Article de méthode

Amyloïde et l’architecture cross-bêta

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DOI :

10.3791/69350

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13 février 2026

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1School of Life Sciences, University of Sussex

Dans cet article

Résumé

Les fibrilles amyloïdes sont formées par de nombreuses protéines, et les fibrilles résultantes partagent une structure en « feuilles crois β ées ». Nous décrivons ici comment des échantillons de fibrille amyloïde peuvent être préparés pour la diffraction des fibres aux rayons X et comment les motifs peuvent être analysés.

Résumé

Les fibrilles amyloïdes sont constituées d’une protéine mal repliée et auto-assemblée, organisée en une structure bien définie et répétitive. Elles sont bien connues pour leur rôle important dans les maladies du mauvais repliement des protéines, notamment la maladie d’Alzheimer et le diabète de type 2, où les fibrilles amyloïdes insolubles se déposent dans les tissus. De plus, il a été constaté qu’ils jouent un rôle fonctionnel important chez de nombreux organismes, fournissant solidité, échafaudage et protection. Les premiers modèles structuraux de l’amyloïde ont été informés par la collecte de données de diffraction des fibres aux rayons X à partir de faisceaux de fibrilles amyloïdes alignées. Cela a donné lieu aux premiers modèles de la structure générique de β croisée, qui a été supplantée par une analyse de diffraction plus détaillée à partir d’échantillons très orientés et semi-cristallins, aboutissant aux détails de l’organisation des peptides en une architecture répétitive. Ici, nous nous sommes concentrés sur la description des méthodes pour déterminer l’architecture sous-jacente de ces fibrilles, et nous avons décrit les caractéristiques communes des fibrilles amyloïdes provenant de diverses sources pathogènes, fonctionnelles et synthétiques. Nous décrivons la préparation des échantillons, la collecte des données et l’analyse ultérieure afin de produire une structure de modèle pouvant être comparée aux données expérimentales.

Introduction

Les fibrilles amyloïdes ont d’abord été identifiées dans un groupe de maladies appelées amyloïdoses, dans lesquelles les fibrilles protéiques s’accumulent dans les espaces extracellulaires destissus 1. Chaque maladie est caractérisée par une protéine précurseur particulière qui subit un changement conformationnel pour former des fibrilles protéiques hautement ordonnéeset stables 2,3. La définition plus récente des fibrilles amyloïdes intègre désormais les fibrilles qui s’accumulent dans l’environnement cellulaire. Plus récemment, plusieurs systèmes fonctionnels ont été identifiés utilisant la structure amyloïde pour assurer stabilité, adhésion, voire stockage d’informations. Malgré la grande variété de structures protéiques pouvant s’auto-assembler pour former des fibrilles amyloïdes, elles partagent toutes une structure croisée β4. Cette disposition croisée β a été d’abord décrite par Astbury pour le blanc d’œufde poule 5, puis expliquée plus tard par Geddes pour la soie croisée β6. Dans cette architecture protéique, les fibrilles sont composées de β-brins perpendiculaires à l’axe de la fibrille, qui sont ensuite arrangés en feuilles de β qui s’associent via les chaînes latérales pour former ce qui fut plus tard appelé fermetures éclairstériques 7. Cela crée une organisation très stable maintenue par des liaisons hydrogène parallèles à la fibre, parallèlement à des interactions hydrophobes, électrostatiques et polaires via les chaîneslatérales 8.

Les premières études structurales utilisaient la diffraction des fibres X pour examiner la structure des fibrilles amyloïdes, où les fibrilles étaient alignées et orientées pour former un faisceau de fibrilles amyloïdes pouvant être placées dans le faisceau de rayons X d’un diffractomètre 9,10. Une structure générique de fibrilles amyloïdes a été générée pour correspondre aux motifs de diffraction de plusieurs fibrilles amyloïdes extraites de tissus de maladies humaines ou cultivées invitro 4, ce qui a servi de base à d’autres descriptionsstructurales 11. Ces dernières années, les avancées en résonance magnétique nucléaire à l’état solide (RMSSN), en cristallographie des rayons X par microcristaux et en microscopie électronique cryogénique (CryoEM) ont fourni des détails atomiques pour la structure croiséeβ 11. Cependant, la méthode de diffraction des fibres aux rayons X reste importante et utile, et fournit des informations sur l’organisation répétitive des protéines. De plus, dans certains cas, des informations relatives à un ordre à plus long terme peuvent être accessibles. Fondamentalement, la diffraction des fibres aux rayons X est souvent utilisée pour confirmer la présence de fibrilles amyloïdes formées à partir de différentes protéines, et le motif de β croisé est l’une des principales exigences pour qu’un assemblage fibreux soit classé comme amyloïde12.

Ici, nous décrivons la méthodologie utilisée pour préparer les fibrilles amyloïdes et les alignons pour la collecte des données de diffraction des fibres aux rayons X. De plus, nous fournissons des détails sur la manière dont les données de diffraction peuvent être analysées davantage pour générer une structure de modèle, son schéma de diffraction prédit, et comparées aux données de diffraction issues de fibrilles dérivées ex vivo.

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Protocole

1. Préparation d’échantillons fibrillaires pour la diffraction des fibres de rayons X

  1. Dissolvez la protéine ou le peptide d’intérêt dans des conditions optimales pour la formation de fibrilles pour le peptide amyloidogène sélectionné et évaluez la formation de fibrilles à l’aide de microscopie électronique ou de microscopie à force atomique. Les détails sur la préparation des échantillons et la réalisation d’imageries sont disponibles ailleurs13. Assurez-vous que les fibrilles sont longues, droites et non ramifiées comme montré à la Figure 1. Par exemple, les fibrilles montrées à la Figure 1 ont été imagées à l’aide de la microscopie électronique de transmission (TEM). Placez une gouttelette contenant des fibrilles sur une grille de microscope électronique, puis colorez négativement à l’aide de l’acétated’uranyle 14.
    REMARQUE : Une couverture et une répartition uniformes des fibrilles sur la grille sont souhaitables.
  2. Alignez-vous pour produire un faisceau de fibrilles dont les axes fibreux sont idéalement tous parallèles (Figure 2A).
    1. Faites fondre la cire de bougie jusqu’à ce qu’elle soit liquide à l’aide d’une plaque chauffante. À l’aide d’un coupe-verre tel qu’un stylo diamanté, coupez des capillaires en verre borosilicate de 1 mm d’environ 2 à 3 cm de longueur et trempéz-les brièvement dans la cire liquide. Aspirez la cire de bougie par action capillaire (environ 1 à 2 mm de longueur dans le capillaire). Assurez-vous que la surface de cire est plane afin que la suspension de fibrilles puisse reposer de manière uniforme.
    2. Utilisez de la plasticine pour fixer horizontalement les capillaires scellés dans une boîte de Petri avec un espace de 0,5 mm à 2 mm entre les extrémités remplies de cire (Figure 2A).
    3. À l’aide d’une pipette, suspendez soigneusement une gouttelette de 10 μL de solution entre les extrémités remplies de cire des deux capillaires. Assurez-vous que la solution touche les deux extrémités de cire sans s’étendre sur le verre.
    4. Protégez l’échantillon de la poussière en recouvrant la boîte de Petri. Laissez l’échantillon s’évaporer pendant la nuit, ce qui entraîne l’alignement des fibrilles (voir Figure 2A).
      REMARQUE : Il peut falloir plusieurs jours pour que l’échantillon sèche complètement, ce qui dépendra de la température ambiante, de l’humidité et de la viscosité de l’échantillon.
    5. Scellez la plaque ; Incubez à basse température dans un réfrigérateur ou en utilisant l’humidité dans une boîte scellée pour ralentir le séchage, ce qui peut améliorer l’alignement de l’échantillon.
  3. Alignez les fibrilles amyloïdes dans un capillaire en verre (Figure 2B).
    1. Fixez une seringue de 1 mL équipée d’un petit morceau de tube en caoutchouc à l’extrémité large d’un capillaire en verre silicifié de 0,7 mm de diamètre, puis aspirez 2 à 3 cm de suspension à fibrilles.
    2. Scellez une extrémité du capillaire avec de la cire fondue et laissez l’autre extrémité rester ouverte pour permettre l’évaporation. Disposez le capillaire verticalement et laissez-le sécher pendant plusieurs jours ou semaines jusqu’à ce qu’il forme un disque séché dans le tube capillaire (Figure 2B).
  4. Alignez les fibrilles en « tapis » ou film mince (Figure 2C).
    1. Placez un échantillon de fibrille à haute concentration (par exemple, > 10 mg/mL) sur une lame en verre, un parafilm ou un morceau de téflon, et laissez sécher à l’air libre pendant au moins 24 heures. Cela devrait sécher pour former un film fin et plat à la surface. Soulevez-le délicatement à l’aide d’un scalpel, puis fixez-le à un tube capillaire en verre avec de la colle ou de la pâte à modeler.
    2. Le tapis comportera une disposition aléatoire de fibrilles (voir Figure 2C). Montez soigneusement l’échantillon sur une tête goniométrique de sorte que le faisceau de rayons X traverse le bord de l’échantillon et soit parallèle au plan du film (Figure 2C).
      REMARQUE : La diffraction à travers la face du film produira des anneaux de diffraction dus à un alignement aléatoire (voir Figure 2C).
  5. Examinez l’échantillon.
    1. Étudiez l’alignement de l’échantillon en l’examinant à travers un polariseur croisé sous un microscope optique. Si la biréfringence est présente, cela peut suggérer qu’il y a un bon alignement dans le fibré de fibrilles.
    2. Fixez l’échantillon de fibres capillaires sur une tête goniométrique à l’aide de pâte à modeline. Considérez si l’échantillon est un faisceau de fibres, un tapis ou un disque lors de son placement dans le faisceau de rayons X.
      1. Notez que l’axe de rotation de l’échantillon tournera autour de l’axe de la fibre pour un faisceau de fibres (Figure 2A), tandis que dans les disques, les fibres tendent à s’aligner sur le diamètre du tube (Figure 2B). Un tapis aura deux directions distinctes (parallèles au plan du film et perpendiculaires à celui-ci) (Figure 2C).
    3. Collectez un motif de diffraction (comme montré à la Figure 3A) à l’aide d’un équipement à rayons X interne (CuKα pour la cristallographie des protéines) ou à l’aide de rayonnement synchrotron. Les temps d’exposition varient en fonction de l’intensité du faisceau de rayons X ; Ajustez cela en fonction des temps de collecte recommandés pour la source de diffraction.

2. Analyse des données

  1. Utilisation de CLEARER pour l’analysede données 15.
    REMARQUE : Le programme d’analyse des motifs de diffraction des fibres X est disponible gratuitement pour les utilisateurs universitaires par l’auteur correspondant. D’autres méthodes d’analyse de diffraction sont disponibles16,17 (www.esrf.fr/computing/expg/subgroups/data_analysis/FIT2D)18. Les italiques entre parenthèses indiquent les commandes de menu.
    1. Convertissez le motif de diffraction en un fichier .tiff et téléchargez le fichier dans CLEARER (Figure 4).
    2. Saisissez les réglages de diffraction (Motif de diffraction : réglages de diffraction), incluant la taille des pixels dans l’image TIFF, la source de rayons X et la distance échantillon/détecteur.
    3. Assurez-vous que le motif de diffraction est orienté de manière à ce que le méridien soit vertical (traitement d’image : Rotation). Utilisez le module de centrage (Diagramme de diffraction : image centrale) pour centrer l’image. Définissez les deux principaux axes (méridien et équateur) : Ce module compare l’intensité le long de ces deux axes du motif. Une fois le centrage terminé, enregistrez l’image et assurez-vous qu’elle est utilisée pour les étapes suivantes.
    4. Spécifiez un angle approprié (placé le long des deux axes principaux [méridien et équateur]) et obtenez un graphique montrant la position du signal de diffraction par rapport à l’intensité en utilisant le module de moyenne radiale (diagramme de diffraction : moyenne radiale) (figure 4A).
    5. Mesurez et sortez automatiquement les positions des signaux de diffraction à l’aide du module Peak Find (Diagramme de diffraction : Moyenne radiale : Peak Find) (Figure 4B). Assurez-vous que tous les signaux de diffraction sont détectés avec précision en ajustant la largeur de recherche de crête tout en veillant à ce que le bruit n’est pas détecté.
    6. Vérifiez les positions des signaux générées par Peak Find en utilisant le module Zoom & Measure (Diffraction Pattern : Zoom & Measure). Vérifiez que toutes les positions des signaux sont indiquées et assignées à l’axe correct.
    7. Explorez les dimensions de la cellule unitaire (b et c) qui généreront les signaux de diffraction observés à l’aide du module d’optimisation de la cellule unitaire (Diagramme de diffraction : optimisation des cellules unitaires) (Figure 5A). Examinez les signaux forts trouvés sur l’équateur pour générer une estimation initiale à entrer dans la table d’entrée des cellules unitaires et spécifiez les indices min et max [hkl] sur lesquels CLEARER recherche des cellules potentielles (une dimension est méridionale et par défaut est de 4,76 Å).
    8. Calculez les dimensions potentielles des cellules unitaires et comparez les positions prédites des signaux de diffraction avec les réflexions observées. Les cellules unitaires sont notées en fonction du degré d’accord entre les signaux prédit et expérimental. Les vingt meilleurs matchs sont ensuite affichés. Considérez la longueur du précurseur peptidique et d’autres informations issues de la microscopie électronique, de l’AFM ou de la résonance magnétique nucléaire à l’état solide (RMN) pour aider à sélectionner les meilleures cellules unités possibles adaptées aux données et à l’échantillon.

3. Modélisation structurelle et tests du modèle à l’aide de CLEARER

  1. Construire des modèles moléculaires (format PDB).
    REMARQUE : Utilisez des programmes de modélisation protéique tels que Pymol (DeLano)19 ou Insight II (Accelerys) et d’autres, pour générer les coordonnées PDB du peptide précurseur en conformation β brin et dans une disposition en feuillets β. Cette section décrit un procédé simple utilisé pour une cellule unitaire orthorhombique (tous les angles de 90°). Des organisations non orthogonales sont possibles lorsque des connaissances plus approfondies en diffraction sont requises. Ces éléments peuvent être explorés dans CLEARER pour des cellules unitaires plus complexes.
    1. Construisez des arrangements tridimensionnels des peptides en β pour s’adapter à la ou aux cellules unitaires déterminées. Assurez-vous que ce modèle contient tous les objets liés à la symétrie à l’intérieur de la cellule.
    2. Chargez le modèle PDB dans le module Structure Chain Generator (Simulation de diffraction : Structures : Structure Chain Generator) pour vérifier les coordonnées de structure construites. Assurez-vous que l’axe de la fibre et l’axe de la poutre sont correctement attribués. Entrez les dimensions déterminées de la cellule unitaire. Vérifiez si des conflits se produisent pour les dimensions de cellules sélectionnées (Figure 5B).
    3. Téléverser les coordonnées du modèle PDB dans le module de simulation de diffraction de fibres (Simulation de diffraction : simulation de diffraction de fibre).
      1. Saisissez la direction de l’axe de la fibre, l’orientation du faisceau, les dimensions de la cellule élémentaire sélectionnées à l’étape 3.1.2, les paramètres de la source de rayons X et du détecteur, puis cliquez sur simuler. Pour une simulation à cellules unitaires orthorhombique, l’axe de la fibre est défini par l’axe cartésien lié à l’orientation de l’axe de la fibre dans le modèle utilisé.
      2. Assurez-vous que les axes de la poutre sont perpendiculaires à l’axe de la fibre, c’est-à-dire sur l’un des deux autres axes possibles. Enregistrez les paramètres de simulation sous forme de fichiers .html (Fichier : Enregistrer comme). Ces derniers peuvent être téléchargés et édités ultérieurement pour explorer de manière itérative la structure optimale du modèle.
      3. Sauvegardez le motif simulé résultant dans un format brut, qui pourra être téléchargé ultérieurement pour une analyse plus approfondie, ou sous forme de .tiff (ce format a supprimé des informations de contraste supplémentaires) (Simulation : Enregistrer l’image visible sous forme TIFF). Ensuite, comparez-les au schéma expérimental.
  2. Comparez les motifs de diffraction simulés avec les schémas expérimentaux pour la présentation.
    1. Utilisez les étapes 2.1.5-2.1.6 pour mesurer les signaux de diffraction simulés et comparer avec ceux mesurés à partir de motifs expérimentaux (Figure 6). Note ces éléments dans un tableau.
    2. Utilisez un module appelé Layers (Diffraction Pattern : Layers) pour superposer des motifs simulés et expérimentaux afin de comparer les positions des signaux ( Figure 6C).
    3. Comparez les positions des signaux et les intensités relatives entre les motifs expérimentaux et simulés en disposant un quadrant du motif simulé à côté du motif expérimental (comme montré à la Figure 6B)8,20,21.
    4. Évaluer la validité d’une cellule unitaire et d’un modèle suggérés, puis modifier itérativement le modèle et la cellule pour améliorer la similarité entre le motif simulé et le motif de diffraction expérimental.
    5. Comparez de manière approfondie les résultats de différents modèles et cellules en utilisant la procédure décrite à l’étape 3.1 pour tester plusieurs alternatives. Assurez-vous que les informations recueillies à partir d’autres techniques, telles que TEM, AFM et RMN, sont considérées comme contraignant la modélisation et permettant d’obtenir la meilleure représentation structurelle possible correspondant auxdonnées 8,21,22,23.

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Résultats

Exemple24 de CcbMet : Figure 1 montre des micrographies électroniques montrant une forte densité de fibrilles amyloïdes sur une grille adaptée à la préparation d’un échantillon de fibre de rayons X. La Figure 2 décrit les différentes textures pouvant être générées à partir du faisceau fibreux des échantillons fibreux (Figure 2A), du disque (

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Discussion

La diffraction des fibres X peut être utilisée pour évaluer si un échantillon forme une structure amyloïde et pour mieux comprendre l’organisation moléculaire de la protéine ou du peptide précurseur au sein des fibres. Ici, nous avons décrit les méthodes par lesquelles des échantillons fibreux peuvent être préparés pour la diffraction des fibres aux rayons X, les données peuvent être obtenues, puis analysées. De manière cruciale, la qualité des données obtenues dépendra à la fois de l’or...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer

Remerciements

Les auteurs souhaitent remercier le Dr Pawel Sikorski et le professeur Edward Atkins pour le développement du programme CLEARER et l’analyse des patterns. L’émission a été écrite par le Dr O Sumner Makin. Ce travail a été soutenu par des financements de l’Alzheimer’s Research Trust et du BBSRC.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Capillaires en quartz pour rayons X de 0,7 mm de diamètre GLAS, W. Muller, D-13503, Berlin, AllemagneQ-07-001-80
Capillaires en verre borosilicate de 1,5 mmHarvard appatus Ltd, (Edenbridge, Kent, R-U)BS4 30-0074exemple, disponible chez d'autres fabricants
Diffractomètre à rayons X pour la cristallographie des protéinesDiversDivers fabricants

Références

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Mots-clés

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