Génération d’organoïdes alvéolaires A549/MRC-5 intégrés en collagène 3D à l’aide d’un bioréacteur mécanique à étirement cellulaire

Résumé

Ce protocole décrit la génération d’organoïdes à partir de cellules épithéliales alvéolaires A549 et de fibroblastes pulmonaires MRC-5 sur un échafaudage hydrogel à matrice extracellulaire, suivie de l’intégration dans des gels de collagène 3D et d’une exposition à une contrainte mécanique à l’aide d’un bioréacteur d’étirement cellulaire pour étudier la mécanobiologie alvéolaire.

Résumé

Bien que la dynamique respiratoire et la contrainte mécanique jouent un rôle crucial en biologie alvéolaire, leurs contributions à la pathogenèse des maladies respiratoires sont souvent négligées. Pour combler cette lacune, nous avons développé un modèle organoïde dans lequel des organoïdes épithéliaux alvéolaires sont soumis à une contrainte mécanique contrôlée à l’aide d’un bioréacteur à étirement cellulaire. Cette plateforme reproduit l’organisation spatiale et la complexité multicellulaire du tissu alvéolaire et permet d’étudier comment la communication cellulaire et la mécanotransduction influencent la structure et la fonction tissulaire en santé et en maladie. Dans ce protocole, nous décrivons des méthodes pour générer et cultiver des organoïdes épithéliaux-fibroblastiques en utilisant des lignées cellulaires épithéliales alvéolaires A549 et MRC-5 de fibroblastes pulmonaires dans un hydrogel extracellulaire à matrice membranaire basale. Les organoïdes sont ensuite isolés non enzymatiquement et intégrés dans des gels de collagène 3D sur des plaques spécialisées dans le bioréacteur. Nous décrivons les procédures pour appliquer une contrainte équibiaxiale afin d’imiter les schémas respiratoires pathologiques observés dans les exacerbations respiratoires. Enfin, nous présentons un flux de travail standard de caractérisation, incluant l’immunocoloration pour les marqueurs spécifiques aux cellules et les immunoessais pour profiler la libération des médiateurs immunitaires. Ensemble, ces analyses soutiennent l’évaluation de la structure et de la fonction organoïdes. Ce protocole offre une plateforme conviviale, reproductible et adaptable pour étudier la biologie alvéolaire sous contrainte mécanique, avec des paramètres facilement modifiables pour atteindre des objectifs expérimentaux variés et faire progresser la recherche sur les mécanismes des maladies pulmonaires.

Introduction

Les alvéoles sont les sacs terminaux du système respiratoire et servent de principal site d’échange gazeux. Ils sont principalement composés de cellules épithéliales alvéolaires de type I et II, responsables de l’échange gazeux, des fonctions immunitaires et du maintien de l’intégrité structurelle, ainsi que de fibroblastes à l’intérieur des parois, qui maintiennent l’homéostasie de la matrice^{extracellulaire 1}. Ces cellules résidentes et d’autres sont continuellement exposées à des contraintes cycliques d’étirement et de cisaillement pendant la^{respiration 2}. Ces indices mécaniques sont transduits en signaux biochimiques qui influencent la structure cellulaire, la différenciation et la communication³.

Une tension mécanique pathologique est observée dans les maladies pulmonaires telles que la maladie pulmonaire obstructive chronique (MPOC). La MPOC est une affection progressive caractérisée par la destruction parenchymateuse, une inflammation chronique et un rétrécissement des petites voies^{respiratoires 4}. Dans cette maladie, la destruction des parois alvéolaires, la perte d’élastine, le remodelage de la matrice extracellulaire (ECM) entraînant la fibrose et l’inflammation chronique altèrent collectivement la capacité du poumon à supporter des dommages^{structurels 5,6}. Cela entraîne une déformation alvéolaire hétérogène et anormale lors de la respiration, qui s’aggrave^{lors des poussées 7,8}.

Bien que plusieurs approches in vitro aient été utilisées pour étudier la biologie alvéolaire, chacune présente des limites notables. Les systèmes de co-culture 2D facilitent l’étude des interactions cellule-cellule mais ne capturent pas l’architecture tissulaire ni la dynamique de la matrice extracellulaire, réduisant ainsi leur pertinence physiologique. Les cultures 3D statiques préservent mieux l’organisation structurelle et les interactions matricielles, mais elles n’intègrent pas les indices mécaniques dynamiques présents in vivo. Les plateformes microfluidiques et organes sur puce peuvent imiter l’écoulement des fluides et la contrainte mécanique, offrant une grande fidélité physiologique, mais elles sont souvent techniquement complexes, à faible débit et coûteuses⁹. En revanche, le modèle organoïde 3D à contraintes mécaniques présenté ici combine complexité structurelle, hétérogénéité cellulaire et stimulation mécanique contrôlée, un aspect souvent négligé dans les modèles existants, au sein d’une plateforme reproductible et évolutive offrant un équilibre entre pertinence physiologique et accessibilité^{expérimentale 10,11}.

Pour comprendre les mécanismes complexes qui contribuent à des maladies telles que la MPOC et découvrir des cibles thérapeutiques, des modèles de maladies ont été mis en place. Malgré son importance, la déformation mécanique est souvent négligée dans les modèles alvéolaires in vitro utilisés pour étudier les mécanismes et la pathogenèse des maladies pulmonaires telles que la BPCO. Pour combler cette lacune, nous présentons une méthode de culture des organoïdes épithéliaux alvéolaires fibroblastiques dans une matrice de socle, de leur extraction et de leur intégration dans des gels de collagène 3D, d’application d’une contrainte mécanique cyclique à l’aide d’un bioréacteur à étirement cellulaire, et d’évaluation des principaux résultats structurels et fonctionnels. Ces modèles organoïdes mécaniques 3D capturent mieux les interactions cellulaires et le microenvironnement de la niche alvéolaire humaine, permettant l’étude de la diaphonie épithéliale-mésenchymatose¹².

Le bioréacteur applique une déformation équibiaxiale avec des paramètres configurables, permettant jusqu’à 30 % d’élongation et des fréquences allant jusqu’à 5 Hz pour modéliser à la fois les conditions physiologiques et pathologiques. Dans cette étude, nous avons généré des modèles organoïdes intégrés dans des hydrogels de collagène-I soumis à une contrainte de 18 % à 0,4 Hz pendant 24 heures pour simuler la respiration pathologique. Nous avons mis en place un flux de travail standardisé de caractérisation incluant l’immunocoloration pour les marqueurs spécifiques aux cellules et des immunotests pour quantifier la libération des médiateurs immunitaires après une déformation mécanique. L’objectif de cette étude est de fournir une plateforme physiologiquement pertinente, conviviale et adaptable pour étudier la biologie alvéolaire sous contrainte mécanique.

Protocole

Toutes les étapes nécessitent une technique aseptique, des matériaux stériles et des réactifs, et sont réalisées dans un cabinet de biosécurité afin de réduire l’exposition du personnel à des matériaux bio-dangereux et la contamination des cultures. Les réactifs et l’équipement utilisés sont listés dans le tableau des matériaux.

1. Culture cellulaire et établissement de stocks cellulaires

1. Avant la formation des organoïdes, cultivez les cellules A549 et MRC-5 sur des fioles plastiques traitées en culture tissulaire standard (T75 cm²) jusqu’à une confluence d’environ 70 % à 80 % en utilisant le Modified Eagle Medium (DMEM) de Dulbecco, complété avec 10 % de sérum fœtal bovin (FBS) et 1 % de pénicilline-streptomycine, désigné par le nom de « DMEM complet ».
2. Pour A549 et MRC-5, semez à 2 x 10⁴ cellules/cm², sur un volume total de DMEM complet de 10 mL. Cultivez les cellules à 37 °C avec 5 % de_CO2 dans un environnement humidifié jusqu’à atteindre environ 70 % à 80 % de confluence.
3. Remplacez le milieu de culture toutes les 48 heures pour garantir des conditions de croissance optimales.
4. Sous-culture en aspirant tous les milieux de la fiole une fois que 70 % à 80 % de confluent, en lavant une fois avec une solution saline tiède tamponnée au phosphate (PBS), puis en ajoutant 4 mL de trypsine-EDTA.
5. Incubez à 37 °C pendant 5 minutes et visualisez les flasques au microscope en champ clair pour assurer un décollement complet. Neutralisez en ajoutant 4 mL de DMEM complet.
6. Comptez les cellules en utilisant la technique de votre choix, comme le comptage d’exclusion bleu de trypan.
7. Centrifugez la suspension à cellules à 200 x g pendant 5 minutes.
8. Aspirez le surnageant pour laisser une pastille cellulaire au fond du tube conique. Resuspendez la granule cellulaire dans un volume approprié de DMEM complet en triturant doucement.
9. Pour la congélation, resuspendez dans un milieu complet contenant 10 % de DMSO pour obtenir un 1 x 10⁶ cellules/mL. Pour la formation des organoïdes, resuspendez pour obtenir 1 x 10⁶ cellules/mL.

2. Établissement et caractérisation de la maturation d’un modèle organoïde d’organoïdes épithéliaux alvéolaires 3D

REMARQUE : La matrice du sous-sol doit être décongelée sur la glace toute la nuit et conservée sur glace pendant ces étapes. Des températures plus élevées peuvent provoquer la solidification de la matrice.

1. Préparez un mélange 2:3 de matrice de sous-sol et de DMEM avancé. Ajoutez 300 μL de cette solution à chaque puits d’une plaque à 24 puits, afin de garantir que le fond de chaque puits soit uniformément recouvert. Incubez la plaque à 37 °C dans un incubateur humidifié pendant 1 h pour permettre à la matrice de se solidifier.
2. Préparez une solution matricielle de socle à 5 % dans un DMEM complet, qui servira de milieu de culture pour les organoïdes. Pour chaque puits, obtenir 1,2 mL de cette solution en diluant 60 μL de matrice de socle dans 1 140 μL de DMEM complet.
3. Pendant la solidification du mélange de la matrice basale, mélangez 300 000 cellules A549 avec 30 000 cellules MRC-5 dans 200 μL de la solution à 5 % de la matrice basale produite en DMEM complet décrite à l’étape 2.2.
4. Une fois le mélange basal 2:3 solidifié, pipettez 200 μL du mélange A549/MRC-5 sur la matrice gelée, puis remettez la plaque à 24 puits pour incuber à 37 °C, 5 % de CO₂ pendant 21 jours afin de permettre la croissance et la différenciation des organoïdes alvéolaires.
5. Visualisez les cultures au microscope optique pendant les 48 heures suivantes. Les cellules devraient s’agréger dans cette période.
6. Remplacez la matrice de base/solution DMEM à 5 % toutes les 48 heures par 200 μL de milieu frais à 5 %. Pour éviter de déranger les organoïdes incrustés dans l’hydrogel, inclinez doucement la plaque afin que l’ancienne solution s’accumule le long de la paroi du puits avant l’aspiration.
7. Aux jours 3, 9 et 21 de maturation, imagez les organoïdes à un grossissement objectif de 10x et prenez quatre images ou champs de vision représentatifs de chaque puits. Des images représentatives de la morphologie organoïde précoce aux jours 3, 9 et 21 sont présentées à la Figure 1.
8. Pour chaque champ de vision, comptez tous les organoïdes de plus de 50 μm de diamètre. En utilisant la surface connue du champ de vision, extrapolez le nombre total moyen d’organoïdes par puits à partir du nombre moyen par champ, en supposant une surface de plaque de 24 puits de 1,9 cm².
   REMARQUE : Ces analyses peuvent être réalisées à l’aide de logiciels d’analyse d’images tels que Fiji¹³.
9. Le diamètre moyen et la surface des organoïdes peuvent également être mesurés afin d’obtenir des informations quantitatives sur les caractéristiques de croissance des organoïdes en culture.

3. Prélèvement d’organoïdes alvéolaires 3D de fibroblastes épithéliaux

REMARQUE : Toutes les étapes pour prélever les organoïdes doivent être effectuées sur glace.

1. Après 21 jours de maturation, aspirez le surnageant et lavez doucement avec environ 1 à 2 mL de PBS glacé.
2. Ajoutez 1 à 2 mL de solution froide d’organoïdes et incubez la plaque à 2-8 °C pendant 30 à 90 minutes avec un secouage modéré.
   REMARQUE : Arrêtez l’incubation lorsque les organoïdes sont vus flotter au fond du puits.
3. Surveillez la dissociation à l’aide de la microscopie à champ clair. La dissociation est considérée comme complète une fois que la matrice du socle au fond du puits n’est plus visible et que les organoïdes sont en suspension. Un grattoir cellulaire peut être utilisé pour déloger doucement l’hydrogel de la matrice organoïde-socle afin d’accélérer le processus.
4. Regroupez le contenu de tous les puits dans un tube conique de 50 mL sur glace.
5. Centrifugez à 500 × g pendant 5 minutes à 2-8 °C. Aspirez le surnageant, lavez la pellete organoïde avec 1 à 2 mL de PBS glacé, puis centrifugez à nouveau pour obtenir une pellete. Aspirez le PBS.

4. Établissement des organoïdes alvéolars-fibroblastes incorporés dans le collagène 3D et de l’application des souches mécaniques

REMARQUE : Utilisez des plaques de culture en mousse circulaires avec des ancrages en mousse compatibles avec un bioréacteur à étirement cellulaire. La plaque de culture utilisée dans ce protocole a une surface de croissance de ~6,6^cm2.

1. Préparez une solution fonctionnelle de 2 mg/mL de gel de collagène I. La solution doit contenir 1× PBS, 11,4 mM de NaOH et 2 mg/mL de collagène I, le volume final étant ajusté à l’aide d’eau stérile. Préparez 2 mL de cette solution de collagène I par puits de la plaque circulaire en mousse à 6 puits.
2. Ajoutez 1 mL de solution de collagène I à 2 mg/mL aux ancrages en mousse à la périphérie de la plaque, assurant ainsi une saturation complète.
   REMARQUE : Les ancrages en mousse doivent être soigneusement saturés de solution de collagène I pour garantir une bonne adhérence. Une saturation incomplète peut entraîner le décollement du gel de collagène lors de l’application de la déformation mécanique, entraînant une déformation effective réduite par rapport à la cible visée.
3. Résuspendez le pellet organoïde dans 6 mL de 2 mg/mL de collagène de queue de rat et pipettez 1 mL de la suspension au centre d’une plaque circulaire en mousse à 6 puits, afin de s’assurer que le mélange de collagène infusé aux organoïdes se mélange avec le collagène initial sans organoïdes ajouté aux ancrages en mousse circulaires.
   REMARQUE : Évitez de générer des bulles lors de l’ajout de la suspension organoïde dans chaque puits.
4. Polymérisez le collagène-I pendant 1 h en laissant les plaques dans un incubateur (37 °C, 5 % CO_2). Après polymérisation, le gel doit paraître trouble.
5. Ajoutez 2 mL de DMEM complet par-dessus des organoïdes A549/MRC5 enrichis en collagène 3D et remettez la plaque dans l’incubateur pendant 24 heures.
6. Remplacez le milieu de culture par du DMEM + 1 % de FBS et incubez toute la nuit avant l’exposition à la souche mécanique.

5. Installation du bioréacteur d’étirement cellulaire et exposition à la contrainte mécanique

1. Insérez des stations de chargement dans chaque puits de la plaque de base. Celles-ci contiennent six poteaux de chargement de 25 mm de diamètre, qui permettent à la membrane flexible des plaques de train tissulaire de se déformer autour d’eux et d’exposer la culture 3D à une déformation équibiaxiale.
2. Appliquez une fine couche de graisse siliconée sur le dessus des poteaux de chargement.
3. Placez des joints rouges au fond de chaque plaque à 6 puits.
4. Insérez les plaques préparées dans la plaque de base au-dessus des poteaux de chargement.
5. Déplacez cet appareil dans un incubateur humidifié à 37 °C contenant 5 % de_CO2 et connectez les raccords à déconnexion rapide à la plaque de base. Répétez les étapes 5.1 à 5.6, mais en omettant les connexions pour créer un contrôle non forcé.
   REMARQUE : En option, on peut appliquer un bouchon d’étanchéité à tube, qui empêche l’application de pression sous vide au fond d’un seul puits BioFlex, permettant ainsi la génération d’une culture de contrôle non déformée sur la même plaque.
6. Couvrez avec une feuille de Plexiglas et ajoutez ~5 à 10 lbs de poids pour assurer une étanchéité hermétique.
7. Allumez le compresseur d’air et ouvrez la vanne d’évacuation du compresseur d’air.
8. Allumez la pompe à dépression et ouvrez la vanne du réservoir de pression reliée à l’évacuation du réservoir à vide. Assurez-vous que la pression sous vide soit d’environ 90 kPa.
9. Ouvrez la vanne d’entrée du compresseur d’air situé près du contrôleur du bioréacteur. Ajustez la pression pour qu’elle ne dépasse pas 15 PSI au niveau du conduit de ventilation.
10. Lance le logiciel embarqué et configure les paramètres de déformation mécanique cycliques souhaités. Pour cette étude, un schéma d’amplitude de déformation de 18 % à 0,4 Hz pendant 24 heures a été utilisé. Pour configurer cela, créez un nouveau régime, fixez l’allongement minimum à 0 %, l’allongement maximal à 18 %, puis lancez le protocole.
11. Observez la plaque et la membrane pour vous assurer que le mouvement est visible tout au long de la séance de déformation. La membrane doit se déformer autour des poteaux de chargement.
12. Vérifiez périodiquement le siphon à eau pour l’humidité, et observez l’écran de l’ordinateur pour connaître la durée de fonctionnement, l’avancement et la morphologie appropriée du schéma de déformation.
13. Déconnectez l’ensemble de la plaque de base à l’issue du schéma de souche, puis renvoyez les cultures soutirées à l’incubation pendant 24 heures avant les analyses de caractérisation en aval.
14. Éteignez et démontez le système dans l’ordre inverse du démarrage : fermez ou coupez la vanne d’entrée du compresseur d’air, puis la vanne du réservoir de pression, la pompe à vide, la vanne de sortie du compresseur d’air, et enfin le compresseur d’air, dans cet ordre.
15. Prélever le surnageant après 24 heures d’incubation suite à une exposition à une souche mécanique. Conservez à -80 °C jusqu’à utilisation.

6. Caractérisation morphologique des organoïdes via l’immunofluorescence

1. Lavez le modèle organoïde-collagène trois fois avec du PBS en ajoutant doucement 1 mL de PBS, en incubant pendant 5 minutes à température ambiante.
2. Aspirez soigneusement le PBS et répétez le processus de lavage un total de trois fois.
3. Fixez le modèle en incubant 2 mL de paraformoldéhyde à 4 % pendant 1 heure à 4 °C.
4. Lavez les modèles trois fois avec du PBS comme décrit ci-dessus.
5. Utilisez un scalpel pour découper délicatement les ancrages circulaires en mousse dans les puits flexibles avec le gel de collagène attaché, puis placez-les dans une boîte de Petri.
6. Perméabiliser les organoïdes en les incubant avec 2 mL de Triton X-100 à 0,1 % dans PBS pendant 5 minutes à température ambiante.
7. Lavez les modèles trois fois avec PBS.
8. Bloquez la liaison non spécifique en incubant les modèles avec 3 mL d’albumine sérique bovine (BSA) à 5 % dans du PBS pendant 1 h à température ambiante. Retirez la solution de blocage et passez à l’étape suivante.
9. Incuber les modèles toute la nuit à 4 °C avec un cocktail colorant contenant l’anti-zonula occludens-1 (ZO-1) conjugué avec Alexa Fluor 594 à 1:100 de dilution, de la phalloïdine conjuguée avec Alexa Fluor 488 à 1:1000 de dilution pour l’évaluation de la F-actine, et la coloration nucléaire, DAPI à 1:4000 de dilution. Le diluant est de 1 mL de 1 % de BSA dans PBS. Scotchez les bords de la plaque avant l’incubation à 4 °C.
10. Aspirez la solution de cocktail colorant le lendemain et lavez les modèles trois fois avec du PBS.
11. Imagez à l’aide d’un microscope confocal et prenez des piles Z à 5 μm de tranches d’organoïdes représentatifs à un gros objectif de 40x.
12. Analysez l’intensité de fluorescence à l’aide d’un logiciel d’analyse d’images Fiji. Normaliser l’intensité moyenne de fluorescence avec la surface de l’organoïde afin d’assurer une comparaison précise entre différentes conditions environnementales.

7. Caractérisation fonctionnelle des organoïdes par ELISA et test de cytotoxicité lactate déshydrogénase (LDH)

1. Dégelez les surnadants sur la glace et évaluez la sécrétion d’interleukine-6 (IL-6) et d’interleukine-8 (IL-8) à l’aide de kits ELISA disponibles dans le commerce selon le protocole du fabricant.
2. Évaluer la libération de LDH, un marqueur de cytotoxicité, à l’aide d’un test d’absorption de LDH disponible dans le commerce.
3. Générez une courbe standard en utilisant la protéine LDH recombinante à des concentrations de demi-log de 0,5 μg à 0,5 ng. Interpolez les concentrations de LDH de chaque échantillon à l’aide de la courbe standard.

8. Optionnel : Isolement des échantillons pour des analyses d’ARN ou de protéines

1. Au lieu d’ajouter 4 % de paraformoldéhyde pour la coloration par immunofluorescence, ajoutez un tampon RLT préparé contenant du β-mercaptoéthanol à 10 μL pour 1 mL de RLT.
2. Utilisez 300 μL par modèle et pipettez de haut en bas pour détacher et lyser complètement les cellules.
3. Transférez le lysat dans un tube de microcentrifuge sans RNase et placez les tubes sur de la glace sèche pour les congeler rapidement. Transférer à -80 °C pour un stockage à long terme.
   REMARQUE : Sinon, on peut utiliser le tampon RIPA pour l’extraction des protéines en préparant : 50 mM de Tris-HCl, pH 7,4-7,5 ; 150 mM NaCl ; 1 % NP-40 ou Triton X-100 ; 0,5 % de désoxycholate de sodium ; 0,1 % de SDS dans l’eau déionisée. Un tampon RIPA préfabriqué est également disponible dans le commerce.
4. Ajoutez 200 μL par modèle, faites caillouter sur la glace pendant 5 minutes, puis récupérez le lysat.
5. Centrifugez à 15 000 x g pendant 10 minutes à 4 °C pour accumuler les débris cellulaires et transférez à -80 °C pour un stockage à long terme.

Résultats

Des organoïdes alvéolaires fibroblastiques épithéliaux dérivés de lignées cellulaires ont été établis et cultivés pendant plus de 21 jours. Des changements morphologiques ont été observés tout au long de cette période, avec des évaluations du nombre, de la surface et du diamètre organoïdes aux jours 3, 9 et 21 pour surveiller la croissance et le développement. Le nombre moyen d’organoïdes par puits a diminué significativement aux jours 9 et 21 par rapport au jour 3 (...

Discussion

Les organoïdes alvéolaires épithéliaux fibroblastiques en trois dimensions (3D) représentent une plateforme hautement pertinente sur le plan physiologique pour modéliser la structure et la fonction pulmonaires sous contrainte mécanique. Contrairement aux systèmes de co-culture 2D ou même 3D, les organoïdes préservent des caractéristiques critiques du microenvironnement pulmonaire in vivo, notamment l’organisation spatiale, la diaphonie épithéliale-mésenchymatose et les interacti...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Tube microcentrifuge de 1,5 mL	Eppendorf	0030 125.215
Tube conique de 15 mL	Fisher Scientific	14-959-53A
16 % de paraformaldéhyde	Thermo Fisher Scientific	28908
2-mercaptoéthanol	Millipore Sigma	M3148
Tube conique de 50 mL	Fisher Scientific	14-432-22
Plaque circulaire en mousse Tissue Train à 6 puits (membrane flexible)	Flexcell International	TTCF-5001
Cellules A549	Collection de culture de type américain (ATCC)	CCL-171
Compresseur d’air	Outils pneumatiques de Californie	10020DSPCAD
Albumine sérique bovine	Millipore Sigma	A9418
Buffer RLT	Qiagen	79216
Incubateur CO2	PHCBI	MCO-170AICUVL-PA
Solution de prélèvement d’organoïdes Cultrex	Bio-Techne	3700-100-01
Kit de test de cytotoxicité CyQUANT LDH	Thermo Fisher Scientific	C20300
DAPI (4&prime ;,6-diamidino-2-phénylindole)	Thermo Fisher Scientific	D1306
Diméthylsulfoxyde	Sigma Aldrich	D2650-100ML
Dulbecco » s modifié Eagle' Medium s (DMEM)	Thermo Fisher Scientific	11965092
Microscope à noyau EVOS XL	Thermo Fisher Scientific	AMEX1200
Sérum fœtal bovin (FBS)	Thermo Fisher Scientific	A5209501
Logiciels d’analyse d’image fidjiennes	Instituts nationaux de la santé
Système de tension et de tissu Flexcell FX-6000 (comprend un contrôleur de tension Flexlink FX-6000, un réservoir de pression, une plaque de base, une fenêtre en acrylique, des stations de chargement cylindriques de 25 mm de diamètre, un siphon à eau, le logiciel FlexSoft FX-6000 V1.0, et divers tubes)	Flexcell International	FX6000T
Interleukin-6 Duoset Humé ELISA	Bio-Techne	DY206
Interleukine-8 Duoset Humé ELISA	Bio-Techne	DY208
Microscope confocal Leica DMi8	Leica Microsystems	11889122
Matrice membranaire de socle Matrigel	Corning	356237
Cellules MRC-5	ATCC	CCL-185
Parafilm	Millipore Sigma	P7793
Pénicilline/streptomycine (Pen/Streptocococcique)	Thermo Fisher Scientific	15140122
Sondes de marquage phaloïdines, Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	A12379
Solution physiologique tamponnée au phosphate (PBS)	Thermo Fisher Scientific	14190-144
Collagène queue de rat I	Sigma-Aldrich	C3867
Protéine lactate déshydrogénase humaine recombinante (active)	Abcam	Ab93699
Tampon de lyse RIPA	Thermo Fisher Scientific	89901
Tubes microfuge sans RNase	Thermo Fisher Scientific	AM12400
Flasque de culture T75 cm2 flasque de culture	Greiner	658175
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100-5ML
Anticorps monoclonal ZO-1 (ZO1-1A12), Alexa Fluor 594	Thermo Fisher Scientific	339194