In-vitro Reconstitution de l’ubiquitination bactérienne et élimination médiatisée par VCP/p97

Résumé

Ce protocole décrit une méthode pour ubiquitiner Streptococcus pneumoniae en utilisant un lysat cellulaire de mammifère ou un complexe enzymatique d’ubiquitine pur, suivie d’un traitement avec un complexe protéique VCP/p97-UFD1-NPLOC4 purifié afin d’évaluer son activité bactériolytique, permettant l’étude des effecteurs immunitaires dépendants de l’ubiquitine.

Résumé

L’ubiquitination est une modification post-traductionnelle polyvalente qui joue un rôle crucial dans l’immunité cytosolique. Lors de l’invasion des cellules hôtes, les bactéries pathogènes sont initialement enfermées dans un endosome, dont elles se libèrent et s’échappent dans le cytosol pour éviter la dégradation lysosomal. Une fois dans le cytosol, les bactéries sont rapidement marquées par des chaînes d’ubiquitine par les ligases E3 de l’hôte, marquant leur élimination via de multiples voies effectrices, y compris l’autophagie et le protéasome. Pour délimiter la contribution des voies individuelles à l’élimination bactérienne, la reconstitution in vitro propose une approche contrôlée et sans ambiguïté. Ici, en utilisant Streptococcus pneumoniae (SPN) comme pathogène bactérien modèle, nous présentons un protocole détaillé pour son ubiquitination en utilisant des lysats cellulaires de mammifères ou un complexe enzymatique d’ubiquitine pur, suivi d’un traitement avec le complexe VCP/p97-UFD1-NPLOC4 purifié afin d’évaluer son activité bactériolytique indépendamment des autres facteurs cellulaires. Dans l’ensemble, cette procédure a le potentiel d’éclairer la fonction des ligases et effecteurs ubiquitine liés à l’immunité dans un contexte sans cellule, où la dissection de ces mécanismes peut être difficile dans des cellules intactes.

Introduction

L’ubiquitine (Ub) est une petite protéine de 8,6 kDa qui modifie les substrats cibles en s’attachant covalemment à ceux-ci à sa glycine C-terminale, créant une liaison isopeptidique avec le groupe ε-amino des résidus de lysine dans un processus appelé^{ubiquitination 1}. Ce phénomène est régi par une série d’étapes orchestrées impliquant une enzyme activant l’ubiquitine E1, une enzyme conjuguant l’ubiquitine E2, et une ligase ubiquitine^{E3 1,2,3}. Ub peut être attaché sous forme de monomère ou de chaînes de différentes longueurs via ses sept résidus de lysine (linéaire/M1, K6, K11, K27, K29, K33, K48 et K63^). Ces chaînes Ub uniques agissent comme marqueurs moléculaires pour diverses fonctions cellulaires, telles que la dégradation protéosomale, le trafic cellulaire, la réparation de l’ADN et l’autophagie^{sélective 3}.

Bien que le rôle canonique de l’ubiquitination soit depuis longtemps associé au maintien de l’homéostasie cellulaire, comme la dégradation des protéines mal repliées via des protéasomes ou la direction de charges spécifiques vers une autophagie^{sélective 5,6}, il est désormais évident que l’ubiquitine agit également comme un mécanisme de détection crucial du système immunitaire cytosolique contre les infections bactériennes. Les bactéries intracellulaires infiltrent fréquemment les cellules hôtes pour éviter d’être détectées par la réponse immunitaire extracellulaire et se reproduisent dans un environnement protégé ^7,8. De nombreux agents pathogènes utilisent des systèmes sécrétoires et des toxines pour endommager irrémédiablement les vacuoles qui les transportent, permettant ainsi de s’échapper dans le cytosol pour obtenir des nutriments ^9,10. Une fois dans le cytosol, ces bactéries sont décorées de chaînes polyubiquitine par des ligases spécifiques E3, agissant comme une « étiquette de mort » moléculaire, qui les dirige vers une élimination sélective. Par exemple, la ligase E3 SMURF1 engage Mycobacterium tuberculosis en initiant une polyubiquitination liée à K48 directement à sa surface, ce qui conduit à sa dégradation via le protéasome¹¹. La parkine s’accumule dans les vacuoles contenant des bactéries et forme les chaînes d’ubiquitine liées à^{K63 12}, tandis que ARIH1 et LRSAM1 modifient les surfaces des bactéries avec respectivement des chaînes K48 et K6, inhibant ainsi la croissance^{bactérienne 13,14}. Bien que la majorité des ligases E3 ciblent principalement les substrats protéiques de l’hôte, certaines ligases présentent une spécificité notable pour les composants microbiens. RNF213 identifie et ubiquitine les lipopolysaccharides (LPS) trouvés sur Salmonella enterica serovar Typhimurium¹⁵, et le complexe^{SCF FBXO2} reconnaît les glycanes bactériens présents dans le Streptococcus du groupe A comme substrat pour l’ubiquitination¹⁶, facilitant la xénophagie. Le complexe^{SCF FBXW7}, quant à lui, reconnaît les motifs degron dans les protéines de surface de Streptococcus pneumoniae (SPN). Celles-ci incluent β-galactosidase A (BgaA) et la protéine de surface pneumococcique A (PspA), qui, après marquage avec des chaînes polyubiquitines liées à K48, confirmées par un anticorps spécifique Bin lié à K48, attirent vraisemblablement le système protéosomal, permettant une élimination bactérienne^{efficace 17}.

Bien que le processus de marquage de ces envahisseurs cytosoliques avec l’ubiquitine soit bien compris, le mécanisme ultérieur par lequel le système protéosomal élimine de telles entités microbiennes majeures reste douteux. Des recherches récentes ont révélé que l’ATPase AAA+ de l’hôte, VCP/p97 (protéine contenant la valosine), joue un rôle crucial dans ce processus. En collaboration avec des cofacteurs comme UFD1 et NPLOC4, le VCP peut identifier les bactéries marquées de polyubiquitine et extraire physiquement les protéines ubiquitinées de la membrane bactérienne, les rompant ainsi et facilitant leur élimination du milieu cytosolique sans dépendre de la machinerie^{protéosomale 18}.

Le cytosol de l’hôte contient un réseau complexe de voies immunitaires qui fonctionnent en parallèle et de manière infaillible pour garantir l’élimination des agents pathogènes. Cette redondance est cruciale pour une défense solide, mais elle complique les efforts pour identifier et examiner le rôle des facteurs immunitaires^{individuels 19}. À cet égard, les systèmes de reconstitution in vitro offrent une plateforme utile pour analyser des voies spécifiques dans des conditions contrôlées. Ici, nous introduisons un système sans cellules qui récapitule le processus d’ubiquitination et de perte de viabilité du SPN en utilisant des lysats cellulaires de mammifères ou des enzymes E1-E2-E3-Ub ainsi que des complexes effecteurs de l’hôte purifiés. Dans ce protocole en deux étapes, nous facilitons d’abord la conjugaison des chaînes de polyubiquitine sur les bactéries, suivies d’une évaluation de leur élimination par VCP/p97 en association avec UFD1 et NPLOC4. En reconstituant cette voie in vitro, nous contournons les complexités cellulaires et étudions spécifiquement la capacité du VCP à neutraliser le pathogène. Cette configuration précise permet une exploration détaillée de la reconnaissance du substrat, de la spécificité des chaînes, du mode d’action de l’effecteur et des composants essentiels nécessaires pour initier une réponse efficace.

Protocole

1. Préparation de la culture cellulaire et du lysat

1. Décongelez les cellules A549 et cultivez-les dans un flacon de T25 à l’aide d’un DMEM complet avec un sérum bovin fœtal à 10 % (FBS). Incubez à 37 °C dans un environnement humidifié avec 5 % de CO₂. Faites passer les cellules par trois passages pour maintenance, puis transférez 2 × 10⁶ cellules dans une fiole T75. Poursuivez la culture jusqu’à ce que la densité cellulaire atteigne 8-10 × 10⁶ cellules.
2. Gratter les cellules de la fiole T75 à 4 °C à l’aide d’un tampon de réaction contenant 200 mM de HEPES, 100 mM de_{MgCl 2}, 1 M de KCl et 5 % de glycérol à pH 7,4. Centrifugez les cellules raclées à 120 × g pendant 10 minutes pour les pelleter, puis resuspendez-les dans le tampon de réaction pour obtenir un volume final d’environ 0,6 mL dans un tube centrifugeuse de 1,5 mL.
   REMARQUE : L’ensemble de l’échantillon doit être traité dans de la glace.
3. Sonicez la suspension cellulaire à l’aide d’une sonde étroite (extrémité de diamètre, 2 mm) à une amplitude de 40 μm avec 2 s d’impulsions marche/arrêt pendant 2 à 2,5 minutes, en maintenant le mélange sur la glace. Centrifugez les échantillons soniés à 21 000 × g pendant 45 minutes, collectez le surnageant résultant, puis ajoutez 2 à 3 fois un cocktail d’inhibiteurs de protéase 50x.
   REMARQUE : Soit utiliser le lysat immédiatement pour la réaction d’ubiquitination le même jour, soit le congeler instantanément avec de l’azote liquide et le stocker à -80 °C ; Cependant, assurez-vous de l’utiliser dans les 3 jours maximum pour une ubiquitination efficace. Une concentration de lysat allant de 2 à 4 mg/mL convient à l’ubiquitination.

2. Culture bactérienne

1. Faites pousser la bactérie Streptococcus pneumoniae (SPN) souche R6 (Sérotype II) pendant la nuit à 37 °C avec 5 % de CO₂ dans un milieu THY composé de poudre de bouillon Todd Hewitt (3,7 g/100 mL) et d’extrait de levure (1,5 g/100 mL).
   REMARQUE : Évitez d’inoculer les bactéries si le milieu est devenu brun foncé. Streptococcus pneumoniae est classé comme agent pathogène de niveau de biosécurité 2 (BSL-2) ; prendre des précautions et suivre les protocoles de confinement BSL-2 appropriés, y compris l’utilisation d’une armoire de biosécurité certifiée.
2. Le lendemain, inoculez à partir de la culture nocturne dans un milieu THY frais (1:10) à 37 °C avec 5 % de_CO2 et faites croître le SPN jusqu’à ce que la densité optique à 600 nm (OD_{600 nm}) atteigne 0,4. Préparez un stock de glycérol de SPN (900 μL de culture SPN et 600 μL de glycérol (50 %) et conservez-le à -80 °C.
3. Le jour de l’expérience d’ubiquitination, décongelez un nouveau stock de SPN à -80 °C et inculez-le complètement dans un milieu THY de 5 mL et laissez-le croître jusqu’à atteindre_{0,4 à 600 nm} .
   REMARQUE : La culture bactérienne a été élevée à un OD_{de 600 nm} de 0,4, ce qui correspond à environ 10⁸ cellules SPN par mL. Cette corrélation a été établie en énumérant les unités formant des colonies (UFC), déterminées par dilution sériale de la culture dans 1x PBS pour diminuer la concentration bactérienne des cellules afin d’obtenir des colonies dénombrables, et par le spotting sur les plaques d’agar BHI, un milieu plus enrichi que le THY.

3. Essai d’ubiquitination in vitro à partir de lysat de mammifère

1. Prenez environ^{10 cellules SPN} 7 et lavez soigneusement au moins trois fois avec le tampon de réaction (200 mM HEPES, 100 mM MgCl₂, 1 M KCl et 5 % de glycérol à pH 7,4) en resuspendant les bactéries dans le tampon suivant, puis centrifugation à 21 000 × g pendant 5 minutes, puis en les granulant par centrifugation à 21 000 × g pendant 5 minutes à température ambiante.
2. Resuspendez la pellete SPN avec un lysat cellulaire de mammifère A549 ainsi qu’une ubiquitine purifiée (350 μM) et 1 mM d’ATP, puis incubez pendant 1 à 2 heures à 27 °C.
   REMARQUE : Évitez de congeler et de décongeler le lysat cellulaire des mammifères. Il vaut mieux que le lysat soit préparé le jour même de l’analyse d’ubiquitination.
3. Après l’incubation, lavez les bactéries avec un tampon de réaction contenant 1 M d’urée, suivi de deux lavages avec seulement le tampon de réaction, puis une fixation avec du paraformodéhyde à 1 % (PFA). Après fixation, incubez les cellules avec du PBS contenant de la glycine (1 mg/mL) pendant 15 minutes, suivies de deux lavages de PBS 1x.
   REMARQUE : Un lavage à l’urée de 1 M est utilisé pour perturber légèrement les interactions non covalentes, garantissant que seules les bactéries ubiquitinées par la covalence restent. Ensuite, il est important de bien laver avec un tampon de réaction pour éliminer l’urée résiduelle, car sa présence peut interférer avec le test d’élimination in vitro .
   En contrôle négatif, préparez tout le mélange de réaction et incubez-le avec des bactéries sur glace pour inhiber l’activité enzymatique. Juste après l’incubation, rincez l’échantillon puis fixez-le avec 1 % de PFA pour maintenir l’état de la réaction.

4. Essai d’ubiquitination in vitro à partir du complexe enzymatique E1-E2-E3

1. Préparez d’abord un mélange de réaction composé d’ubiquitine (350 μM), UBE1 (400-800 nM), UbE2C (3-5 μM), Rbx1-Skp1-Cul1-Fbxw7 (500 nM) et 2 mM d’ATP dans un tampon de réaction (200 mM HEPES, 100 mM_MgCl2, 1 M KCl et 5 % de glycérol à pH 7,4), afin d’obtenir un volume total de réaction de 100-150 μL.
   REMARQUE : Conservez toutes les enzymes à -80 °C. Pour éviter de perdre de l’activité lors de multiples cycles de gel-dégel, créez de petites aliquotes et utilisez-en de nouvelles pour chaque réaction d’ubiquitination.
2. Resuspendez les bactéries (10,7 UFC) dans ce mélange réactionnel contenant une enzyme ubiquitine et incubez pendant 2 heures à 27 °C. Ensuite, lavez les bactéries avec un tampon de réaction contenant 1 M urée pendant au moins 3 fois, suivi d’une fixation avec du paraformoldéhyde à 1 % (PFA). Après fixation, incubez les cellules avec du PBS contenant de la glycine (1 mg/mL) pendant 15 minutes, suivies de deux lavages de PBS 1x.
   REMARQUE : En cas de perte cellulaire excessive, on peut réduire le nombre de lavages.

5. Visualisation des bactéries ubiquitinées

1. Après avoir fixé l’échantillon avec un PFA à 1 %, incubez-le dans un comprimé à 3 % de BSA pendant 1 heure à 27 °C, puis effectuez deux lavages avec 1 PBS.
2. Resuspendez les bactéries ubiquitinées à l’aide d’un anticorps primaire à des concentrations supérieures à celles généralement utilisées dans les tests d’immunofluorescence. Utilisez un anticorps spécifique aux bactéries ainsi qu’un anticorps anti-ubiquitine (1:100), dilués dans du PBS contenant 1 % de BSA, pour une coloration à 27 °C pendant 1 heure.
   REMARQUE : Pour une coloration optimale des anticorps, utilisez un tube centrifuge à faible liaison aux protéines pour minimiser la perte d’anticorps ou une concentration d’anticorps plus élevée pour obtenir les meilleurs résultats.
3. Ensuite, lavez les bactéries deux fois avec 1x PBS puis resuspendez-les avec l’anticorps secondaire correspondant conjugué respectivement avec Alexa Fluor 488 et 555, pendant 1 heure à 27 °C.
4. Appliquez environ 10 à 20 μL de l’échantillon bactérien marqué par drop casting et mélangez 5 à 10 μL de substrat de montage avec ou sans DAPI, puis placez un manteau de couverture dessus et utilisez du papier de soie pour absorber l’excès de liquide. Enfin, observez l’échantillon sous un microscope confocal le même jour.

6. Expression et purification des protéines

1. Pour l’expression du VCP/p97 de type sauvage, transformez le plasmide contenant le VCP pET28a en souche BL21-DE3 d’E. coli via un protocole de transformation standard d’E. ^{coli 20}. Des colonies d’incubation se sont formées après la transformation nocturne dans le bouillon Luria (LB) à 37 °C. Le lendemain, inoculez la culture à 1:50 dans un flasque bien aéré contenant du LB et laissez-le croître jusqu’à ce que_{le niveau OD 600 nm} atteigne 0,7-0,8. Ajouter 200 μM d’IPTG à la culture et incuber pendant 5 heures à 37 °C avec secouement à 180 tr/min ; confirmer l’expression protéique à l’aide d’une SDS-PAGE.
   REMARQUE : Pour toute l’étape de croissance et d’expression bactérienne, la kanamycine (50 μg/mL) a été utilisée comme pression de sélection.
2. Pour l’expression de l’UFD1 de type sauvage, transformez le plasmide contenant UFD1 pET41b en souche BL21-Rosetta d’E. coli via le protocole^{de transformation standard 20} d’E. coli. Des colonies d’incubation se sont formées après la transformation nocturne dans le bouillon Luria (LB) à 37 °C. Le lendemain, inoculez la culture à 1:50 dans un flasque bien aéré contenant du LB et laissez-le croître jusqu’à ce que_{le niveau OD 600 nm} atteigne 0,7-0,8. Ajouter 1 mM d’IPTG à la culture et incuber pendant 5 heures à 37 °C avec secouage à 180 tr/min ; confirmer l’expression protéique à l’aide d’une SDS-PAGE.
3. Pour exprimer NPLOC4 de type sauvage, introduire le plasmide contenant NPLOC41b dans la souche E. coli BL21-Rosetta en utilisant la méthode standard de transformation d’E. coli ²⁰. Incubez les colonies issues de la transformation dans le bouillon de Luria (LB) pendant la nuit à 37 °C. Le lendemain, transférez une dilution 1:50 de la culture dans une fiole bien aérée remplie de LB, puis laissez-la croître jusqu’à ce que la densité optique à_{OD 600 nm} atteigne 0,7-0,8. Ensuite, ajoutez 1 mM d’IPTG à la culture et poursuivez l’incubation pendant 16 heures à 18 °C tout en secouant à 180 tr/min ; vérifier l’expression protéique en réalisant une analyse SDS-PAGE.
   REMARQUE : Pour toute l’étape de croissance et d’expression bactérienne réalisée dans la souche E. coli BL21-Rosetta, la kanamycine (50 μg/mL) et le chloramphénicol (20 μg/mL) ont été utilisés comme pression de sélection. Les séquences de pET28a-p97 et pET41b-NPLOC4 sont fournies dans le Fichier Supplémentaire 1.
4. Après l’expression des protéines, centrifugez les cellules bactériennes à 21 000 × g pendant 10 minutes et remettez le pellet dans un tampon de lyse contenant 50 mM de Tris-Cl, 300 mM de NaCl, 5 mM de β-mercaptoéthanol, 1 mM de PMSF, 5 % de glycérol, pH 8.
5. Sonicez les cellules pendant 1 heure à l’aide d’une sonde étroite (diamètre de pointe, 6 mm) à une amplitude de 50 μm, et avec une impulsion de 20 secondes en allum/arrêt à 4 °C. Pelletez les débris avec 15 000 × g pendant 1 h et collectez le surnageant.
   REMARQUE : La sonication totale a été réalisée pendant 1 h (30 min ALLUMÉ et 30 min ARRÊT en impulsions de 20 s), et le processus a été poursuivi jusqu’à ce que la suspension à cellules turbides devienne translucide à transparente. Une centrifugation à grande vitesse est nécessaire pour garantir que les débris cellulaires restent en granule et ne se délogent pas lors du chargement du lysat sur la colonne de purification des protéines.
6. Passer le surnageant à travers un filtre de 0,4 μm et chargez-le sur la colonne remplie de billes Ni-NTA pour la purification d’affinité, pré-équilibré avec un tampon de purification (50 mM Tris-Cl, 300 mM NaCl, 5 mM β-mercaptoéthanol, 5 % de glycérol, pH 8).
7. Rincez la colonne riche en protéines à l’aide d’un tampon de lavage contenant 50 mM de Tris-Cl, 300 mM de NaCl, 5 mM de β-mercaptoéthanol, 5 % de glycérol, pH 8 et 30-60 mM d’imidazole d’environ 400 mL, puis éluez la protéine avec un tampon d’élution comprenant 50 mM de Tris-Cl, 300 mM de NaCl, 5 mM de β-mercaptoéthanol, 5 % de glycérol, pH 8 et 250 mM d’imidazole.
   REMARQUE : La concentration d’imidazole et le volume de lavage peuvent varier selon la protéine spécifique analysée. Pour évaluer la pureté, il faut effectuer une SDS-PAGE. Il est essentiel de bien laver la colonne jusqu’à ce que l’éluent réagisse négativement avec le réactif de Bradford. La fraction élue présente une bande proéminente et concentrée de la protéine cible, qui devrait représenter principalement l’échantillon, avec seulement de petites traces, voire aucune, d’autres protéines.
8. Rassemblez différentes fractions, analysez-les avec SDS PAGE pour identifier quelles fractions contiennent les protéines pures, puis effectuez un échange de tampon dans le tampon de réaction (200 mM HEPES, 100 mM MgCl₂, 1 M KCl et 5 % de glycérol à pH 7,4) en utilisant une colonne-10.
   REMARQUE : Mesurez la concentration en protéines à l’aide du réactif Bradford (Coomassie Brilliant Blue G-250). Toutes les protéines doivent être congelées instantanément dans de l’azote liquide et stockées à -80 °C.

7. Essai de tueur bactérienne in vitro

1. Combinez 6 μM de VCP/p97 avec 1 μM chacun de NPLOC4 et UFD1, puis remplissez le volume avec un tampon de réaction à environ 90 μL. Laissez ce mélange de réaction incuber sur la glace pendant 2 heures.
2. Ajoutez 1 à 2 mM d’ATP au mélange réactionnel qui inclut p97-UFD1-NPLOC4, puis combinez-le avec le SPN ubiquitiné (10⁷ cellules) pendant une durée de 2 heures à 37 °C.
3. Pour évaluer la viabilité bactérienne, immédiatement après le traitement, prenez une aliquote de 1 μl du mélange réactionnel, effectuez une dilution en série (1:1, 1:10, 1:100 et 1:1000), et placez 10 à 2 μL de chaque dilution sur les plaques d’agar de l’infusion cerveau-cœur (BHI). Répétez cette procédure en utilisant une aliquote de 1 μL issue de la réaction après 2 heures d’incubation.
   REMARQUE : Repérez toutes les dilutions pour de meilleurs résultats.
4. Évaluez les unités formant des colonies (UFC) entre les points de 0 h et 2 h. Calculez la viabilité bactérienne ( %) en divisant le nombre d’UFC à 2 h par celui à 0 h, puis en multipliant le résultat par 100.
   REMARQUE : Pour obtenir des résultats plus fiables, utilisez VCP/p97 dénaturé thermiquement, VCP/p97 sans le complexe cofacteur UFD1-NPLOC4, ou une variante carence en ATPase de VCP/p97 pour comparaison comme témoin négatif.

Résultats

Notre protocole détaille l’utilisation des cellules A549 de mammifères pour produire un lysat cellulaire riche en composants nécessaires à l’initiation d’un processus d’ubiquitination (Figure 1A). Ce lysat, qu’il soit à l’état concentré ou remplacé par des composants purifiés tels que UBE1 (l’enzyme activatrice de l’ubiquitine E1), UbE2C (une enzyme conjuguant l’ubiquitine E2) et le complexe Rbx1-Skp1-Cul1-Fbxw7 (la ligase d’ubiquitine E3), est mélangé à de l...

Discussion

Bien que le système de reconstitution in vitro détaillé ici offre un cadre solide pour explorer les subtilités moléculaires de l’ubiquitination et de l’élimination bactériennes, plusieurs limites importantes doivent être prises en compte. La dépendance aux concentrations supraphysiologiques de protéines purifiées, comprenant la machinerie d’ubiquitination (ligases E1, E2, E3, ubiquitine) et le complexe effecteur de l’hôte (VCP/p97, UFD1, NPLOC4), offre des connaissances mécanist...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Cocktail inhibiteur de protéase 50X	Proméga  ;	G6521
6x-His-Ubiquitin	UBPBio	E1100
Lignée cellulaire A549   ;	ATCC	ATCC CCL-185
Alexa Fluor 488	Invitrogen	A21202  ;
Alexa Fluor 555	Invitrogen	A-31572  ;   ;
Anticorps anti-ubiquitine	Enzo	BML-PW8810-0100
Anti-Ubiquitine K48, anticorps clone Apu2 spécifique à l’ubiquitine	Sigma Aldrich	ZRB2150
ATP	Sigma Aldrich	A6419
BHI	HiMedia  ;	M210
DMEM (glucose élevé)	HiMedia  ;	AL251
FBS	Gibco (origine américaine)	38220090
Glycérol	PureSynth  ;	PSR37325
HEPES	Sigma Aldrich	H4034-100G
KCl	Sigma Aldrich	P3911
MgCl2	Sigma Aldrich	TC006
Paraformeldéhyde  ;	Sigma Aldrich	E6148
Plasmide pET28a-p97	Notre laboratoire		Plasmide disponible sur demande
Plasmide pET41b-NPLOC4	Notre laboratoire		Plasmide disponible sur demande
Plasmide pET41b-UFD1	Addgene	Plasmide #117107
Rbx1-Skp1-Cul1-Fbxw7  ;	Sigma Aldrich	23-030
Souche R6 de Streptococcus pneumoniae	ATCC	ATCC BAA-255	Agent pathogène du groupe de risque -2, à gérer dans l’installation BSL-2
Poudre de bouillon Todd Hewitt	HiMedia  ;	M313
UBE1	UBPBio	B1100
UbE2C	UBPBio	C1300
Urée	HiMedia  ;	MB032
Poudre d’extrait de levure   ;	HiMedia  ;	RM027