Un flux de travail complet pour la protéomique plasmatique par spectrométrie de masse : une stratégie pour la découverte de biomarqueurs dans les maladies humaines systémiques

Résumé

La protéomique plasmalogique permet la découverte de biomarqueurs pour les maladies systémiques par échantillonnage peu invasif. Malgré les défis analytiques posés par la complexité plasmatique, cette étude présente un flux de travail optimisé en chromatographie liquide et spectrométrie de masse (LC-MS/MS) qui améliore la couverture protéomatique, réduit la variabilité et améliore la reproductibilité, permettant des comparaisons précises entre les échantillons de maladies et témoins.

Résumé

Le plasma, composant acellulaire du sang, offre une source d’informations biomoléculaires peu invasive et riche, ce qui le rend idéal pour l’étude des maladies systémiques. L’avènement des technologies protéomiques à haut débit a révolutionné l’analyse plasmaque en permettant l’identification et la quantification à grande échelle des protéines circulantes. Ces avancées ont facilité la découverte de biomarqueurs pour un diagnostic précoce, le pronostic et le ciblage thérapeutique de divers troubles, y compris les cancers et les maladies inflammatoires. Cependant, la complexité inhérente du plasma, ainsi que des méthodes incohérentes de préparation et d’analyse des échantillons, ont historiquement limité la couverture et la reproductibilité du protéome. Les premières approches reposant sur l’analyse du plasma rudimentaire souffraient souvent d’une mauvaise cohérence et d’effets de lot significatifs, ce qui entrava des études comparatives fiables entre cohortes cliniques.

Pour surmonter ces limites, l’étude actuelle introduit un flux de travail protéomique plasma robuste et évolutif. Le protocole intègre des étapes préparatoires clés telles que l’immunodéplétion, la filtration de coupure du poids moléculaire, la lyophilisation, la quantification et la normalisation des protéines, la digestion enzymatique et le profilage LC-MS/MS. Cette stratégie optimisée améliore considérablement la profondeur du protéome et réduit la variabilité, permettant ainsi une analyse plus précise et reproductible de l’expression protéique différentielle entre les cas de maladie et les témoins sains. Ce flux de travail offre une plateforme précieuse aux chercheurs souhaitant générer des données protéomiques de haute qualité à partir du plasma, contribuant ainsi à l’avancement des diagnostics pilotés par biomarqueurs et de la médecine personnalisée.

Introduction

Le plasma, la composante libre de cellules du sang, gagne en reconnaissance comme réservoir d’informations biologiques pertinentes pour les études sur les maladies. Il contient une multitude de biomolécules circulantes diverses, allant des protéines et métabolites aux lipides et acides nucléiques, ce qui reflète le statut physiologique et pathologique de l’organisme. Cette nature systémique du plasma en fait un biospécimen idéal pour l’investigation de la physiopathologie des maladies, allant du cancer aux troubles métaboliques et inflammatoires. Un avantage majeur de l’utilisation du plasma comme échantillon réside dans sa méthode de collecte peu invasive, permettant un échantillonnage répété en milieu clinique, ce qui est important pour l’observation de la progression de la maladie ou de la réponse thérapeutique. Cependant, le plasma présente une matrice protéomique extrêmement complexe, où les niveaux de protéines telles que l’albumine et l’immunoglobuline dépassent dix ordres de grandeur, masquant ainsi l’identification¹.

Au cours des deux dernières décennies, la protéomique plasmatique a permis l’identification de biomarqueurs cliniquement pertinents tels que la gonadotrophine chorionique bêta-humaine (β-hCG) et la troponine I, portée par les avancées dans les technologies d’analyse protéique^{à grande échelle 2}. Ces outils acceptent, en entrée, des informations hautement sensibles et, grâce à leur nature à haut débit, fournissent un profilage à grande échelle des protéines plasmatiques. Avec l’avènement des plateformes de chromatographie liquide-spectrométrie de masse (LC-MS/MS), il est désormais possible d’analyser des milliers d’espèces de protéines en utilisant aussi peu que 10 à 50 μL d’apport plasma, avec une plage de détection dynamique couvrant plusieurs ordres de^{grandeur 3,4}. Cela a accru l’utilisation de la protéomique plasmatique dans la recherche translationnelle : détection précoce de la maladie, amélioration des modèles pronostiques et découverte de nouvelles cibles^{thérapeutiques 5}.

Une étape importante dans ce domaine fut la création du Human Plasma Proteome Project (HUPO-HPPP), qui a catalogué systématiquement les protéines plasmatiques et démontré la faisabilité de la protéomique plasmatique en tant que champ établi⁶. Par la suite, le Clinical Proteomic Tumor Analysis Consortium (CPTAC) a adopté des protocoles rigoureusement validés et des études inter-laboratoires pour traiter des questions de reproductibilité qui auparavant contredisaient la recherche^{protéomique 7}. Ces initiatives ont souligné la nécessité de standardisation et ont mis en lumière des procédures clés, notamment la manipulation uniforme du plasma, l’appauvrissement des protéines abondantes, la digestion enzymatique et la cohérence des paramètres LC-MS/MS. Des études récentes menées par Geyer et ses collègues ont montré que les signatures protéomiques plasmatiques peuvent être générées de manière fiable chez de nombreux individus lorsque des méthodologies standardisées sont utilisées, fournissant une base pour des études au niveau de la population et des processus de validation de^{biomarqueurs 8}.

La progression de la protéomique plasmalogique a été considérablement influencée par la reconnaissance du contrôle qualité (QC) et des indicateurs de performance comme éléments critiques de la conception expérimentale. Conventionnellement, les différences d’efficacité digestive, de taux d’identification des peptides et de performance de l’instrument ont entraîné des incohérences entre les études, affectant ainsi la reproductibilité. De nombreuses études ont été menées pour traiter ces problèmes. Gawor et al. ont présenté des indicateurs mesurables de qualité pour la préparation des échantillons et la performance en spectrométrie de masse, fournissant ainsi une méthode systématique pour évaluer la robustesse du pipeline de profilage^{des protéines 9}. Tsantilas et al. ont présenté des outils informatisés de benchmarking permettant aux chercheurs de comparer des ensembles de données entre plateformes et laboratoires, augmentant ainsi la transparence dans la présentation des données de^{protéomique 10}. De plus, les avancées méthodologiques, telles que l’immunodéplétion, le fractionnement par exclusion de taille et l’acquisition indépendante des données (DIA), ont amélioré la couverture protéomique et réduit le biais^{technique 11,12}. Ces mesures d’assurance qualité garantissent que les données protéomiques plasmatiques sont reproductibles et servent d’échafaudage pour les futures études de traduction clinique.

Malgré ces avancées majeures, la complexité inhérente du plasma continue de présenter des défis. Il est courant que l’analyse directe du plasma brut donne une couverture protéomique sous-optimale, car des protéines très abondantes submergent les analytes à faible abondance, dont beaucoup sont les candidats biomarqueurs les plus prometteurs. De plus, la variation technique résultant de la quantification variable des protéines, d’une digestion incomplète et d’un nettoyage insuffisant peut contribuer à des artefacts de lots et à une diminution de la comparabilité des^{cohortes 13}. Ces limitations soulignent la nécessité de workflows hautement optimisés qui équilibrent profondeur, reproductibilité et scalabilité du protéome. Ce protocole d’étude répond à ce besoin en démontrant un flux de travail optimisé pour la protéomique plasmalogique combinant immunodéplétion, filtration à coupure de poids moléculaire, lyophilisation, normalisation et quantification des protéines, digestion enzymatique et profilage LC-MS/MS. En augmentant la couverture du protéome et en réduisant la variation technique, le cadre méthodologique permet une quantification relative cohérente entre les groupes affectés par la maladie et les groupes témoins. En introduisant une scalabilité et en accommodant des analyses en aval, le flux de travail offre une méthode utilisable et reproductible pour extraire des informations cliniquement significatives de la protéomique plasmique.

Protocole

Ce protocole décrit un flux de travail simplifié conçu pour améliorer la protéomique plasmalogique pour la découverte de biomarqueurs dans les maladies inflammatoires^{systémiques 14,15}. L’étude a été réalisée conformément au Comité d’éthique institutionnelle et à la Déclaration d’Helsinki de 1975, révisée en 2000. Un consentement éclairé a été obtenu des participants. Au départ, les échantillons de plasma subissent une immunodéplétion pour éliminer les protéines à forte abondance, suivies d’une filtration à base de poids moléculaire pour réduire la complexité des échantillons. Les échantillons sont ensuite lyophilisés et quantifiés pour garantir que la concentration en protéines soit adéquate pour le traitement en amont. Après la normalisation, les protéines sont soumises à une digestion tryptique afin de générer des peptides adaptés à l’analyse. Enfin, la spectrométrie de masse est employée pour détecter et quantifier les protéines à faible abondance, facilitant des comparaisons fiables entre les conditions saines et les maladies (la Figure 1) montre le pipeline de protéomique sanguine.

1. Collecte d’échantillons :

1. Obtenir 3 mL de sang auprès des participants aux tubes à vacutainer à l’acide éthylénédiaminetétraacétique (EDTA) par ponction venéline dans la veine antéricubitale dans des conditions aseptiques. Cela est réalisé par un phlébotomiste formé.
2. Pour séparer le plasma, centrifugez les échantillons (rotor à angle fixe avec 12 × 15 mL) pendant 10 minutes à 704 g. Conservez les échantillons de plasma à -80 °C jusqu’à l’examen ultérieur.

2. Immunodéplétion

REMARQUE : L’immunodéplétion est une méthode basée sur la chromatographie d’affinité utilisée pour éliminer sélectivement des protéines à forte abondance des fluides biologiques tels que le sérum, le plasma et le liquide céphalorachidien (LCR). Une cartouche spin contenant des anticorps immobilisés cible et capture 14 protéines courantes à forte abondance, dont l’albumine, les immunoglobulines (IgG, IgA, IgM), la transférine et le C3 du complément. Ces protéines sont conservées dans la cartouche tandis que les protéines à faible abondance passent pour une analyse ultérieure. La technique améliore le profilage protéomique en réduisant la complexité des échantillons et en améliorant la détection de biomarqueurs potentiels. Cette approche est largement adoptée en protéomique plasmalogique pour améliorer la sensibilité et la^{reproductibilité 16,17}.

1. Préparation de la cartouche
   1. Retirez la cartouche de rotation de 0,45 mL du réfrigérateur. Laissez-la s’équilibrer avec la température ambiante.
   2. Préparez l’élution Buffer A Équil/Charge/Wash et Buffer B selon le nombre d’échantillons traités. Appliquez environ 5 mL de tampon A et 2 mL de tampon B par échantillon de plasma de 10 μL. Faire une décantation dans des tubes centrifugeuses stériles de 50 mL.
   3. Étiquetez deux seringues Luer-Lok stériles de 5 mL comme A pour le tampon A et B pour le tampon B.
2. Préparation de l’échantillon de plasma
   1. Diluez chaque échantillon de 10 μL de plasma avec 190 μL de tampon A pour obtenir un volume final de 200 μL.
      REMARQUE : Ajoutez des inhibiteurs de protéases au tampon A pour éviter la dégradation des protéines plasmatiques lors du traitement.
   2. Un échantillon de plasma peut contenir des particules particulaires. Cela peut boucher la cartouche. Pour éviter les bouchons et améliorer la clarté de l’échantillon, centrifugez l’échantillon dilué à travers un filtre à spin de 0,22 μm pendant 1 minute à 16 000 ×g à 4 °C.
3. Configuration des cartouches
   1. Retirez le bouchon de la cartouche et le bouchon du bas et rangez-les pour une utilisation ultérieure.
   2. Placez un adaptateur Luer-Lok sur la cartouche de rotation.
   3. Extraire 4 mL de tampon A dans la seringue étiquetée « A » et connecter la seringue à l’adaptateur Luer-Lok.
   4. Faites progressivement circuler le tampon A à travers la cartouche pour permettre à la résine de s’équilibrer et de déplacer tout air piégé.
   5. Aspirez l’excès de tampon du dessus de la cartouche avec une micropipette stérile.
   6. Retirez l’adaptateur Luer-Lok et déposez la cartouche de rotation dans un tube de collecte à bouchon à vis marqué F1.
4. Chargement d’échantillons et collecte de fractions
   1. Ajoutez 200 μL de plasma filtré et dilué directement sur le lit de résine.
   2. Centrifugez la cartouche à 100 × g pendant 1 minute à 4 °C. Laissez la cartouche sans bouchon ou légèrement recouverte pour permettre un flux fluide.
   3. Collectez la fraction de flux direct F1 dans le tube de collecte étiqueté. Assurez-vous que le lit de résine et la fritte restent humides après centrifugation.
   4. Laissez la cartouche reposer à température ambiante pendant 5 minutes.
5. Lavage et récupération des fractions à flux
   1. Ajoutez 400 μL de tampon A sur le lit de résine et centrifugez à 100 × g pendant 2,5 minutes à 4 °C. Ajoutez cet éluat au tube de collecte F1.
   2. Transférez la cartouche dans un nouveau tube de collecte étiqueté F2.
   3. Ajoutez encore 400 μL de tampon A et centrifugez à 100 × g pendant 2,5 minutes à 4 °C. Collectez l’éluate dans le tube F2.
6. Élution des protéines liées
   1. Retirez la cartouche du tube F2 et connectez l’adaptateur Luer-Lok.
   2. Remplissez la seringue étiquetée « B » avec 2,5 mL de Buffer B et attachez-la à la cartouche.
   3. Poussez lentement le tampon B à travers la cartouche pour éluvoir les protéines à forte abondance liées dans un tube de collecte frais.
      REMARQUE : Conservez la fraction liée si une analyse supplémentaire est requise ; sinon, défaussez-le de manière appropriée.
7. Rééquilibrage de la cartouche
   1. Retirez la seringue contenant le tampon B de la cartouche et fixez la seringue marquée « A » contenant 5 mL de tampon A.
   2. Poussez lentement le tampon A à travers le lit de résine pour rééquilibrer la cartouche à un débit de 0,5 mL par minute.
      REMARQUE : Ne laissez pas sécher le lit en résine ou la frite. Laissez une petite quantité de tampon sur le dessus de la fritte pendant le stockage.
   3. Une fois équilibrée, la cartouche est prête pour l’échantillon suivant.
8. Utilisation en aval
   1. Pour une récupération maximale des protéines à faible abondance, combinez les fractions de flux F1 et F2.
      REMARQUE : F1 et F2 peuvent également être analysés séparément si une analyse différentielle est nécessaire. Le tampon ajouté est de 1 mL, donc la fraction combinée F1 peut être de ~850 μL pour assurer une bonne récupération. Analysez le plasma brut, le flux traversant et l’éluat par électrophorèse en gel de dodécyle sulfate de sodium polyacrylamide (SDS-PAGE) afin de confirmer l’élimination des 14 protéines à forte abondance du flux traversant. 12,5 μL d’écoulement à travers F1, plasma brut et éluate seront utilisés pour charger dans le gel afin d’obtenir un volume de puits de 25 μL (tampon d’échantillon de Laemmli : rapport d’échantillonnage 2:1)

3. Concentration en protéines à l’aide d’un concentrateur de spin de 5 kDa

REMARQUE : La concentration d’un échantillon à l’aide d’un concentrateur de spin de 5 kDa repose sur le principe d’exclusion de taille et de filtration moléculaire afin d’obtenir une concentration rapide et une récupération élevée des biomolécules cibles dans un seul tube. Cela permet la concentration des protéines par suppression de l’échange de solvants et de tampons ou par le dessalage de la solution protéique.

1. Remplissez le concentrateur de spin avec jusqu’à 4 mL de l’échantillon de protéine.
2. Placez le concentrateur de spin dans une centrifugeuse réfrigérée.
3. Centrifugez à 5 000 × g à 10 °C pendant 30 minutes, ou jusqu’à ce que la réduction de volume souhaitée (par exemple, 30× concentration) soit atteinte.
4. Retirez le concentrateur de spin de la centrifugeuse et récupérez l’échantillon concentré au fond de la chambre de rétentation à l’aide d’une micropipette. Pour assurer une bonne récupération, attendez-vous à ~150 μL de concentré récupéré sur un échantillon total de 850 μL de protéines.
   REMARQUE : Veillez à ce que la membrane ne sèche pas pendant la centrifugation afin de préserver l’intégrité des protéines et l’efficacité de récupération.

4. Dessalage et échange de tampons

1. Éliminez le filtrat de la chambre inférieure du concentrateur.
2. Remplissez le tube de centrifugeuse avec un volume égal de 50 mM de tampon bicarbonate d’ammonium (pH 7,2-7,4). (Par exemple, si le retente est de 150 μL, ajoutez 150 μL de tampon)
3. Centrifugez à nouveau à 5 000 × g à 10 °C jusqu’à atteindre la concentration initiale.
4. Répétez ce processus d’échange tampon trois fois pour éliminer environ 99 % des contaminants de petites molécules tels que les sels ou l’urée.
5. Concentrez les échantillons de protéines en les lyophilisant à l’aide d’un lyophiliseur sous vide rapide.
   REMARQUE : Ajustez le nombre de cycles en fonction du degré de désalage nécessaire pour les applications en aval.

5. Quantification des protéines à l’aide d’un test à l’acide bicinchoninique (BCA)

REMARQUE : La concentration en protéines des échantillons a été déterminée à l’aide du test sur la protéine BCA, avec l’albumine sérique bovine (BSA) comme étalon. Le test BCA est une méthode colorimétrique compatible avec le détergent et basée sur l’acide bicinchoninique permettant de détecter et de quantifier la protéine totale. Elle repose sur la réduction du Cu²⁺ en Cu⁺ par des protéines dans un environnement alcalin (la réaction de Biuret), suivie d’une détection colorimétrique très sensible et sélective de l’ion cupros (Cu⁺) à l’aide d’un réactif contenant de l’acide bicinchoninique. Le test produit un complexe de couleur violette formé par la chélation d’un ion cuprieux avec deux molécules de BCA. Le test BCA produit une réponse linéaire cohérente avec la BSA, garantissant une référence fiable de la courbe standard. Bien qu’il soit connu que différentes protéines produisent des réponses différentes dans le test BCA, l’utilisation de BSA permet une quantification relative reproductible à travers divers échantillons. Puisque notre objectif était la normalisation pour une charge égale en protéines plutôt que la quantification absolue de chaque espèce, l’étalonnage basé sur les BSA offrait l’approche la plus robuste et reproductible.

1. Procédure
   1. Ajoutez 25 μL de chaque standard BSA (plage de travail 20-2000 μg/mL) et l’échantillon de protéine inconnu dans des puits désignés d’une plaque de 96 puits.
   2. Ajoutez 200 μL de réactif BCA actif à chaque puits.
   3. Mélangez soigneusement avec un vibrateur à microplaques pendant 30 secondes.
   4. Couvrez l’assiette et faites éclore à 37 °C pendant 30 minutes.
   5. Apportez l’assiette à température ambiante.
   6. Mesurez l’absorbance à 562 nm à l’aide d’un lecteur de microplaques.
2. Analyse des données
   1. Soustrayons l’absorption moyenne de l’espace blanc (protéine nulle) de toutes les valeurs d’échantillon et d’absorbance standard.
   2. Tracez une courbe standard d’absorption par rapport à la concentration de BSA (microgramme/microlitre).
   3. Utilisez l’équation de régression de la courbe pour calculer les concentrations de protéines dans des échantillons inconnus.

6. Normalisation de la concentration en protéines

1. Procédure
   1. Mesurez la concentration en protéines de chaque échantillon plasmatique à l’aide d’une méthode de quantification appropriée.
   2. Notez la concentration et le volume total de chaque échantillon.
   3. Préparez un tampon de 50 mM au bicarbonate d’ammonium (pH 7,8) comme diluant.
   4. Calculez la dilution requise en utilisant la formule C₁V₁ = C₂V₂.
   5. Pour un échantillon avec une concentration de 1,3 mg/mL et un volume de 100 μL, calculer le volume final nécessaire pour atteindre 1 mg/mL : [V₂ = \frac{1,3 \fois 100}{1} = 130\ \mu L]
   6. Calculer le volume de tampon à ajouter en soustrayant le volume initial du volume final : Volume tampon = 130 μL − 100 μL = 30 μL.
   7. Ajoutez 30 μL de bicarbonate d’ammonium de 50 mM (pH 7,8) à l’échantillon de plasma de 100 μL.
   8. Mélangez l’échantillon doucement en pipettant ou en faisant un vortex bref.
   9. Confirmez que le volume final est de 130 μL à une concentration normalisée de 1 mg/mL.
   10. Procédez à la préparation protéomique en aval.
       REMARQUE : Assurez-vous d’ajuster la concentration avec précision en calculant le facteur de dilution requis en fonction des résultats de l’analyse BCA. Chaque étape est validée, et les données sont données en supplément (Tableau Supplémentaire 1).

7. Préparation de l’échantillon et digestion tryptique

1. Réduction des protéines
   1. Ajouter un agent réducteur approprié (par exemple, 1,4-dithiothréitol [DTT]) à la solution protéique dans un tampon de bicarbonate d’ammonium pour obtenir une concentration finale de 100 mM.
   2. Incubez le mélange à 60 °C pendant 30 minutes dans un thermomixeur ou un bloc chauffant.
      ATTENTION : Le DTT est un irritant et doit être manipulé avec des gants à l’intérieur d’une hotte d’aspiration.
      REMARQUE : Des informations supplémentaires sur la trypsine utilisée pour la digestion ont été fournies dans le Tableau des matériaux. En résumé, la trypsine traitée à la Tosyl Phénylalanyl Chlorométhyl Cétone (TPCK) de qualité séquençage (pour éliminer l’activité chymotryptique) a été utilisée pour garantir une haute spécificité de clivage aux résidus de lysine et d’arginine. L’activité enzymatique a été vérifiée selon les spécifications du fabricant, correspondant à une activité d’ester éthylique N-Benzoyl-L-Arginine (BAEE) d’environ 1 unité par mg de protéines. Concernant les concentrations de DTT et d’iodo acétamide (IAA), nous confirmons que les 100 mM de DTT et 200 mM d’IAA concernent des solutions standards, et non les concentrations finales utilisées dans la réaction. Les concentrations de travail finales lors de la réduction et de l’alkylation se situaient dans la plage standard (typiquement 5-10 mM DTT et 10-20 mM IAA, respectivement).
2. Alkylation des résidus de cystéine
   1. Laissez l’échantillon refroidir à température ambiante pendant 5 minutes après la réduction.
   2. Centrifugez brièvement pour collecter le condensat au fond du tube.
   3. Ajouter 200 mM d’IAA préparé dans un tampon de 50 mM bicarbonate d’ammonium (ABC) pour alkyler les résidus de cystéine réduits.
   4. Incubez l’échantillon dans le noir à température ambiante pendant 30 minutes pour éviter la dégradation de l’IAA.
      REMARQUE : L’iodoacétamide est sensible à la lumière et potentiellement toxique ; Évitez l’exposition et manipulez la porte en faible luminosité.
3. Digestion enzymatique
   1. Préparez de la trypsine modifiée de qualité séquençage dans un tampon ABC de 50 mM immédiatement avant utilisation.
   2. Ajoutez la trypsine à chaque échantillon avec un ratio trypsine à protéine de 1:25 (v/w).
   3. Incubez la réaction à 37 °C pendant 17 heures pour permettre une digestion enzymatique complète.
      REMARQUE : Des temps de digestion prolongés peuvent entraîner une surdigestion ; Assurez-vous de la stabilité de la température tout au long de l’incubation.
4. Éteindre la réaction
   1. Arrêtez la réaction enzymatique en ajoutant de l’acide formique à chaque échantillon pour atteindre une concentration finale de 1,0 % (v/v).
   2. Incuber à 37 °C pendant 20 minutes pour dénaturer la trypsine résiduelle et stabiliser le mélange de peptides.
      ATTENTION : L’acide formique est corrosif ; Utilisez un équipement de protection individuelle (EPI) approprié et travaillez dans une hotte chimique.
5. Récupération de peptides
   1. Centrifugez le mélange de peptides digérés à 3500 g pendant 12 minutes à température ambiante pour éliminer le matériau insoluble.
   2. Transférez soigneusement le supernageant transparent contenant les peptides digérés dans des fioles d’autoéchantillonnage sans perturber la pellete.
   3. Conserver les solutions peptidiques à -20 °C jusqu’à une analyse LC-MS/MS supplémentaire.
6. Préparation à l’analyse LC-MS
   1. Chargez les échantillons de peptides directement sur le système LC-MS équipé de mobilité ionique pour la séparation et l’analyse des peptides.
   2. Assurez-vous que toutes les fioles sont correctement scellées pour éviter l’évaporation et la contamination.

8. Analyse MS-MS LC

1. Charge peptidique et désalage
   1. Chargez 1 μg de l’échantillon de peptide dans une boucle d’échantillon en mode injection partielle.
   2. Désalinez les peptides à l’aide d’une colonne de piège au C18 en les lavant avec un solvant aqueux contenant 0,1 % d’acide formique à un débit de 15 μL/min pendant 1 minute.
      REMARQUE : Utilisez de l’eau contenant 0,1 % d’acide formique comme solvant A et de l’acétonitrile avec 0,1 % d’acide formique comme solvant B tout au long de la distillation.
2. Séparation peptidique
   1. Reliez la colonne de siphon en ligne à une colonne C18 analytique à phase inversée.
   2. Peptides élutes en utilisant un gradient linéaire de 3 % à 40 % de solvant B sur 55 minutes à un débit de 300 nL/min.
   3. Rincez la colonne avec du solvant B à 80 % pendant 7,5 minutes pour éliminer les composants retenus.
   4. Rééquilibrez la colonne avec 3 % de solvant B avant la prochaine injection.
   5. Maintenez le four à colonne à 35 °C et l’autoéchantillonneur à 4 °C pendant le tirage.
      REMARQUE : Inclure des injections à vide entre les échantillons pour minimiser le reflux.
3. Paramètres d’acquisition par spectrométrie de masse
   1. Analyse spectrale de masse des peptides élués
      1. Configurez le système UPLC et couplez-le directement au MS haute définition.
      2. Contrôlez le système à l’aide d’un logiciel Microsoft.
      3. Assurez-vous que le spectromètre de masse est configuré comme un instrument hybride quadrupole-ion de mobilité-accélération-temps de vol orthogonal (oa-TOF).
      4. Vérifiez que toutes les connexions azote et gaz de pulvérisation sont sécurisées et sans fuite avant d’initier l’opération.
         ATTENTION : Manipuler les connexions haute tension et les gaz sous pression conformément aux normes de sécurité en laboratoire.
   2. Installation d’ionisation
      1. Faites fonctionner le spectromètre de masse en mode ionisation positive par électropulvérisation (ESI) à l’aide d’une double source d’électropulvérisation.
      2. Réglez la tension capillaire nano-ESI à 3,4 kV.
      3. Ajustez la tension du cône d’échantillon à 40 V et celle du cône d’extraction à 4 V.
      4. Régler le flux d’azote par spectrométrie de mobilité ionique (IMS) à 90 mL/min.
      5. Inspectez la stabilité du pulvérisateur et assurez-vous qu’un courant ionique est constant avant de poursuivre.
   3. Séparation de la mobilité des ions
      1. Régler la hauteur de l’impulsion du guide ionique IMS à 40 V lors de la transmission ionique.
      2. Ajustez la vitesse du guide ionique IMS à 800 m/s.
      3. Augmentez linéairement la hauteur de l’onde de voyage de 8 V à 20 V sur tout le cycle IMS pour obtenir une séparation optimale des ions par mobilité.
         ATTENTION : Assurez un débit stable de gaz IMS ; Les fluctuations peuvent affecter la séparation des ions et la reproductibilité du temps de dérive.
   4. Étalonnage de masse par verrou
      1. Calibrez l’analyseur de temps de vol (TOF) à l’aide d’une solution de 2 μg/μL d’iodure de sodium (NaI).
      2. Réglez la plage d’étalonnage pour détecter les ions entre 50 m/z et 2000 m/z.
      3. Acquérir des spectres de référence de masse de verrouillage tous les 45 s en utilisant le canal source d’ions à double électropulvérisation pour une correction de masse en temps réel.
      4. Vérifiez que la courbe d’étalonnage atteint une précision de masse dans ±5 ppm avant de procéder à l’acquisition des données.
4. Acquisition de données
   1. Acquérir des données en mode continu, en alternant entre deux fonctions :
      1. Fonction 1 (MS à basse énergie) : Enregistrer les spectres ioniques précurseurs à basse énergie.
      2. Fonction 2 (HDMSE haute énergie) : Enregistrer les spectres d’ions fragmentés à une énergie de collision élevée avec séparation de mobilité des ions.
   2. Dans la fonction 2, réglez l’énergie de collision dans la région Trap à 4 eV.
   3. Augmentez l’énergie de collision dans la région de transfert de 20 eV à 45 eV pour obtenir une fragmentation peptidique contrôlée.
   4. Régler le temps d’acquisition spectrale par fonction à 0,9 s et le délai interscan à 0,024 s.
   5. Surveillez la chromatogramme ionique totale (TIC) pour confirmer la réponse constante de l’instrument tout au long de la course.
   6. Importez des données brutes dans un logiciel d’analyse protéomique (par exemple, Progenesis QI ou équivalent).
   7. Alignez les chromatogrammes entre les séquences en utilisant la référence d’alignement par défaut ou une série de référence sélectionnée manuellement.
   8. Identifier les peptides et protéines à l’aide d’une base de données soigneusement sélectionnée (par exemple, UniProt Human - uniquement les entrées examinées).
   9. Définissez les paramètres de recherche suivants :
      Enzyme : Trypsine
      Modification fixe : Carbamidyylation (C)
      Modification variable : Oxydation (M)
      Tolérance aux peptides : selon la résolution de l’instrument
      Décolteures manquées autorisées : 1
      Taux de fausses divulgations (FDR) : ≤ 1 %
   10. Effectuer la normalisation en utilisant la méthode de normalisation à toutes les protéines .
   11. Appliquer des seuils de filtrage : ≥2 peptides par protéine, ≥1 peptide unique, changement de repliement ≥1,5, et valeur p ajustée <0,05.
       REMARQUE : Il s’agit d’un guide général sur la sécurité en laboratoire : respectez toujours les règlements EHS (Santé et Sécurité Environnementale) de l’institution ainsi que les exigences légales locales.
5. Contrôle qualité
   1. Effectuer des contrôles d’étalonnage avant et après l’exécution en utilisant la norme NaI pour confirmer la précision de masse.
   2. Assurez-vous que la référence de masse du verrou reste stable tout au long de l’analyse.
   3. Évaluer les injections de réplication afin de confirmer la reproductibilité du temps de rétention, du temps de dérive et de l’intensité spectrale.
      ATTENTION : L’iodure de sodium est un irritant. Lors de la manipulation, portez des gants et évitez l’inhalation ou le contact avec la peau.
      REMARQUE : Consultez le Fichier Supplémentaire 1 pour des conseils sur l’élimination des déchets. Toujours travailler dans un environnement froid ou sur de la glace lors de la manipulation d’échantillons de plasma afin d’éviter la dégradation des protéines. Portez des gants Nitryl, une blouse de laboratoire et une protection oculaire lors de la manipulation d’échantillons biologiques et de tampons. Effectuez les étapes de centrifugation à l’aide d’une centrifugeuse réfrigérée pré-refroidie à 4 °C. Assurez-vous que tous les tubes de centrifugeuse et les seringues utilisés sont stériles et correctement étiquetés pour éviter toute contamination croisée. Utilisez toujours de l’eau de qualité protéomique pour préparer les tampons.

Résultats

Des échantillons plasmatiques ont été traités à l’aide d’une cartouche de spin pour retirer sélectivement 14 protéines à forte abondance, à savoir l’albumine, l’IgG, l’IgA, la transférrine, l’haptoglobine, l’antitrypsine, le fibrinogène, l’alpha2-macroglobuline, la glycoprotéine alpha1-acide, l’IgM, l’apolipoprotéine AI, l’apolipoprotéine AI, l’apolipoprotéine AII, le complément C3 et la transthyrétine. Cette étape de déplétion a été cruciale pour améliorer la détection des biomarqueurs ...

Discussion

La complexité intrinsèque du plasma en tant que matrice biologique représente un défi majeur pour l’analyse protéomique. L’énorme plage dynamique des concentrations de protéines, ainsi que la prédominance de quelques espèces à forte abondance, peuvent masquer la détection de protéines cliniquement pertinentes et à faible abondance. Pour cette étude actuelle, nous avons atténué ces inconvénients en utilisant un pipeline standardisé en plusieurs étapes pour la préparation des échantillons,...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Concentrateur de spin de coupure de poids moléculaire de 5 kDa	Agilent Technologies	5185 et moins ; 5991	Utilisé pour l’échange de tampons et l’élimination du sel ; conserve les protéines au-dessus de 5 kDa
Bicarbonate d’ammonium (ABC)	Sigma Aldrich	Numéro de catalogue : T6567	Utilisé pour la digestion tryptique
Buffer A Équil/Charge/Lavage   ;	Agilent Technologies	5185-5987
Élution du tampon B   ;	Agilent Technologies	5185-5988
Centrifugeuse à refroidissement	Centrifugeuse réfrigérée CPR-30 Plus	N/A	Utilisé pour centrifuger des échantillons de protéines à basse température
TDT	Sigma Aldrich	; CASNo : 3483-12-3	Utilisé pour la digestion tryptique
Appareil électrophorétique	BIO RAD	1658004	Utilisé pour SDS PAGE
IAA	Sigma Aldrich	Numéro de code : 144-48-9	Utilisé pour la digestion tryptique
IMS T-Wave & nbsp ;	Eaux	https://www.waters.com/content/dam/waters/en/library/white-papers/2012/water-whitepapers-Triwav eMaisComplèteCaractérisation de Mi xturesandMolecules-720004176.pdf	Séparation de la mobilité ionique (IMS)
Lecteur multimode Infinite M Plex	TECAN		Lecteur multiplé
Système LC-MS	Eaux	https://www.waters.com/nextgen/us/en/products/mass-spectrometry/mass-spectrometry-systems/liquid-chromatography-ms-systems.html
Logiciel MassLynx 4.1 SCN781	Eaux	https://www.waters.com/nextgen/us/en/products/informatics-and-software/mass-spectrometry-software/masslynx-mass-spectrometry-software.html	Logiciels de spectrométrie de masse
Cartouche de spin à élimination multiple d’affinité humaine 14 (MARS Hu-14)	Agilent Technologies	5188 et moins ; 6560	Utilisé pour épuiser 14 protéines plasmatiques à forte abondance, dont l’albumine, l’IgG, l’IgA, la transférine, etc.
Système UPLC nanoACQUITY	Eaux	https://www.waters.com/nextgen/en/products/chromatography/chromatography-systems/acquity-uplc-m-class-system.html
NanoLockSpray	Eaux	https://www.waters.com/nextgen/us/en/services/instrument-services/instrument-upgrades/mass-spectrometry-ms-upgrades/nanolockspray-exact-mass-ionization-source-upgrade.html
Opéron FDU-7003	Opéron	http://www.operon.co.kr/en/pro2-FDU.html	Lyophiliseur à vide rapide
Kit de test protéique Pierce BCA	Thermo Scientific	23225	Utilisé pour quantifier la concentration en protéines à l’aide d’un test colorimétrique
Progenesis QI pour la protéomique   ;	Eaux	V4.2  ;
Centrifugeuse R-8C BL Laboratory, rotor à angle fixe avec 12 et plus de fois ; 15 mL	REMI		Centrifugeuse
SYNAPT G2 MS haute définition	Système HDMSE, Waters Corporation	https://www.waters.com/content/dam/waters/en/app-notes/2009/720003057/720003057-en.pdf	Spectromètre de masse hybride à accélération orthogonale IMS (oa-Tof)
Flacon de récupération totale	Eaux	https://www.waters.com/nextgen/us/en/shop/vials-containers--collection-plates/186004631-clear-glass-12-x-32-mm-screw-neck-total-recovery-vial-preassembl.html
Trypsine	Sigma Aldrich	; Numéro de catalogue : T6567	Utilisé pour la digestion tryptique