9, soulignant l’importance de comprendre le développement musculaire pour mieux comprendre l’étiologie des maladies musculaires. Les progrès du génie génétique, qui permettent la manipulation de cellules individuelles et le marquage endogène des protéines 10,11, associés aux progrès technologiques en matière d’acquisition d’images et de résolution12,13, garantissent l’importance continue de la microscopie dans la recherche musculaire. Les systèmes modèles avec des protocoles clairs et faciles à mettre en œuvre pour la dissection musculaire et la préparation d’échantillons sont donc précieux dans le domaine musculaire.

Les muscles de vol indirect (IFM) de D. melanogaster constituent un modèle puissant et bien caractérisé pour étudier les principes de base de la myogenèse8. Les IFM se composent de six muscles dorsaux-longitudinaux (DLM) par hémithorax qui se forment sur des matrices de muscles larvaires et de sept fibres musculaires dorsales-ventrales (DVM) qui sont construites de novo au cours du développement nymphal14. En raison de leur accessibilité près de la ligne médiane, de nombreuses études de l’IFM se concentrent sur les DLM, le plus grand muscle des mouches adultes couvrant toute la longueur de 1 mm du thorax15. Au début de la nymphose, les myoblastes IFM migrent de leur niche sur la charnière du disque alaire vers le thorax, où ils fusionnent pour former des myotubes syncytial16. Après fixation tendineuse autour de 24 h APF à 27 °C, les myofibres IFM organisent progressivement leur cytoplasme et leur cytosquelette, se compactent, et initient la myofibrillogenèse à partir de 30-32 h APF17. De nouveaux sarcomères sont ajoutés aux myofibrilles et les myofibres se développent pour remplir le thorax jusqu’à environ 48 h APF. Les IFM subissent ensuite un processus de maturation concordant avec des modifications de la transcription et de l’épissage qui favorise l’acquisition des propriétés métaboliques et contractiles de l’adulte et l’activation de l’étirement18. Les mouches adultes s’approchent de l’épave nymphale entre 90 h et 100 h APF à 27 °C, et à environ 100 h APF (femelles à environ 98 h APF et mâles à environ 102 h APF) à 25 °C19. Les IFM sont un système de modèle polyvalent et pertinent. Ils peuvent être surveillés à tous les stades de la myogenèse, sont morphologiquement et fonctionnellement distincts des autres types de myofibres chez la mouche et bénéficient d’un large éventail d’outils génétiques accessibles et d’approches de manipulation 8,20. Le mécanisme contractile, la morphologie de base du sarcomère et de nombreux composants structurels sont conservés des mouches aux vertébrés5, ce qui permet de transférer les principes myogéniques des mouches aux humains. En effet, des modèles mouches de maladies neuromusculaires telles que la dystrophie myotonique, l’atrophie motrice spinale (SMA), les myopathies myofibrillaires et les actinopathies ont fourni des informations étiologiques et thérapeutiques21,22. Notamment, les mouches sont bien adaptées à la microscopie pour analyser la morphologie des myofibres et des sarcomères tout au long de la myogenèse, de la spécification des myoblastes à la myofibrillogenèse en passant par la maturation et l’entretien des sarcomères.

Les IFM de la drosophile sont utilisés pour des applications de microscopie depuis plus de quatre décennies, contribuant grandement à la compréhension de la croissance et du développement musculaires8. Au cours de cette période, les protocoles de dissection IFM ont été continuellement adaptés au fur et à mesure que la technologie progressait, ce qui a conduit à un large éventail de protocoles présentés à des niveaux de détail variables, optimaux pour certains et sous-optimaux pour d’autres techniques d’imagerie. Par exemple, les protocoles développés pour la microscopie électronique impliquent des conditions de fixation fortes, une coupe ultrafine et une coloration par contraste avec des métaux lourds 3,23,24,25, mais ne sont pas optimaux pour la microscopie optique. Les protocoles mis au point pour disséquer rapidement les IFM du thorax en vue de leur utilisation dans des tests biochimiques ou des analyses moléculaires26,27 perdent le contexte tissulaire et peuvent perturber la structure des myofibrilles, et sont donc sous-optimaux pour les approches de microscopie. Des approches de dissection ont été développées pour l’analyse des muscles larvaires ou des muscles abdominaux adultes20,28, mais ne sont pas optimales pour l’isolement des IFM intacts. Les approches d’imagerie en direct nécessitent soit des dissections mini-invasives, soit des milieux spéciaux pour maintenir les tissus IFM en vie pendant le processus d’imagerie29,30, et n’impliquent pas les étapes de fixation nécessaires pour préserver les muscles pour l’immunohistochimie. Il existe plusieurs protocoles pour l’enrobage de paraffine ou la cryosection des tissus IFM et sont compatibles avec l’histochimie ou la coloration des anticorps 27,31,32, mais ces approches impliquent généralement la congélation et la déshydratation des tissus qui peuvent modifier l’ultrastructure musculaire et limiter la reconnaissance de certains antigènes par les anticorps primaires. Les protocoles qui fixent directement les IFM préservent la morphologie musculaire et limitent les changements dans la conformation de l’antigène et sont souhaitables pour de nombreuses expériences d’immunohistochimie24. Cependant, ces protocoles sont également destinés à des applications spécifiques, par exemple, des protocoles qui dissocient les IFM permettant l’analyse de myofibrilles uniques par fluorescence, cryoEM ou microscopie à superrésolution 20,33,34. D’autres exemples incluent des protocoles permettant de disséquer des fibres IFM intactes du thorax32,35 ou de générer des préparations entières ou d’hémithorax 20,32,36 qui permettent d’analyser à la fois les myofibres et les sarcomères dans un contexte intact. Il peut être difficile pour un nouvel utilisateur de faire le tri parmi le grand nombre de protocoles existants, dont la majorité sont basés sur du texte. Les stagiaires et les chercheurs de premier cycle bénéficieraient d’un protocole de dissection IFM détaillé tel qu’appliqué aux applications standard d’immunohistochimie.

Cet article comprend une série de protocoles pour la dissection et la préparation des IFM de D. melanogaster aux stades nymphal et adulte pour les approches de microscopie immunohistochimique. Cette approche a été utilisée dans des publications récentes retraçant les fonctions développementales des protéines de liaison à l’ARN Bruno137 et Rbfox138 tout au long de la myogenèse IFM. Le protocole comprend des illustrations détaillées et des images étape par étape pour guider les utilisateurs potentiels à travers la dissection de l’hémithorax IFM adulte et de la nymphe tardive (48 h à 96 h APF), où le thorax est coupé en deux le long de la ligne médiane, gardant la structure des myofibres intacte. De plus, ce protocole couvre la dissection à livre ouvert des stades nymphaux précoces (8 h à 48 h APF), où la partie ventrale du thorax est fendue et soulevée, comme l’ouverture d’un livre, pour exposer les IFM intactes attachées à l’épiderme dorsal. D’autres étapes du protocole comprennent la fixation, la coloration et le montage d’échantillons, et des données représentatives démontrent que cette approche est compatible avec diverses méthodes de fixation pour préparer les tissus à l’immunohistochimie et à la microscopie à fluorescence. Des exemples représentatifs sont fournis pour aider les nouveaux utilisateurs à identifier les artefacts de dissection courants. Le protocole est appliqué pour analyser le phénotype développemental IFM de SmnE33, un allèle hypomorphe du motoneurone de survie (Smn) utilisé comme modèle de mouche de l’atrophie motrice spinale (SMA)21,39, à 26 h APF, 72 h APF, et chez les IFM adultes. Les données présentées ici donnent un aperçu de la fonction musculaire spécifique de Smn et soulignent l’applicabilité de ce protocole de dissection pour étudier le développement musculaire et l’étiologie des maladies musculaires.

Protocole

Énoncé éthique :
Toutes les expériences de ce protocole utilisent Drosophila melanogaster, un insecte holométabole. Les invertébrés ne sont pas soumis à la réglementation sur le bien-être animal aux États-Unis d’Amérique et leur utilisation ne nécessite pas d’approbation éthique. Tous les travaux ont été menés conformément aux directives standard de biosécurité institutionnelle et de sécurité en laboratoire, et ont été approuvés par le comité de biosécurité institutionnel de l’Université du Missouri à Kansas City sous le numéro de protocole 21940 (22-11).

1.Dissection de l’hémithorax d’un IFM adulte (Figure 1)

  1. Rassemblez les fournitures nécessaires, y compris deux pinces Dumont #5 avec embouts biologiques, une pince Dumont #3, une paire de ciseaux à ressort Vannas, une pipette en plastique, un pinceau, une plaque à 24 puits, des lingettes non pelucheuses, une lame de microscope et des lames de cryostat (voir le tableau des matériaux). Préparez 1 solution PBS, PBS-T 0,05 % et solution de fixation (voir le fichier supplémentaire 1). Un organigramme de la dissection suivante de l’hémithorax chez l’adulte est disponible (figure supplémentaire 1).
  2. Prélever des adultes du génotype et de l’âge souhaités (par exemple, nouvellement fermé, adulte de 1 jour ou adulte de 5 jours). Anesthésie les mouches d’échantillon sur duCO2 ou de la glace.
    REMARQUE : Les mouches utilisées dans ce protocole ont été élevées selon un cycle de 12 heures entre une journée et une nuit de 12 heures dans un incubateur à température et humidité contrôlées. Les drosophiles sont cultivées en standard à 25 °C ou 27 °C, et peuvent être cultivées à 18 °C, ce qui prolonge le cycle de croissance de 10 jours à environ 20 jours.
  3. À l’aide d’une pipette en plastique, transférez une goutte de 1x PBS40 sur une lame de microscope sous un microscope à dissection stéréoscopique.
  4. Transférez les mouches de l’échantillon dans la goutte PBS en petits groupes à l’aide d’un pinceau ou d’une pince (figure 1A). Retirez la tête (figure 1B), les ailes (figures 1C à D) et l’abdomen (figure 1E) à l’aide de ciseaux à ressort Vannas. Laissez les pattes attachées (Figure 1F).
  5. Transférez doucement les thoraces à l’aide d’une brosse ou d’une pince dans une solution de fixation de 500 μL dans un puits d’une plaque à 24 puits. Fixez pendant la durée souhaitée (généralement 15-60 min) sur un nutator/shaker à bascule.
    REMARQUE : Ce protocole est compatible avec plusieurs tampons de fixation, y compris le paraformaldéhyde, le glutaraldéhyde, le méthanol, la solution de glyoxal et autres. Voir les résultats représentatifs et le dossier supplémentaire 1 pour plus de détails sur l’optimisation des conditions de fixation. Les fixateurs doivent être manipulés à l’aide de gants et d’un équipement de protection individuelle (EPI) approprié, conformément aux directives de votre établissement en matière de produits chimiques dangereux.
  6. Retirer le fixateur à l’aide d’une pipette de 200 μL et laver dans 1 mL de PBS-T à 0,05 % sur un nutateur/agitateur à bascule pendant 5 minutes à température ambiante.
    REMARQUE : Jetez le fixateur en suivant les directives de l’établissement en matière de produits chimiques dangereux. Pour la plupart des antigènes, les thoraces fixes peuvent être conservés dans 1 mL de PBS-T à 0,05 % jusqu’à 2 semaines à 4 °C avant la coupe et la coloration. Des concentrations plus élevées de Triton X-100 doivent être testées avant utilisation, car de longues incubations dans le détergent peuvent dégrader la structure du sarcomère.
  7. Retirer la mémoire tampon à l’aide d’une pipette de 200 μL et transférer les toraques à l’aide d’une brosse ou d’une pince jusqu’à une goutte de PBS-T à 0,05 % sur une lame de microscope sous un microscope à dissection stéréoscopique.
  8. Orientez le thorax avec le scutellum pointé vers le haut et stabilisé entre une paire de pinces Dumont #3 (Figure 1G-H).
  9. Faites glisser une lame de cryostat sur le thorax pour entailler le scutellum (figures 1H, J, L), puis coupez en un seul mouvement doux vers le bas le long de la ligne médiane (figure 1I, J, L - N) pour générer l’hémisection du thorax exposant les IFM (figure 1K).
    REMARQUE : Il est important que la cuticule soit « entaillée » ou fissurée avant de couper à travers les IFM pour éviter d’étirer les artefacts qui endommagent la structure du sarcomère. Ne « sciez » pas la lame d’avant en arrière, car ce mouvement endommage mécaniquement les IFM, entraînant des myofibrilles effilochées. Trop de tampon déstabilise le thorax entre les pinces et rend la coupe plus difficile. D’autres approches consistent à stabiliser les thoraces une à la fois à l’aide d’un ruban adhésif double pour faciliter les coupes, ainsi qu’à couper à partir de la face ventrale du thorax.
  10. Déplacez les deux moitiés du thorax à une position sur la lame où elles resteront recouvertes de tampon pour éviter de se dessécher, mais ne gênent pas les futures coupes. Répétez les étapes 1.8-1.10 jusqu’à ce que tous les thoraces aient été coupés.
  11. À l’aide d’une pince, transférez les hémisections thoraciques de la lame de microscope à 500 μL de PBS-T à 0,05 % dans un puits d’une plaque à 24 puits et procédez au blocage et à l’immunocoloration (voir section 4 ci-dessous).

2. Dissection hémithorax de la DFI de la nymphe tardive (~48 h à 96 h APF) (Figure 2, Figure 3)

  1. Stade des pupes du génotype souhaité et de l’âge jusqu’au point choisi dans le développement de la nymphe (figure 2). Prélever des pré-pupes blanches mâles ou femelles (figures 2A, B) à l’aide d’un pinceau humide et les incuber sur du papier filtre mouillé dans une boîte de culture cellulaire de 60 mm. La stadification de la nymphe et l’élimination de la nymphe ont été décrites précédemment20,26.
    REMARQUE : Les pupes subissent de multiples changements morphologiques à mesure qu’elles vieillissent, tels que l’éversion de la tête et la pigmentation de la nymphe, des yeux et des soies19,41 (figure 2C). Ces caractéristiques morphologiques peuvent servir de guide approximatif pour déterminer l’âge d’une nymphe (figure 2D-E) et pour identifier les pupes qui ne se développent pas normalement (figure 2F). Cependant, pour garantir une chronologie précise de la stadification, il est recommandé de collecter des pré-pupes blanches dans des fenêtres de temps étroites, par exemple toutes les 30 minutes ou toutes les 2 heures. Des points temporels étroitement échelonnés sont nécessaires pour distinguer les changements majeurs dans la structure du cytosquelette et la longueur des myofibres qui se produisent de 24 h à 35 h APF, ainsi que pour distinguer les différences de structure du sarcomère à 35h, 48 h, 60 h, 72 h, 80 h et 90 h APF18,42.
  2. Rassemblez les fournitures nécessaires, y compris un pinceau, deux pinces Dumont #5 avec des pointes de biologie, une paire de ciseaux à ressort Vannas, du ruban adhésif double, une lame de microscope, une pipette en plastique, une plaque à 24 puits, des lingettes Kimwipes et des lames de cryostat (voir le tableau des matériaux). Préparez 1 solution PBS, PBS-T 0,05 % et solution de fixation (voir le fichier supplémentaire 1). Un organigramme de la dissection suivante de l’hémithorax nymphal est disponible (figure supplémentaire 2).
  3. Au moment souhaité, utilisez un pinceau pour transférer les pupes du papier filtre sur une bande de ruban adhésif double collée à une lame de microscope sous un microscope à dissection stéréoscopique à un grossissement de 10-20x (figures 3A,B). Alignez les pupes sur le ruban dans la même direction, côté ventral vers le bas.
  4. À l’aide d’une paire de pinces #5, ouvrez l’avant de la nymphe de la première nymphe en retirant doucement l’opercule (la région au-dessus de la tête) (Figure 3C, D, I).
  5. Utilisez soigneusement une pince #5 pour fendre le long de la nymphe juste à l’arrière de l’aile et décollez la nymphe de la nymphe par incréments de 1 à 2 mm. Fixez la nymphe sur le ruban adhésif double pendant que l’on travaille de l’avant vers l’arrière (Figure 3E - G, I). Évitez de piquer la chrysalide elle-même, insérez plutôt l’extrémité de la pince entre la nymphe et la membrane basale/sac nymphal entourant la nymphe.
  6. Une fois l’étui retiré, utilisez un mouvement de ramassage avec la pince pour le soulever (Figure 3H, I) et transférez doucement la chrysalide hors de l’étui en une goutte de 1x PBS sur une deuxième lame de microscope (Figure 3J, K) pour éviter la déshydratation. Répétez les étapes 2.4 à 2.6 (figure 3I) jusqu’à ce que toutes les pupes aient été retirées de la nymphe.
  7. Retirez l’abdomen des pupes disséquées à l’aide de ciseaux à ressort Vannas (figure 3L).
    REMARQUE : L’abdomen est enlevé pour permettre une meilleure pénétration par fixateur dans l’étape suivante. Pour éviter d’endommager le thorax, coupez directement dans l’abdomen, en laissant jusqu’à 30 % de l’abdomen attaché au thorax.
  8. Transférez doucement la tête de la nymphe avec le thorax (figure 3M) à l’aide d’une brosse ou d’une pince jusqu’à 500 μL de solution de fixation dans un puits d’une plaque à 24 puits. Fixez pendant la durée souhaitée (généralement 15-60 min) et lavez dans 1 mL de PBS-T à 0,05 % comme décrit aux étapes 1.5-1.6.
  9. Retirer le tampon à l’aide d’une pipette de 200 μL et transférer les métaux à l’aide d’un pinceau ou d’une pince jusqu’à une goutte de PBS-T à 0,05 % sur une lame de microscope sous un microscope à dissection stéréoscopique sous un grossissement de 10x.
  10. Séparez un échantillon du reste et orientez-le avec le côté ventral vers le bas et stabilisé entre une paire de pinces Dumont #3 (figure 3N).
  11. Faites glisser une lame de cryostat sur le thorax jusqu’à ce que la membrane basale et la cuticule soient ouvertes, puis coupez-la en un seul mouvement doux vers le bas le long de la ligne médiane (Figure 3O) pour générer les hémisections du thorax exposant les IFM (Figure 3P).
    REMARQUE : Ne « sciez » pas la lame d’avant en arrière, car ce mouvement endommage mécaniquement les IFM, entraînant des myofibrilles effilochées. Trop de tampon déstabilise le thorax entre les pinces et rend la coupe plus difficile. Les thoraces nymphales peuvent être coupées avec la tête attachée et orientées vers la gauche ou la droite.
  12. Déplacez les deux moitiés du thorax à une position sur la lame où elles resteront recouvertes de tampon pour éviter de se dessécher, mais ne gênent pas les futures coupes. Répétez les étapes 2.10-2.12 jusqu’à ce que tous les thoraces aient été coupés.
  13. À l’aide d’une pince, transférez les hémisections thoraciques de la lame de microscope à 500 μL de PBS-T à 0,05 % dans un puits d’une plaque à 24 puits et procédez au blocage et à l’immunocoloration (voir l’étape 4 ci-dessous).

3. Dissection à livre ouvert de la MPIF nymphale précoce (~15 h à 48 h APF) (Figure 4)

  1. Stade des pupes du génotype souhaité et de l’âge jusqu’au point choisi dans le développement de la nymphe (figure 2), comme décrit ci-dessus (étape 2.1).
    REMARQUE : Pour les dissections à livre ouvert, les pupes doivent être disséquées en groupes de pas plus de 8 à 10 mouches.
  2. Rassemblez le matériel nécessaire, y compris un pinceau, deux pinces Dumont #5 avec embouts biologiques, une paire de ciseaux à ressort Vannas, du ruban adhésif double, une lame de microscope, une pipette en plastique, un plat de dissection en silicone noir, un plat de coloration en verre noir, des épingles à insectes et des lingettes non pelucheuses (voir le tableau des matériaux). Préparez 1 solution PBS, PBS-T 0,05 % et solution de fixation (voir le fichier supplémentaire 1). Un organigramme de la dissection à livre ouvert de nymphe suivante est disponible (figure supplémentaire 3).
  3. Au moment souhaité, retirez les pupes de la boîte nymphale comme décrit aux étapes 2.3 à 2.6. Transférez les pupes dans une boîte de dissection en silicone noir remplie de 1x PBS après les avoir retirées de la boîte nymphale (Figure 4A).
  4. Une fois que toutes les pupes sont libérées de l’enveloppe nymphale, utilisez une pince Dumont #5 pour surmonter la tension superficielle et poussez doucement les pupes disséquées vers la surface du silicium. Disposez les pupes en ligne près du centre du plat (Figure 4B).
  5. Insérez deux aiguilles à insectes à l’aide d’une pince Dumont #5 dans l’abdomen de chaque chrysalide pour la maintenir en place (figures 4C et D). Assurez-vous que les pupes sont orientées avec leur côté ventral vers le haut.
  6. À l’aide de ciseaux à ressort Vannas, ouvrez la membrane basale et la région antérieure de la tête de chaque nymphe (figure 4E).
  7. Insérez les ciseaux dans l’ouverture et coupez le long des côtés droit et gauche de chaque chrysalide (Figure 4F, G, Q). Positionnez les ciseaux et coupez juste en dessous de l’encoche en développement jusqu’à la jonction entre le thorax et l’abdomen pour retirer les pattes et les ailes avec la partie ventrale. Assurez-vous que les ciseaux sont insérés horizontalement et qu’ils n’entrent pas en contact avec la partie dorsale du thorax (figure 4Q).
  8. À l’aide d’une pince Dumont #5, saisissez et soulevez la partie ventrale de la chrysalide et retirez-la à l’aide de ciseaux à ressort Vannas (figures 4H, I, Q).
  9. Retirez le cerveau, le cordon nerveux ventral (VNC), la trachée et l’intestin à l’aide d’une pince Dumont #5 (Figure 4J, K, Q). Veillez à ne pas déranger les IFM en développement, qui se trouvent directement sous la trachée et les VNC attachés à l’épiderme sur la partie dorsale du thorax.
  10. Clipsez l’extrémité d’une pointe de pipette de 200 μL pour créer une ouverture plus large. À l’aide d’une pipette de 200 μL avec l’embout coupé, lavez doucement 1 tampon PBS sur le thorax afin d’éliminer la plupart des corps adipeux restants pour exposer les IFM (Figure 4L, M). Soyez doux pour éviter de déchirer les attaches des tendons qui relient les myofibres à l’épiderme.
  11. À l’aide de ciseaux à ressort Vannas, on coupe la ligne médiane du thorax dorsal, créant ainsi deux « folioles » contenant des IFM (figure 4N).
  12. Coupez les feuillets du thorax dorsal en les éloignant de l’abdomen à l’aide de ciseaux (figures 4O, Q) et transférez les feuillets dans 300 μL de solution fixatrice dans une boîte en verre noir à l’aide d’une pince Dumont #5 (figure 4P). Saisissez les feuillets au niveau de la tête avec la pince pour éviter d’endommager les myofibres ou les tendons IFM.
  13. Fixez pour la durée souhaitée (généralement 15 min). À l’aide d’une pipette de 200 μL, retirez délicatement le fixateur et lavez-le dans 500 μL de PBS-T à 0,05 %. Procédez au blocage et à l’immunocoloration (voir l’étape 4 ci-dessous).
    REMARQUE : Ne pas nuter ou rocher des échantillons dans des plats en verre noir. Les attaches musculo-tendineuses aux premiers stades nymphaux sont très fragiles et se déchirent avec une agitation tampon constante, entraînant une perte d’IFM. Pipetez lentement et soigneusement les bords du tampon dans la boîte pour éviter d’aspirer les échantillons dans la pointe de la pipette lors du changement de solution.

4. Immunomarquage et histochimie d’échantillons IFM fixés

  1. Rassemblez les fournitures nécessaires, y compris une pipette, des pointes de pipette et les anticorps ou colorants requis. Préparez du PBS-T à 0,05 %, une solution bloquante et des mélanges d’anticorps et de colorants (voir le fichier supplémentaire 1).
  2. Pipeter la solution de lavage (0,05 % PBS-T) sur les échantillons et ajouter la solution de blocage. Incuber les échantillons dans une solution bloquante pendant au moins 30 minutes à température ambiante (avec balancement pour les étapes 1 et 2, sans balancement pour l’étape 3).
    REMARQUE : Les échantillons peuvent également être bloqués pendant la nuit à 4 °C. Dans ce protocole, les échantillons ont été bloqués dans 5 % de sérum de chèvre normal (NGS) dans 0,05 % de PBS-T. De plus amples informations sur les options de solution de blocage sont fournies dans le fichier supplémentaire 1.
  3. Retirez la solution de blocage des thoraces à l’aide d’une pipette. Ajouter le mélange d’anticorps primaires et incuber au moins 2 h à température ambiante ou toute la nuit à 4 °C (avec balancement pour les étapes 1 et 2, sans balancement pour l’étape 3).
    REMARQUE : Ce protocole est compatible avec la majorité des anticorps primaires. Les anticorps doivent être dilués dans une solution bloquante. Les dilutions des anticorps primaires testées avec ce protocole vont de 1:10 à 1:2000 et sont déterminées expérimentalement pour chaque anticorps individuel. De plus amples détails sur l’optimisation de la coloration primaire des anticorps sont fournis dans le fichier supplémentaire 1.
  4. Prélever le mélange d’anticorps primaires à l’aide d’une pipette et laver les échantillons 3 fois pendant 10 minutes chacun, dans du PBS-T à 0,05 %.
  5. Ajouter un mélange d’anticorps secondaires ou de colorant à l’échantillon. Recouvrez l’échantillon d’un morceau de papier d’aluminium pour minimiser le blanchiment. Incuber au moins 2 h à température ambiante ou toute la nuit à 4 °C (avec balancement pour les étapes 1-2, sans balancement pour l’étape 3).
    REMARQUE : La plupart des anticorps secondaires et des colorants cellulaires fluorescents peuvent être utilisés avec ce protocole. De nombreux anticorps secondaires sont utilisés à une dilution de 1:500. Dans les données représentatives ci-dessous (voir Résultats représentatifs), les noyaux ont été marqués avec du DAPI (1 mg/mL, dilué 1:1000 dans 0,05 % de PBS-T) et de la F-actine avec de la rhodamine phalloïdine (300 unités/mL de stock, dilué 1:500 dans 0,05 % de PBS-T).
  6. Retirez le mélange secondaire/colorant à l’aide d’une pipette et lavez les échantillons 4 fois pendant 10 min chacun, dans 0,05 % de PBS-T à température ambiante. Passez au montage (étape 5) directement après le lavage.

5. Montage d’échantillons colorés sur des lames pour l’analyse microscopique (Figure 5)

  1. Rassemblez les fournitures nécessaires, y compris un pinceau, des pinces, des lames de microscope givrées, des lamelles (épaisseur #1), du vernis à ongles transparent, du support de montage et des lingettes non pelucheuses (voir le tableau des matériaux).
  2. Étiquetez la zone d’écriture givrée d’une lame de microscope avec le numéro d’échantillon approprié ou les informations d’identification souhaitées (date, génotype, anticorps, numéro de lame, etc.).
  3. Ajouter des lamelles (lamelles #1), en laissant environ 1 cm entre les lamelles pour la mise en place de l’échantillon (figure 5A-C). Utilisez une petite goutte de glycérol à 50 % pour maintenir les entretoises en place (Figure 5A, D).
    REMARQUE : Les entretoises empêchent la distorsion de l’échantillon lors du montage d’échantillons épais. Les thoraces adultes ont généralement besoin d’une entretoise épaisse à 2 lamelles, les thoraces APF 48 h d’une entretoise épaisse à 1 lamelle et les dépliants à livre ouvert sans entretoiseur.
  4. Ajouter une goutte de milieu de montage dans le puits entre les entretoises de lamelle, ou au centre de la lame de microscope si l’on monte des échantillons de nymphes précoces (figure 5C-D). Placez la lame sous un microscope stéréo à dissection.
    REMARQUE : Plusieurs types de supports de montage sont disponibles. Si vous utilisez un média autodurcissant, envisagez un média avec un temps de durcissement de plusieurs heures pour laisser suffisamment de temps pour orienter correctement les échantillons avant que le média ne durcisse. Il a été démontré que les milieux de montage influencent les dimensions du sarcomère43, 44, 45, de sorte que le même réactif doit être utilisé pour tous les échantillons d’une expérience.
  5. À l’aide d’une pipette, retirez le plus de tampon de lavage possible des échantillons. Transférez immédiatement les échantillons à l’aide d’une pince ou d’un pinceau sur la goutte de support de montage sur la lame (figure 5E).
  6. À l’aide de la pince Dumont #5, organisez les échantillons en rangées et en colonnes, assurez-vous qu’ils ne se chevauchent pas et orientez les thoracs avec les IFM vers le haut (Figure 5F, J, Q, S). L’orientation peut nécessiter de retourner soigneusement les échantillons où les poils/cuticules sont tournés vers le haut (Figure 5G, H, K, L, R). Veillez à ne pas toucher les IFM, car le contact endommagerait la structure du sarcomère (voir les résultats représentatifs).
  7. Ajouter avec précaution une lamelle #1 (18 x 18 mm ou 22 x 22 mm) sur les échantillons de thorax (figure 5M). Si vous utilisez des entretoises, appuyez doucement sur la lamelle jusqu’à ce qu’elle entre en contact avec les entretoises de chaque côté des échantillons (figure 5N).
  8. À l’aide d’une pointe de pipette ou d’un compte-gouttes, remplissez la zone de l’échantillon avec un milieu de montage jusqu’à ce que tous les thoraces soient enfermés (figure 5O). Évitez de créer des bulles d’air qui perturberaient l’acquisition de l’image.
  9. Utilisez du vernis à ongles transparent pour sceller le montage humide. N’oubliez pas de sceller à la fois la lamelle de l’échantillon et les lamelles d’espacement (Figure 5P,S).
    REMARQUE : Évitez d’utiliser une couche de finition ou un vernis à ongles à séchage rapide, car ils scellent mal et des bulles d’air se forment à mesure que le support de montage s’évapore.
  10. Sécher les lames pendant 10 min à température ambiante. Conserver dans un boîtier à glissière à 4 °C. Les diapositives peuvent être numérisées pendant plusieurs jours ou semaines.
  11. Imagez des échantillons sur un microscope fluorescent, un microscope confocal ou un autre système selon le plan expérimental. Des protocoles d’acquisition et d’analyse d’images sont disponibles ailleurs 14,30,46,47,48.

Résultats

Le protocole de dissection présenté ci-dessus peut être utilisé pour générer des échantillons de haute qualité pour l’analyse microscopique de la morphologie des myofibres IFM et des sarcomères dès 8 heures après la formation du puparium (APF) en utilisant la méthode à livre ouvert (étape 3) jusqu’aux stades adultes en utilisant l’approche de dissection de l’hémithorax (étapes 1 et 2). Ces dissections ont été appliquées pour étudier la formation des muscles et du sarcomère 18,42,49, la fonction du facteur de transcription 50,51 et la régulation de l’ARN37,38, entre autres. Les résultats représentatifs présentés ci-dessous démontrent la compatibilité de ce protocole avec différentes méthodes de fixation, détaillent les artefacts de dissection courants et utilisent le phénotype du mutant SmnE33 pour illustrer l’utilité de ce protocole pour répondre aux questions morphologiques et de biologie cellulaire dans le modèle IFM.

La dissection IFM est compatible avec plusieurs méthodes de fixation

Un aspect essentiel de la préparation des échantillons d’histochimie ou d’immunofluorescence est la préservation précise des structures cellulaires par fixation. Les fixateurs préservent la structure et la morphologie des tissus en empêchant la dégradation et en stabilisant les structures protéiques et lipidiques par réticulation52,53. Différentes classes de fixateurs, par exemple, à base d’aldéhyde par rapport aux solvants organiques, ont des efficacités de pénétration et de réticulation différentes et ont un impact différentiel sur la reconnaissance anticorps-cible en ciblant des groupes fonctionnels distincts53,54. Les dissections IFM sont compatibles avec plusieurs méthodes de fixation, y compris la fixation à 4 % de paraformaldéhyde (PFA), à 9 % de glyoxal et à méthanol (Figure 6), ce qui souligne l’utilité générale de ce protocole de dissection.

Pour comparer la taille et la morphologie du sarcomère avec l’application de différentes méthodes de fixation, des dissections d’hémithorax de 1 jour adultes w1118 mouches ont été effectuées. La fixation de 4 % de PFA dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) (figures 6A, E) ou une solution relaxante (RS) (figures 6B et F) a été comparée. La solution relaxante contient de l’ATP et est recommandée pour la quantification des dimensions des sarcomères afin de préserver les sarcomères dans leur état détendu20,55 (voir Fichier supplémentaire 1). Une fixation de 4 % de PFA préserve efficacement la morphologie du sarcomère, mais une différence significative de largeur de sarcomère a été observée entre la fixation de 4 % de PFA dans le PBS et le RS (Figure 6I,J). La fixation dans le méthanol a préservé la structure des myofibres et des sarcomères (Figure 6C, G), mais les sarcomères étaient significativement plus courts et plus minces qu’avec une fixation à 4 % de PFA (Figure 6I, J). Les IFM ont pu être efficacement préservés avec une fixation nocturne au glyoxal à 9 % (Figure 6D, H) (la fixation au glyoxal à 3 % était inefficace), ce qui a également modifié de manière significative la largeur du sarcomère par rapport à une fixation à 4 % de PFA (Figure 6I, J). En conclusion, les hémitoraces IFM peuvent être efficacement préservés avec plusieurs fixateurs. Cependant, comme le fixateur et le tampon peuvent influencer la mesure des dimensions du sarcomère, les expériences doivent être conçues avec des contrôles appropriés et un protocole de fixation bien défini et cohérent.

Artefacts de dissection et de fixation courants dans les IFM

L’un des défis de la microscopie, en particulier pour les nouveaux utilisateurs et les stagiaires, est de distinguer les artefacts techniques des phénotypes de bonne foi. Pour faciliter cette distinction dans les IFM de la drosophile, des données représentatives des artefacts et des échecs de dissection les plus fréquemment observés sont présentées (Figure 6). Les protocoles de fixation nécessitent une optimisation du type, de la concentration et de la durée de la fixation pour éviter une sous-fixation ou une sur-fixation 52,53,54. En utilisant un temps de fixation de 1 jour de dissections d’hémithorax adultes incubées dans 4 % de PFA dans une solution relaxante, il a été observé que si un temps de fixation de 15 ou 30 minutes préserve avec précision la morphologie du sarcomère, une fixation de 7 minutes produit des morphologies de sarcomère incohérentes (Figure 6K-M). De plus, le tissu est moins rigide avec un temps de fixation plus court, ce qui rend plus difficile la coupe et la coupe en deux du thorax sans endommager les IFM. Des artefacts supplémentaires peuvent survenir pendant le processus de coupe et de montage. La structure en myofibre IFM peut sembler irrégulière si la lame est émoussée et provoque des déchirures ou des effilochages (Figure 6N) ou si la lame glisse ou si la coupe est inclinée (Figure 6O). Si les pinces entrent en contact direct avec des IFM fixes lors de la manipulation ou du montage, elles produisent une impression qui peut entraîner des divots ou des étirements et peut écarter les sarcomères (Figure 6P). L’étirement ou la déformation du thorax, que ce soit lors de la coupe, de la manipulation ou du montage, sépare également les sarcomères et entraîne la perte d’un disque Z clairement délimité (Figure 6Q). Enfin, le « sciage » ou le « frottement » des IFM à l’aide d’une pince ou d’une lame entraîne l’abrasion et l’effilochage, l’effilochage et la désorganisation des myofibrilles, en particulier à la surface de la myofibre (Figure 6R). Les utilisateurs potentiels doivent se familiariser avec ces artefacts techniques et les exclure de l’analyse phénotypique.

Progression développementale du phénotype SmnE33 chez les IFM

Les dissections à livre ouvert et les dissections d’hémithorax sont particulièrement utiles pour suivre la trajectoire de développement d’un phénotype musculaire et pour déterminer à quel moment du développement un gène d’intérêt agit ou des phénotypes myofibrillaires apparaissent. Le phénotype développemental IFM de SmnE33, un allèle hypomorphe de la protéine de liaison à l’ARN Motor Neuron (Smn)39 , est présenté comme des données représentatives illustrant la large utilité des dissections à livre ouvert et des dissections d’hémithorax.

Les petites ribonucléoprotéines nucléaires (snRNP) qui forment l’épissage, le complexe macromoléculaire qui catalyse la réaction d’épissage pour générer des ARNm7, sont assemblées par le complexe SMN. Le complexe SMN, composé des protéines Survival motor neuron (Smn) et Gemin, est nécessaire à la viabilité dans tous les organismes56. La réduction des niveaux de SMN chez l’homme entraîne une grave maladie neuromusculaire héréditaire, l’atrophie motrice spinale (SMA)21. La drosophile a été utilisée comme modèle pour comprendre l’étiologie de l’AS et la fonction cellulaire de Smn, y compris le développement de l’allèle hypomorphe SmnE33. Les mouches SmnE33 sont viables et fertiles, mais ne peuvent pas voler ou sauter39. Bien que les mouches SmnE33 présentent des défauts d’arborisation des motoneurones, elles présentent également une structure IFM désorganisée et une perte d’expression d’Actin88F spécifique du muscle de vol39,57. SMN est co-localisé avec l’alpha-actinine au niveau du disque Z chez les mouches et les souris39, ce qui suggère que Smn peut avoir une fonction spécifique musculaire.

Pour mieux comprendre quand la structure myofibrillaire est perdue et que la fonction Smn est nécessaire dans le développement musculaire, une analyse de l’évolution temporelle du phénotype SmnE33 dans les IFM à 26 h APF, 72 h APF et 1 à 5 jours chez l’adulte a été effectuée. Alors que les IFM témoins w1118 à 72 h APF et chez l’adulte ont un signal F-actine fortement coloré à la phalloïdine (Figure 7E,E',I,I') et une structure régulière de sarcomère (Figure 7G,G',K,K'), le signal de la phalloïdine est considérablement réduit (Figure 7F,F',J,J') et les structures de sarcomère sont absentes (Figure 7H,H',L,L') chez SmnE33 IFM. L’actine F est plutôt observée dans des structures en forme de filet autour des noyaux ou dans des faisceaux irréguliers ou des structures en « étoile » dans le cytoplasme (Figure 7H,H',L,L'), ce qui correspond à une perte de l’expression18, 39 d’Act88F et à une incapacité à assembler des filaments minces. Des dissections à livre ouvert ont été effectuées pour examiner le phénotype de SmnE33 à 26 h APF et ont révélé que le développement précoce de l’IFM se déroule normalement chez SmnE33. Comparable aux IFM de contrôle w1118 (Figure 7A,A',C,C'), les mouches SmnE33 ont 6 fibres IFM longitudinales dorsales par hémithorax, forment des câbles d’actine F organisés à la périphérie de la myofibre avant la myofibrillogenèse (Figure 7B,B'), et présentent un réseau d’actine F semblable à un maillage dans toute la myofibre (Figure 7D,D'). Ces résultats indiquent que les étapes initiales de la différenciation de l’IFM se déroulent normalement, tandis que la Smn est nécessaire dans les étapes ultérieures du développement de l’IFM pour maintenir l’expression d’Act88F et construire des sarcomères. Il est important de noter que ces résultats représentatifs illustrent les détails phénotypiques et la résolution qui peuvent être obtenus par des dissections à livre ouvert et des dissections d’hémithorax.

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Figure 1 : Dissection hémi-sectionnelle d’IFM adultes. (A) Positionner une mouche adulte en 1x PBS sur une lame de microscope. (B) À l’aide d’une pince (cyan, point) pour stabiliser la mouche, retirez la tête avec des ciseaux (orange). (C-E) Retirez les ailes gauche (C) et droite (D) ainsi que l’abdomen (E). (F) Jetez la tête, l’abdomen et les ailes, et transférez le thorax dans un fixateur. (G,H) Orientez un thorax fixe sur une lame en une goutte de 1x PBS-T avec le postérieur (P) et le scutellum pointant vers le haut (G), à l’aide d’une pince pour stabiliser l’orientation (H). (I-K) À l’aide d’une lame de cryostat, coupez le thorax en deux (I-J), afin de générer deux hémi-sections du thorax (K). (L) Schéma d’une lame de cryostat et d’un thorax, illustrant la position de la coupe sagittale pour produire des hémi-sections. La lame est glissée vers la droite pour entailler le scutellum du thorax, puis déplacée vers le bas dans un mouvement doux (flèches jaunes) pour couper le thorax (ligne rouge pointillée). (M,N) Schéma d’une vue coronale (M) et transversale (N) du thorax, illustrant la position des principaux groupes musculaires et la position de l’incision (entre les triangles jaunes). L’orientation du thorax est indiquée (L, à gauche ; R, à droite ; V, ventrale ; D, dorsal ; A, antérieur ; P, postérieur). Barres d’échelle = 1 mm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Figure 2 : Stadification de la nymphe et caractéristiques du développement de la nymphe. (A) Les pupes mâles et (B) femelles peuvent être distinguées comme des pré-pupes blanches à 0-2 h APF. Les pupes mâles ont des structures appariées, rondes et translucides (testicule en développement) vers la postérieure (flèches). (C) Tableau des caractéristiques qui servent de caractéristiques du développement des nymphes. Les caractéristiques comprennent la maturation de la nymphe, l’éversion de la tête et le détachement de la nymphe de la nymphe, le développement de la pigmentation des yeux, la pigmentation des poils, des ailes, des pattes, de l’épandrium et de la cuticule, et la visibilité de la tache vierge (méconium). La couleur des yeux et la pigmentation s’assombrissent progressivement. Le moment et les stades de développement de la nymphe étiquetés en haut de chaque colonne du tableau (points temporels indiqués en noir, stade correspondant du développement de la nymphe en dessous en texte bleu) ont été précédemment définis par Bainbridge et Bownes19,41. (D-E) Évolution temporelle du développement de la nymphe à 0-2 h, 24 h, 48 h, 72 h et 96 h APF chez une nymphe intacte aux yeux rouges (D ; Mef2-Gal4, fln-GFP) et chez une nymphe aux yeux orange disséquée dans l’étui nymphal (E ; Fln-Gal4). A noter l’assombrissement progressif des yeux et des poils de 48 h à 96 h APF. (F) Exemples de létalité nymphale aux points de développement précoces, intermédiaires et tardifs. Les mouches létales pharates sont complètement formées, mais ne parviennent pas à se séparer complètement de l’étui nymphal. Barres d’échelle = 1 mm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Figure 3 : Dissection hémi-dissection d’IFM de nymphes (>48 h APF). (A-H) Retrait d’une nymphe de la nymphe. Fixez les pupes sur une bande de ruban adhésif double (A, B). Ouvrez l’arête antérieure (C) et retirez l’opercule (D) à l’aide d’une paire de pinces Dumont #5 (bleue, la flèche indique la direction du mouvement, le point est immobile). À l’aide d’une pince, ouvrez (E) et décollez (F) la nymphe en lanières (G). Des bandes de l’étui nymphal sont collées sur le ruban adhésif double. Après avoir exposé l’abdomen, sortez la chrysalide de l’étui (H). (I) Schéma illustrant le processus de dissection d’une nymphe à partir de la nymphe. Les panneaux de figures correspondant à chaque étape du schéma sont étiquetés (en bas). La ligne pointillée rouge marque l’endroit où la pince peut être insérée sans endommager la nymphe pour ouvrir la nymphe. (J-L) Après avoir retiré la chrysalide de l’étui (J) et l’avoir transférée sur une lame de microscope en une goutte de 1x PBS (K), utilisez des ciseaux pour retirer l’abdomen (L). (M) Jetez l’abdomen et transférez le thorax dans un fixateur. (N) Après fixation, transférez les tortues nymphales sur une lame en une goutte de 1x PBS-T. Orientez la nymphe côté dorsale vers le haut et stabilisez-la à l’aide d’une pince. (O-P) Utilisez une lame de cryostat (O) pour couper une hémisection de nymphe (P). L’emplacement de la coupe est le même que celui de la figure 1 M-N. Barres d’échelle = 1 mm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Figure 4 : Dissection à livre ouvert d’IFM de nymphes (<48 h APF). (A) Après avoir retiré la nymphe de la nymphe comme le montre la figure 3 A-I, transférez la nymphe dans 1x PBS dans une boîte de dissection en silicone noir. (B-D) Poussez doucement la chrysalide vers la surface de la boîte en silicone à l’aide d’une pince (B) et épinglez le côté ventral vers le haut à l’aide de deux épingles à insectes (C, D). (E) Ouvrez la membrane basale (bm) et la cuticule de la tête à l’aide de ciseaux (orange). (F,G) Coupez le long du côté droit (F) et gauche (G). La position de la coupe est schématisée en (Q). (H,I) Soulevez la section ventrale à l’aide d’une pince (H) et retirez-la avec des ciseaux (I). (J,K) À l’aide d’une pince, vous enlevez l’encéphale (J), la trachée latérale du tronc et l’intestin (K). (L-M) Utilisez un léger jet de tampon à partir d’une pipette pour éliminer les corps adipeux et exposer les IFM. (N) Coupez le thorax en deux folioles. (O,P) Coupez les feuillets et transférez-les dans un fixateur. (Q) Schéma résumant les étapes d’une dissection à livre ouvert. Les panneaux de figures correspondant à chaque étape sont étiquetés (en bas). Les vues de dessus et de côté sont fournies pour illustrer l’emplacement des coupes (ligne rouge pointillée) sur les côtés gauche et droit de la nymphe. Les ailes, les pattes et la trompe (étiquetées) sont utilisées pour distinguer les côtés dorsal et ventral de la nymphe. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 5 : Montage d’échantillons sur des lames de microscope. (A-D) Les entretoises de lamelle sont utilisées pour monter des échantillons d’hémisection thoracique épaisse. Le glycérol (A) est utilisé pour fixer des entretoises (lamelles #1) sur une lame étiquetée (B), et les échantillons sont montés dans un milieu de montage dans l’espace entre les entretoises (C). Les pupes tardives et les thoraces adultes ont besoin de deux entretoises de lamelle #1 (D). Les points temporels du milieu de la nymphe nécessitent une seule entretoise de lamelle #1, et les dissections précoces de la nymphe peuvent être montées sans entretoise. (E-H) Les échantillons d’hémithorax adultes sont transférés dans un milieu de montage à l’aide d’une pince ou d’un pinceau (E). Les thoraces sont d’abord orientées de manière aléatoire (F) et peuvent nécessiter d’être retournées à l’aide d’une pince (G) de sorte que les IFM soient orientés vers le haut vers la lamelle (H). (I-L) Les feuillets des dissections à livre ouvert de la nymphe précoce sont transférés pour être montés à l’aide d’une pince (I). Les folioles sont orientées de manière aléatoire (J) et peuvent être retournées à l’aide d’une pince (K) de sorte que les IFM soient orientés vers le haut vers la lamelle (L). (M-P) Une fois les échantillons correctement orientés, placez une lamelle sur les échantillons (M) et tapotez-la même contre les entretoises (N). Remplissez les échantillons avec le milieu de montage (O) en prenant soin d’éviter de former des bulles. Scellez tous les bords ouverts de la lamelle et des entretoises avec du vernis à ongles (P) pour éviter l’évaporation du support de montage. (Q-R) Images d’échantillons de thorax adulte correctement montés (Q, grossissement 10x) orientés avec les IFM vers le haut vers la lamelle (R, grossissement 20x). (S) Un schéma de la lame terminée, avec des échantillons orientés IFM-vers le haut entre les entretoises et le vernis à ongles scellant tous les bords ouverts. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 6 : Les dissections IFM sont compatibles avec différents fixateurs. (A-H) Projection z confocale de la structure des myofibres (A-D) ou images monoplan de la structure des myofibrilles et des sarcomères (E-H) du témoin w1118 IFM adulte. La dissection hémithorax est compatible avec plusieurs méthodes de fixation, y compris le paraformaldéhyde (PFA) à 4 % dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) (A, E) ou une solution relaxante (RS) (B, F), le méthanol (C, G) ou une solution de glyoxal à 9 % (D, H). DAPI (1:1000), bleu ; phalloïdine (1:500) colorée F-actine, grise. (I,J) Quantification de la longueur (I) et de la largeur (J) du sarcomère à partir de E-H. La méthode de fixation et le tampon peuvent avoir un impact significatif sur la mesure de la longueur et de la largeur du sarcomère. Une longueur de sarcomère de 3,040 ± 0,2935 μm avec fixation au méthanol était significativement plus courte que les longueurs mesurées de 3,271 ± 0,2736 μm, 3,190 ± 0,2586 μm et 3,217 ± 0,2023 μm avec fixation PFA (PBS), PFA (RS) et 9 % de fixation au glyoxal, respectivement (p < 0,001). La largeur du sarcomère était significativement différente entre toutes les méthodes de fixation testées (PFA (PBS), 1,410 ± 0,1331 μm ; PFA (RS), 1,284 ± 0,2514 μm ; méthanol, 1,280 ± 0,1538 μm ; et fixation du glyoxal à 9 %, 1,137 ± 0,2032 μm). Les boîtes à moustaches sont illustrées par des moustaches de Tukey avec des points de données aberrants marqués par des points noirs. La signification a été déterminée par ANOVA à l’aide d’un test de Tukey a posteriori (**, p < 0,01 ; ***, p < 0,001). (K-M) Images confocales monoplan d’un temps de fixation de w1118 adulte dans 4 % de PFA dans la fixation RS, démontrant que des temps de fixation de 15 (L) ou 30 (M) min, par rapport à 7 min (K), permettent d’obtenir une structure de sarcomère bien préservée et cohérente. (N,O) Projections de l’empilement Z d’IFM Act88F-Gal4 adultes fixées dans 4 % de PFA démontrant des artefacts de dissection dans les myofibres. Les artefacts courants comprennent des myofibres coupées, effilochées ou partielles d’une lame émoussée (N) ou d’une coupe inclinée (O). (P-D) Images confocales monoplan d’échantillons adultes w1118 fixées à 4 % de PFA dans le PBS démontrant des artefacts de dissection communs dans les sarcomères et les myofibrilles. Les artefacts techniques courants comprennent l’étirement irrégulier des sarcomères dû au contact avec une pince lors du montage (P), l’arrachement des disques Z hors registre en étirant les myofibres lors des coupes longitudinales (Q) et les myofibrilles effilochées, désorganisées ou recourbées en raison de l’abrasion ou d’une lame émoussée (R). DAPI (1:1000), bleu ; phalloïdine (1:500) colorée F-actine, grise. Barre d’échelle = 100 μm (A-D, N-O), 5 μm (E-H, K-M, P-R). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 7 : Application des dissections pour étudier le phénotype développemental IFM de SmnE33. (A-D) Structure musculaire chez les pupes précoces à 26 h APF. Image confocale monoplan de la structure des myofibres (A, A', B, B') et de la structure des myofibrilles et des sarcomères (C, C', D, D') en contrôle (A, A', C, C') et SmnE33(B, B', D, D'). Le contrôle et le SmnE33 ont tous deux six myofibres IFM par hémithorax et forment des câbles d’actine F. (E-H) Structure musculaire chez les pupes tardives à 72 h APF. Image de projection Z de la structure des myofibres en contrôle (E, E') et SmnE33 (F, F'). Les IFM dans SmnE33 sont présents sur la base de la coloration DAPI mais n’ont pas de signal d’actine F fort. Des images confocales monoplan révèlent que les IFM de contrôle ont une structure de sarcomère très organisée (G, G'). En revanche, les IFM SmnE33 (H, H') ont des structures d’actine F anormales semblables à celles d’une étoile (flèches jaunes) et n’ont pas la structure de sarcomère organisée observée dans les IFM témoins. (I-L) Structure musculaire adulte en contrôle (I, I', K, K') et SmnE33(J, J', L, L'). La projection Z (I,J) et les images confocales monoplan (K,L) révèlent une teneur en actine F fortement réduite et des structures d’actine anormales (flèches jaunes) dans les IFM Smn E33. DAPI (1:1000), bleu ; phalloïdine (1:500) colorée F-actine, magenta ou grise. Barre d’échelle = 50 μm (A, B), 10 μm (C, D, G, H, K, L), 100 μm (E, F, I, J). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Dossier supplémentaire 1 : Une description détaillée des méthodes de fixation et de coloration utilisées dans le texte et en particulier pour générer les données présentées à la figure 6 et à la figure 7. Des informations supplémentaires sur la détermination des dilutions des anticorps primaires sont incluses. Une liste des composants de tampon et des recettes utilisés dans ce protocole est également fournie. Ces données motivent le protocole de dissection et démontrent son utilité pour la microscopie confocale et l’analyse des phénotypes développementaux IFM. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 1 : Schéma des étapes de la dissection de l’hémithorax chez l’adulte. Résumé textuel des étapes de la figure 1 pour préparer les coupes IFM de l’hémithorax. Après dissection, fixation et bissection du thorax, des coupes sont colorées pour une analyse microscopique. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette figure.

Figure supplémentaire 2 : Schéma des étapes de la dissection de l’hémithorax chez les IFM nymphales. Résumé textuel des étapes de la figure 3 pour préparer les sections d’hémithorax des IFM nymphales. Après avoir été retirées de la nymphe, les nymphes sont fixées, coupées en deux et colorées pour la microscopie. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette figure.

Figure supplémentaire 3 : Organigramme des étapes de la dissection à livre ouvert des IFM de nymphes précoces. Résumé textuel des étapes illustrées à la figure 4 pour effectuer une dissection à livre ouvert des IFM nymphaux avant 48 h APF. Après dissection et fixation, les feuillets épithéliaux avec IFM attachés sont colorés pour la microscopie. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette figure.

Discussion

Ce protocole présente une procédure pour la dissection de l’hémithorax de D. melanogaster adulte (Figure 1) et de la nymphe tardive (48 h - 96 h APF) (Figure 3) ainsi que la dissection à livre ouvert des IFM à des moments de nymphe précoce (8 h - 48 h APF) (Figure 4). Ce protocole est optimal pour les applications d’immunohistochimie et de microscopie à fluorescence. Le protocole est illustré par des schémas et des photographies par étapes de la procédure de dissection. Des diagrammes de synthèse rendent le protocole accessible aux scientifiques novices dans le domaine de la drosophile ainsi qu’aux chercheurs de premier cycle et aux stagiaires en début de carrière. Des exemples représentatifs d’artefacts de fixation et de préparation d’échantillons médiocres sont inclus pour permettre aux utilisateurs du protocole de distinguer les artefacts des phénotypes de sarcomères de bonne foi .

L’étape la plus difficile de la dissection de l’hémithorax IFM est la bissection du thorax (Figure 1I, J, L et Figure 3O). Cette étape demande du temps et de la pratique pour être maîtrisée. Pour plus de stabilité lors de la coupe, les thoraces individuelles peuvent être placées sur du ruban adhésif double et coupéesen 36, mais il faut veiller à ne pas dessécher les IFM. Il est également possible de couper à partir de la face ventrale du thorax, avec la face dorsale orientée vers le bas, afin que les nouveaux utilisateurs puissent tester quelle approche est la plus efficace avec leur configuration. Les coupes doivent être effectuées avec des lames neuves et tranchantes pour éviter d’endommager les IFM, et une lame doit être remplacée lorsqu’elle devient émoussée. Les lames du microtome (cryostat) sont utilisées pour couper proprement le thorax dans ce protocole, par rapport à d’autres protocoles qui utilisent une aiguille, une pince ou une lame de scalpel24, 32, 36. Les lames de rasoir sont une autre alternative pour couper proprement le thorax en deux. La fixation est également importante avant la bissection, car les tissus légèrement fixés, bien que conservés de manière stable, peuvent être « spongieux » et plus difficiles à couper. Des temps de fixation de 30 à 60 minutes équilibrent la disponibilité de l’antigène et la rigidité des tissus facilitant les coupes, et peuvent être raccourcis à 15 minutes avec l’expérience.

L’une des limites des préparations d’hémithorax est la pénétration des anticorps. Les hémithoraces sont des échantillons épais32, et les micrographies confocales de la meilleure qualité sont obtenues à partir des 10-20 μm supérieurs des IFM42, 58. Une concentration de détergent trop faible ou un temps de perméabilisation trop court peut entraîner des taches faibles et incohérentes. La pénétration des anticorps peut également être améliorée par une incubation plus longue (2-3 jours) dans l’anticorps primaire. Un système à deux photons ou un objectif avec une distance de travail plus grande peut également augmenter la profondeur d’imagerie59. Si l’expérimentateur a besoin d’imager le diamètre complet de la myofibre IFM, une approche alternative telle que le microtome24, 58 ou la cryosection27 dans le plan sagittal doit être envisagée.

Un aspect important qui n’est pas abordé dans le protocole principal est l’analyse des données d’image. Pour l’analyse des myofibres IFM dans des images 10x ou 20x (Figure 6A-D, Figure 7A, B, E, F, I, J), l’analyse standard comprend la détermination si les myofibres sont attachées et si la morphologie grossière de la myofibre est intacte37, 38. Des exemples de paramètres qui peuvent être quantifiés, en fonction de l’expérience, comprennent la longueur, la largeur, le nombre, le nombre d’attaches ou le nombre de myofibres déchirées37, 60. Un avantage majeur de ce protocole est la compatibilité avec la microscopie à fluorescence et la possibilité d’analyser la morphologie des sarcomères et des myofibrilles à des grossissements plus élevés de 60x ou 100x (Figure 6E-H, Figure 7C,D,G,H, K,L). La morphologie du scomère doit être analysée dans des échantillons exempts d’artefacts techniques (Figure 6K-P). Un certain nombre de catégories de phénotypes possibles de myofibrilles et de sarcomères a été précédemment défini60. Le plus souvent, la longueur et la largeur du sarcomère sont mesurées soit en traçant et en mesurant une ligne d’un disque Z à un disque Z dans un logiciel de traitement d’image, soit à l’aide de l’un des nombreux outils automatisés disponibles gratuitement18, 45, 61. L’évaluation de la morphologie du sarcomère peut être améliorée par l’inclusion de marqueurs qui marquent le disque Z ou la ligne M, ou les filaments épais ou minces30, 34, 58. Ces données peuvent être utilisées pour décrire quantitativement les phénotypes de myofibres, de myofibrilles et de sarcomères entre un échantillon de contrôle et un échantillon de test préparé à l’aide de ce protocole de dissection.

Les utilisateurs du protocole doivent être conscients que si la fixation préserve la morphologie des myofibres et des sarcomères, les fixateurs ainsi que les tampons et le support de montage peuvent provoquer un rétrécissement ou un gonflement des tissus et peuvent influencer la mesure des paramètres morphologiques45. La fixation et la déshydratation du glutaraldéhyde nécessaires à la microscopie électronique sont connues pour réduire le diamètre du sarcomère43, tandis qu’il a été démontré que le dépouillement et la glycération des fibres augmentent le diamètre du sarcomère44,45. Ce phénomène peut être à l’origine des différences de paramètres du sarcomère dans la littérature et souligne l’importance d’inclure des échantillons de contrôle et d’essai dans chaque expérience. Les IFM de contrôle et d’essai doivent être traités simultanément dans les mêmes tampons pour une comparaison précise des paramètres quantitatifs du sarcomère.

Ce protocole détaillé vise à rendre la dissection IFM adulte et nymphale pour l’immunohistochimie et la microscopie fluorescente plus accessible aux drosophiles débutants et avancés. Ce protocole peut être adapté pour être utilisé avec d’autres insectes ainsi que pour d’autres techniques d’imagerie telles que la cryo-microscopie électronique (cryo-EM), l’hybridation in situ par fluorescence monomoléculaire (smFISH) ou la transcriptomique spatiale. La combinaison de puissants outils de génétique de la drosophile et de microscopie à fluorescence offre des opportunités uniques pour étudier les principes conservés de la myogenèse et de la fonction musculaire. Comme les IFM se prêtent également à des approches moléculaires et biochimiques26, 27, des études futures reliant les phénotypes moléculaires à la morphologie musculaire, à la biologie cellulaire et à la fonction fourniront une compréhension plus approfondie de la myogenèse et de l’étiologie des troubles musculaires.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Les auteurs remercient Gregory Matera d’avoir fourni l’allèle SmnE33 et pour les discussions utiles sur Smn. Les auteurs remercient Frank Schnorrer, Cornelia Schoenbauer, Manuela Weitkunat et Aynur Kaya-Copur pour leurs discussions utiles et leur soutien. Les auteurs remercient le centre de stockage de Bloomington d’avoir fourni des mouches. Ce travail a été soutenu par un financement de démarrage de l’École des sciences et de l’ingénierie de l’Université du Missouri à Kansas City (UMKC), de la Division des systèmes biologiques et biomédicaux (MLS), du programme de financement de l’excellence (MLS) de l’UMKC et du Bureau de la recherche de premier cycle et des bourses d’études créatives (SF, MLS) de l’UMKC.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Plats de culture tissulaire de 60 mmFisher ScientificFB01292160 mm, polystyrène
Acide acétique, glaciaire (certifié ACS)Fisher ScientificA38S-212
Triphosphate d’adénosine (ATP)Millipore SigmaA1852
Papier aluminium, robusteAmazon12 pouces. x 1000 pieds.
Plats de dissection en silicium noir : poudre de charbon actifMillipore SigmaC9157Également disponible dans la plupart des pharmacies
Plats de dissection en silicium noir : Sylgard 184Millipore Sigma761036Pour fabriquer des plats à dissection en silicium, mélangez les composants Sylgard dans un sac ziploc et mélangez bien. Ajoutez de la poudre de charbon actif (~200 mg) à Sylgard (~50 g), mélangez bien, coupez le coin du sac, remplissez des plats de culture de 60 mm, enlevez les bulles avec une pointe de pipette, et séchez toute la nuit.  ;
Plateau de diapositives en carton, Research Products International CorpFisher Scientific50-136-7558
Microscope confocal, confocal inversée Nikon AXRNikonwww.microscope.healthcare.nikon.com/
Microscope confocal, Zeiss LSM 780 confocal inverséeZeisswww.zeiss.com
Chambre d’élevage d’insectes Darwin (Incubateur)Fisher Scientific/Darwin ChambersIN034Incubateur à contrôle de lumière, de température et d’humidité
Plat de dissection (verre noir)Mikroskop Technik Diethelm398011Lymphbecken (bols de teinture/réservoirs de lymphe), verre noir, 4x4 cm, avec couvercle en verre transparent
Pinces Dumont #3Outils scientifiques finement11231-30Pinces à pointe droite Dumoxel de 12 cm avec 0,17 x 0,1 mm de pointe   ;
Pinces Dumont #5Outils scientifiques finement11252-20Pinces Inox à pointe droite de 11 cm, grade biologique avec pointe et nbsp de 0,05 x 0,02 mm ;
EGTA (acide égtazique)Millipore Sigma324626
Éthanol, absolu (200 proof)Fisher ScientificBP28184Grade en biologie moléculaire
Verre de couverture premium Fisherbrand (18 x 18 mm), couverturesFisher Scientific12548AVerre, carré, épaisseur #1 (0,13 - 0,16 mm)
Verre de couverture premium Fisherbrand (22 x 22 mm), couverturesFisher Scientific12548BVerre, carré, épaisseur #1 (0,13 - 0,16 mm)
Plaques de culture cellulaire à fond plat (24 puits)Fisher Scientific7200740
Caméra microscope fluorescente disséquante, caméra Infinity8Teledyne (Visual Dynamix)6 mégapixels, faible luminosité, monochrome
Fly : Smn[E33]Du stock de mouches ; don de Grégoire Matera
Vol : w[1118]Centre de bétail de BloomingtonRRID : BDSC_3605Crosse de mouches
glycérolFisher ScientificBP229-1Grade en biologie moléculaire
Solution glyoxale (40 % en poids dans H2O)Millipore Sigma128465  ; C’est une solution à 40 % d’origine
Logiciel de traitement d’image, Affinity Designer 2Affinitéhttps://affinity.serif.com/en-us/
Logiciel de traitement d’image, Image J (Fidji)ImageJ2https://imagej.net/software/fiji/
Épingles à insectesOutils scientifiques finement26002-10Acier inoxydable, 0,1 mm de diamètre (broches Minutien)
Chlorure de magnésium (MgCl2)Fisher ScientificAA12315A1
Méthanol (HPLC)Fisher Chemical (Fisher Scientific)A452-4Chill à -20 ? Avant utilisation
Lames de microscope, givréesFisher Scientific12-550-400Zone d’écriture, non chargée, 75 mm x 25 mm x 1 mm
Lames de microscope, verre natureFisher Scientific12-544-4Pré-nettoyé, 75 mm x 25 mm
Lames microtomes MX35 Ultraepredia (Fisher Scientific)3053835Profil bas, 34° ; angle de coupe ; Les lames C35 feather 80 mm fonctionnent bien
Vernis à ongles, transparent (vernis à ongles Sally Hansen Xtreme Wear)Amazon0,4 fl. oz.
Sérum de chèvre normalMillipore SigmaS26 LITRES
Nutator (Mini Rocker Nutating, Benchmark)Midwest ScientificH3D102024 tours par minute, fixe ; 8 x 6 pouces. Plateforme avec tapis à fossettes
Paintbrush (Manche n° 0)AmazonPinceau rond n°0 ou similaire provenant de n’importe quel matériel d’art
Paraformoldéhyde (PFA)Millipore Sigma158127-500G
Solution tamponnée phosphate (PBS) : KClMillipore Sigma529552-250GMPréparer PBS selon le Cold Spring Harb Protoc ; 2006; doi :10.1101/pdb.rec8247
Solution physiologique tamponnée au phosphate (PBS) : KH2PO4Millipore SigmaP0662-500GPréparer PBS selon le Cold Spring Harb Protoc ; 2006; doi :10.1101/pdb.rec8247
Solution physiologique tamponnée phosphate (PBS) : Na2HPO4Millipore SigmaS9763-500GPréparer PBS selon le Cold Spring Harb Protoc ; 2006; doi :10.1101/pdb.rec8247
Solution tampon phosphate (PBS) : NaClFisher Chemical (Fisher Scientific)S271-1Préparer PBS selon le Cold Spring Harb Protoc ; 2006; doi :10.1101/pdb.rec8247
Pointes de pipette PR1MA (10 & micro ; L)Midwest ScientificPR10XLRK-NSUniversal 10 & micro ; Pointes de pipette en L
Pointes de pipette PR1MA (1000 & micro ; L)Midwest ScientificPR-1000RK-FLUniversal 1000 & micro ; Pointes de pipette en L
Pointes de pipette PR1MA (200 & micro ; L)Midwest ScientificPR-200RK-NSUniversal 200 & micro ; Pointes de pipette en L
Rhodamine-PhalloïdineInvitrogen, Sondes MoléculairesR415
Ruban adhésif double face écossaisScotch/3M (Agrafes)649280Les deux côtés sont recouverts d’adhésif, 0,5" x 7 yards, disponibles chez la plupart des manutentionnaires de fournitures de bureau
Dihydrogène phosphate de sodium dihydré (NaH2PO4)Fisher ScientificAAA1131636
Logiciel : GraphPad PrismGraphPad Prismwww.graphpad.com
Logiciel : Infinity Analysis 7Teledyne (Visual Dynamix)https://www.teledynevisionsolutions.com/products/infinity-analyze/
Logiciel : Microscoft ExcelMicrosofthttps://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/excel
Mouchoir/Kimtech Science Kimwipes Essuie-glaces délicats pour tâches, 1 pinFisher Scientific06-666Lingettes de mouchoir standard
Pipette de transfertFisher Scientific13-711-9AMMDPipette en plastique
Trition X-100Millipore SigmaT9284-100ML
Ciseaux à ressort VannasOutils scientifiques finement15000-00Tranchant de 3 mm, diamètre de pointe 0,05 mm, longueur 8 cm
Vectashield avec DAPILaboratoires VectorH-2000
Vectashield sans DAPILaboratoires VectorH-1900
Papier WhatmanMillipore SigmaWHA1004070Cercles en papier filtre, Grade 4, 70 mm
Microscope stéréo fluorescent Z10Visual Dynamix (Midwest Scientific)http://www.visualdynamix.net/
Microscope stéréo stéréo ergonomique Z850 à zoom disséquantVisual Dynamix (Midwest Scientific)http://www.visualdynamix.net/

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Muscles du vol de Drosophiladissection musculairemod le de myogen semorphologie des sarcom resmicroscopie par immunofluorescenced veloppement musculaire pupalstructure des myofibrillesm thodes de fixationmod le de maladie musculaire
Dissection des muscles de vol indirect de Drosophila melanogaster pour les approches microscopiques
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