Article de méthode

Microfabrication de substrats avec des gradients de rigidité à l’échelle microscopique pour guider la migration des cellules stromales de la moelle osseuse

DOI :

10.3791/69473

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14 novembre 2025

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1State Key Laboratory of Oral & Maxillofacial Reconstruction and Regeneration, Key Laboratory of Oral Biomedicine Ministry of Education, Hubei Key Laboratory of Stomatology, School & Hospital of Stomatology, Wuhan University, 2School of Power and Mechanical Engineering, The Institute of Technological Science, Wuhan University, 3Department of Oral Implantology, School and Hospital of Stomatology, Wuhan University

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce protocole détaille la fabrication d’un substrat bicouche de polydiméthylsiloxane (PDMS) par lithographie douce. La méthode utilise des microstructures modulées géométriquement dans une sous-couche rigide combinée à une couche supérieure plate et souple pour générer des gradients de rigidité efficaces à l’échelle microscopique, permettant des études de mécanobiologie cellulaire sans interférence topographique.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Comprendre comment les cellules réagissent aux signaux mécaniques est crucial pour élucider les mécanismes impliqués dans le développement des tissus et la progression de la maladie. Cependant, les substrats de culture cellulaire in vitro existants ne parviennent souvent pas à reproduire les gradients de rigidité physiologiques à l’échelle cellulaire tout en éliminant les indices topographiques confondants. Dans cette étude, nous présentons un modèle de rigidité découplé utilisant un substrat bicouche de polydiméthylsiloxane (PDMS). Ce substrat se compose d’un film supérieur souple et plat suspendu sur une sous-couche rigide présentant des microstructures à crêtes et rainures. La couche supérieure transmet efficacement les variations de rigidité de la structure sous-jacente tout en maintenant une topographie et une chimie uniformes à la surface de contact de la cellule. La modulation de rigidité est obtenue en faisant varier la largeur des crêtes et des rainures alternées, qui sont espacées de manière égale. La microscopie électronique à balayage a confirmé la morphologie de la surface plane et la topographie de contact cohérente. La microscopie à force atomique a démontré que les variations de rigidité dépendaient de la microstructure : pour des motifs de 20 μm, les modules élastiques étaient d’environ 950 kPa pour les crêtes et 850 kPa pour les rainures ; pour des diagrammes de 50 μm, ces valeurs étaient d’environ 1070 kPa et 950 kPa, respectivement. Les cellules primaires de la moelle osseuse de souris ont bien adhéré et se sont réparties sur le substrat, montrant une préférence pour la localisation nucléaire vers les régions de crête plus rigides dans le motif de 50 μm (61,49 %, p < 0,05), confirmant ainsi la perception cellulaire efficace du gradient mécanique. En résumé, ce protocole offre une méthode reproductible pour construire un substrat de culture cellulaire avec des gradients de rigidité à l’échelle microscopique, minimisant les interférences chimiques ou topographiques, permettant des investigations dans la mécanotransduction cellulaire.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les cellules ont la capacité de détecter et de répondre aux stimuli mécaniques dans leur microenvironnement externe 1,2,3, qui sont cruciaux pour réguler divers processus cellulaires, notamment l’adhésion, la migration, la prolifération et la différenciation4. In vivo, les propriétés mécaniques du microenvironnement tissulaire présentent une hétérogénéité spatiale significative, avec des variations de rigidité matricielle observées à la fois dans des contextes physiologiques - tels qu’aux jonctions de l’os et du muscle - et dans des conditions pathologiques, comme au sein des tumeurs 5,6,7. Une étude approfondie de ces facteurs mécaniques est essentielle pour comprendre les mécanismes de régulation qui régissent le comportement cellulaire. Ces mécanismes sont essentiels dans des processus tels que le développement des tissus, la progression de la maladie et le processus de régénération et de réparation 8,9.

Pour simuler in vitro ce microenvironnement mécanique complexe, les hydrogels ou les élastomères sont largement utilisés pour créer des substrats avec une rigidité variable en ajustant le degré de réticulation ou le rapport des composants 3,10,11,12,13. Cependant, ces méthodes entraînent souvent des changements de rigidité discrets qui ne parviennent pas à reproduire les gradients de rigidité continus à l’échelle microscopique qui imitent avec précision les conditions physiologiques 13,14,15,16,17. Des études récentes ont exploré des techniques telles que la réticulation optique (par exemple, l’utilisation d’un photomasque pour réguler l’exposition aux UV)18, le mélange microfluidique multicanaux19,20 et les moyens de diffusion21 pour construire des gradients de rigidité. Malheureusement, ces approches peuvent être techniquement complexes et introduire des variables supplémentaires, telles que la taille des mailles22, le gonflement23,24 et la topographie25. L’introduction de facteurs de perturbation complique l’interprétation des réponses cellulaires à la rigidité. Un système PDMS bicouche, utilisant des réseaux de micropiliers ou des motifs en damier comme structure de support, a été adopté pour créer des substrats de culture cellulaire avec des gradients de rigidité26,27. Ces approches s’appuient sur des supports sous-jacents discrets sous une membrane chimiquement homogène pour obtenir une modulation de rigidité isotrope, fournissant ainsi des plates-formes précieuses pour l’étude de l’adhésion et de la propagation cellulaires. Cependant, le microenvironnement cellulaire natif in vivo est souvent très anisotrope dans ses propriétés mécaniques28,29. On suppose que cette signalisation mécanique directionnelle influence profondément les événements biologiques fondamentaux. Par conséquent, les stratégies de biofabrication actuelles sont limitées dans leur capacité à reproduire les interactions subtiles de rigidité cellulaire observées in vivo, qui dépendent de l’imitation précise des gradients de rigidité à l’échelle microscopique et de l’hétérogénéité spatiale au sein de substrats chargés de cellules.

Des recherches antérieures ont démontré que les cellules peuvent percevoir la rigidité effective d’objets rigides même lorsqu’ils ne sont pas en contact cellulaire direct30. Sur la base de cette étude, nous introduisons un nouveau substrat de culture cellulaire bicouche polydiméthylsiloxane (PDMS) qui génère des gradients de rigidité contrôlés à des échelles spatiales allant de 5 à 50 μm, s’alignant sur la gamme de tailles pertinente pour la mécanodétection subcellulaire et unicellulaire. Le substrat se compose de deux couches distinctes : une sous-couche PDMS rigide présentant des microstructures géométriques réglables et une couche supérieure PDMS souple uniforme et plate qui sert de surface de contact avec les cellules. Cette conception permet une modulation mécanique uniquement par le biais de variations de la géométrie de la sous-structure, tout en maintenant une chimie de surface et une topographie cohérentes. Par conséquent, il découple efficacement le signal de rigidité d’autres indices physiques et chimiques, offrant ainsi un système plus pertinent sur le plan biologique pour la modulation de la rigidité.

Contrairement aux substrats traditionnels à base d’hydrogel, notre approche permet des études mécaniques à variable unique sans interférence de gonflement, de taille de maille ou de topologie de surface. Le substrat est simple à fabriquer à l’aide de la lithographie douce standard et est hautement reproductible31. Il est également compatible avec la microscopie à haute résolution, ce qui le rend particulièrement bien adapté à l’imagerie en temps réel et aux études quantitatives des réponses cellulaires aux signaux de rigidité à l’échelle microscopique. Ce manuscrit présente le protocole de fabrication complet, détaille la stratégie de contrôle des paramètres et démontre l’utilité du substrat avec des expériences de culture cellulaire représentatives. En fin de compte, cette approche fournit un outil in vitro robuste et accessible pour explorer les réponses cellulaires à un gradient de rigidité à l’échelle microscopique.

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Protocole

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Des cellules stromales primaires de moelle osseuse de souris ont été isolées dans le tibia et le fémur de souris (No. WP20230204, approuvé par le Comité d’éthique du Centre d’expérimentation animale de l’Université de Wuhan).

1. Préparation du moule maître

REMARQUE : Nos protocoles sont spécifiques à la résine photosensible négative à base d’époxy utilisée lors de cette recherche.

  1. Placez deux plaquettes de silicium propres (50,8 ± 0,2 mm, orientées <100>, 525 ± 25 μm) sur la plaque chauffante pendant quelques minutes pour les déshydrater.
  2. Prenez une plaquette de silicium de la plaque chauffante et refroidissez-la à température ambiante avant de procéder au revêtement par rotation. Appliquez 3 à 5 ml de résine photosensible au centre de la plaquette.
  3. Pour obtenir une hauteur de caractéristique de 20 μm, appliquez le protocole de spin suivant : spin pendant 10 s à 7,1 × g, suivi d’un spin à 410 × g pendant 30 s. Pour obtenir une hauteur de caractéristique de 30 μm, appliquez le protocole de spin suivant : spin pendant 10 s à 7,1 × g, suivi d’un spin à 170 × g pendant 30 s. Utilisez un scalpel avec précaution pour enlever toute perle de bord qui pourrait se former pendant le revêtement de rotation.
  4. Cuire doucement de la manière suivante : réglez la plaque chauffante à 95 °C, laissez la gaufrette reposer sur la plaque chauffante pendant 13 min. Retirez la plaquette de la plaque chauffante et laissez-la refroidir naturellement à température ambiante, en évitant une chute soudaine de la température.
  5. Alignez le photomasque sur la plaquette recouverte d’une résine photosensible et exposez-la à la lumière UV à une dose totale de 120 mJ/cm2.
  6. Cuire après l’exposition de la manière suivante : à l’aide de deux plaques chauffantes (65 °C et 95 °C), laissez la plaquette revêtue de résine photosensible reposer sur la plaque chauffante à 65 °C pendant 1 min avant de la transférer sur la plaque chauffante à 95 °C et de la laisser là pendant 5 min. Déplacez la plaquette sur une pile de mouchoirs en microfibre et laissez-la refroidir à température ambiante.
  7. Développez la plaquette en la transférant dans une boîte de Pétri remplie d’AGAMP, et immergez-la entière dans le révélateur. Accélérer le développement par agitation manuelle.
    REMARQUE : L’AGPM est inflammable et irritant pour les yeux et les voies respiratoires. Jetez-le comme « déchet organique inflammable » dans des conteneurs dédiés.
  8. Après le développement, retirez la plaquette du révélateur et lavez-la dans de l’isopropanol. Si un écoulement blanc laiteux se forme dans l’isopropanol près de la surface de l’échantillon (le développement n’est pas terminé), réimmergez l’échantillon dans le révélateur pour terminer le processus de développement. Lavez l’échantillon développé dans de l’isopropanol jusqu’à ce qu’aucun écoulement blanc laiteux ne se forme près de la surface de l’échantillon. Une fois complètement développé, faites cuire la résine photosensible en plaçant la plaquette sur une plaque chauffante à 150 °C pendant 15 min.
  9. Fluorez la plaquette pour les procédés de lithographie douce suivants : exposez la plaquette à un plasma d’oxygène sous vide pendant 30 s (100 W) pour activer la surface, puis placez-la dans un dessiccateur sous vide. Déposez 30 μL de silane trichloro(1H,1H,2H,2H-tridecafluoro-n-octyl) sur une lame de verre placée à l’intérieur du dessiccateur sous vide. Évacuez le dessiccateur pendant 2 min et maintenez la condition de vide pendant 30 min. Cuire la gaufrette à 90 °C pendant 1 h pour terminer le processus de silanisation.
    REMARQUE : Contrôlez strictement l’humidité relative ambiante en dessous de 60 % tout au long du processus. Une humidité excessive peut induire une hydrolyse rapide du silane, ce qui génère des précipités de polysiloxane blancs non volatils. Les précipités nuisent à l’uniformité de la distribution de la vapeur de silane, ce qui entraîne un échec de la silanisation. Effectuez le traitement dans une hotte car le silane trichloro(1H,1H,2H,2H-tridecafluoro-n-octyl) réagit violemment avec l’eau, libérant des fumées toxiques de HCl. Neutraliser avec un alcali dilué avant de l’éliminer en tant que déchets organiques fluorés/chlorés. Le processus de silanisation atteint un taux de réussite de 90 %.

2. Fabrication

REMARQUE : Le processus de lithographie douce utilisé pour fabriquer le substrat bicouche de polydiméthylsiloxane (PDMS) peut être divisé en deux étapes distinctes : 1) La préparation de la sous-couche structurée et de la couche supérieure, 2) Le collage des deux couches PDMS. Le rendement manufacturier global est supérieur à 80 %.

  1. Préparation du PDMS
    1. Pour la sous-couche structurée, préparez le précurseur PDMS en mélangeant le prépolymère et l’agent de durcissement dans un rapport de 10:1 en poids, suivi d’un dégazage sous vide. Verser 1,5 mL du précurseur PDMS (10:1) sur le moule maître SU8, en couvrant toute la surface, suivi d’un dégazage sous vide et d’un repos de 30 min. Mettez-le délicatement dans un four et faites-le durcir à 90 °C pendant 1 h. Démoulez la sous-couche PDMS structurée du moule maître.
    2. Pour la couche supérieure, préparez le précurseur PDMS en mélangeant le prépolymère et l’agent de durcissement dans un rapport de 30:1 en poids et en dégazant sous vide. Versez le précurseur PDMS sur une plaquette de silicium fluoré. Pour obtenir une épaisseur de 9 μm, appliquer le protocole de spin coating suivant : spin à 7,1 × g pendant 10 s, suivi d’un spin à 2 300 × g pendant 60 s.
    3. Après l’étalage par centrifugation, inspectez visuellement le film PDMS sous la lumière ambiante pour vérifier son uniformité, en examinant spécifiquement les défauts visibles tels que les stries, les bulles ou l’accumulation de bords inégaux. Si le film semble uniformément transparent avec une réflectivité constante sur toute la surface de la plaquette, passez à l’étape suivante ; Si ce n’est pas le cas, répétez le processus de revêtement par centrifugation avec une nouvelle plaquette. Placez la plaquette revêtue sur une surface plane pour assurer une épaisseur de film PDMS homogène. Mettez-le délicatement dans un four et faites-le durcir à 90 °C pendant 3 h.
      REMARQUE : Des films d’une épaisseur de 9,11 ± 0,34 μm ont été obtenus.
  2. Liaison
    1. Placez la sous-couche PDMS structurée (10:1) avec le côté à motifs vers le bas sur le film de la couche supérieure PDMS, en assurant un bon contact entre les deux couches sans bulles à l’interface.
    2. Mettre l’ensemble dans le four et durcir à 90 °C pendant 3 h.
    3. Laissez l’ensemble refroidir à température ambiante sur une pile de mouchoirs en microfibre. Détachez la structure finale à double couche de la plaquette et rangez-la dans une boîte de Pétri pour une utilisation ultérieure.
      REMARQUE : Si des bulles se forment entre la couche supérieure et la sous-couche pendant le pelage, cela indique généralement une adhérence incomplète entre les deux couches. Assurez-vous d’un dégazage complet du précurseur PDMS avant le revêtement par centrifugation et vérifiez que la surface du film est exempte de poussière ou de contaminants avant l’application de la sous-couche PDMS pour un contact complet. Assurez-vous que la plaquette de silicium est de niveau pendant le revêtement, l’assemblage et le durcissement. La déchirure du film peut se produire en raison de la silanisation inégale de la plaquette ou de l’épaisseur non uniforme du PDMS. Pour résoudre le problème, contrôlez strictement l’humidité ambiante pendant la silanisation en dessous de 60 % HR. Le processus de silanisation atteint un taux de réussite de 90 %.

3. Caractérisation

  1. Microscopie électronique à balayage (MEB)
    1. Coupez l’échantillon avec une lame tranchante pour obtenir des bords nets.
    2. Montez les échantillons sur des platines MEB à 90° et 0° à l’aide de ruban de carbone conducteur pour permettre la caractérisation de la section transversale et de la surface, respectivement.
    3. Vaporisez les échantillons d’or pendant 120 s pour améliorer la qualité de l’imagerie MEB et collecter des images MEB des échantillons.
  2. Microscopie à force atomique (AFM)
    REMARQUE : Sélectionnez la sonde ScanAsyst-Air pour la cartographie nanomécanique quantitative du module.
    1. Positionnez l’embout en porte-à-faux de l’AFM au centre du champ de vision. Positionnez le spot laser sur l’extrémité du porte-à-faux en alignant le système de levier optique.
    2. Avant les mesures de cartographie nanomécanique quantitative PeakForce (PeakForce QNM), étalonnez le cantilever AFM pour déterminer les paramètres essentiels suivants : Constante de ressort en porte-à-faux : 0,40135 N/m ; Sensibilité à la déflexion : 28,993 nm/V (déterminée en effectuant une courbe de force sur un échantillon de référence rigide) ; Rayon de l’embout : ~21 nm (étalonné à l’aide de la méthode relative par rapport à un échantillon de référence dont le module est connu).
    3. Dans le panneau Balayage de la liste des paramètres de balayage, configurez les paramètres de balayage initiaux suivants : Réglez la taille de balayage sur 70 μm pour les échantillons comportant des bandes périodiques espacées de 50 μm. Réglez la taille de balayage sur 50 μm pour les échantillons comportant des bandes périodiques espacées de 20 μm. Réglez Échantillons/Ligne et Lignes sur 256 (ce qui donne une image de 256 x 256 pixels).
    4. Ouvrez les paramètres d’engagement dans le microscope et définissez le point de consigne d’engagement de force de crête par défaut de l’instrument dans les paramètres d’engagement.
    5. Cliquez sur l’icône Engager dans la barre d’outils du flux de travail et continuez à surveiller les signaux en temps réel pendant l’approche automatisée.
    6. Assurez-vous que ScanAsyst Auto Control est réglé sur le mode Individuel. Ajustez le point de consigne PeakForce à une valeur appropriée pour obtenir la plage de déformation souhaitée : pour la couche supérieure, le point de consigne PeakForce est de 0,020 nN ; pour la sous-couche structurée, le point de consigne PeakForce est de 5 nN.
    7. Lancez l’analyse en cliquant sur les boutons de haut en bas ou de bas en haut .
    8. Surveillance et correction de la courbe de force : si les courbes de force semblent déformées ou si des problèmes de synchronisation sont observés (par exemple, des formes irrégulières, des lignes de base incohérentes), cliquez avec le bouton droit de la souris dans la fenêtre du moniteur de force et sélectionnez Configuration automatique pour corriger automatiquement l’alignement et la sensibilité de la courbe de force.
    9. Dans les paramètres du canal de calcul du module , sélectionnez le modèle DMT pour ajuster la partie rétraction de la courbe de force pour le calcul du module d’élasticité.
    10. Cliquez sur le bouton de capture pour acquérir et enregistrer la topographie haute résolution et la carte des propriétés nanomécaniques.
    11. Effectuer l’analyse post-acquisition à l’aide du logiciel de traitement et d’analyse d’images AFM. Ouvrez les fichiers de données AFM enregistrés et extrayez les valeurs de module en sélectionnant des régions sur la surface de l’échantillon ; Calculez le module moyen, l’écart-type et les profils de distribution pour la couche supérieure et la couche inférieure à l’aide des outils d’analyse statistique intégrés au logiciel. Exportez des cartes de module traitées et des données quantitatives.
    12. Nombre de balayages AFM par échantillon : Effectuez trois balayages indépendants sur l’ensemble de la zone pour chaque échantillon. Assurez-vous que chaque balayage couvre une région correspondant à la taille des caractéristiques structurelles de l’échantillon, 70 μm × 70 μm pour les échantillons avec des bandes périodiques espacées de 50 μm, et 50 μm × 50 μm pour ceux avec des rayures espacées de 20 μm. Pour les mesures de module de la structure sous-jacente (PDMS 10:1) et du film de la couche supérieure (PDMS 30:1), mettez en œuvre la stratégie d’échantillonnage suivante pour garantir la fiabilité des données.
      1. Film de couche supérieure (PDMS 30:1) : mesurez le module 2x indépendamment, chaque mesure étant composée de deux balayages de 5 μm × 5 μm qui ne se chevauchent pas.
      2. Structure sous-jacente (PDMS 10:1) : Étant donné ses deux configurations distinctes de bandes périodiques (espacement de 20 μm et 50 μm), mesurez le module 2x indépendamment pour chaque configuration.

4. Expérience de culture cellulaire in vitro

REMARQUE : Le PDMS est un matériau hydrophobe qui doit être enduit pour favoriser l’adhésion cellulaire avant la culture cellulaire, et la méthode de revêtement appropriée doit être sélectionnée en fonction du type de cellule. Une approbation éthique doit être obtenue si des cellules primaires sont utilisées pour l’expérience cellulaire.

  1. Revêtement en poly-D-lysine (PDL)
    1. Stériliser le substrat par immersion dans l’alcool pendant 10 min ; puis laver 3 x 5 min avec du PBS.
    2. Dissoudre le PDL (poids moléculaire de 150 000 à 300 000 Da) à l’aide de PBS à une concentration de 0,1 mg/mL. Pour le substrat de 24 puits, ajoutez 1 mL de solution de travail PDL et placez-le dans un incubateur à 37 °C pendant 4 h pour recouvrir complètement la surface du substrat.
    3. Une fois le revêtement terminé, retirez la solution de travail PDL et éliminez tout résidu de PDL en lavant 3 fois avec du PBS. Utilisez le substrat pour les expériences cellulaires ultérieures. Si le revêtement n’est pas utilisé immédiatement, séchez-le et rangez-le à 4 °C.
      REMARQUE : Un revêtement réussi a présenté une surface homogène et sans caractéristiques sous microscopie à contraste de phase, sans précipités cristallins visibles ni artefacts de séchage. Les substrats présentant des signes de cristallisation ou de revêtement non uniforme ont été jetés.
  2. Isolement et culture de cellules stromales primaires de moelle osseuse de souris (mBMSC)
    1. Isolez les cellules stromales primaires de la moelle osseuse de souris (mBMSC) du tibia et du fémur de souris.
    2. Cultivez les cellules dans un milieu de croissance composé de α-MEM complété par 10 % de sérum de veau fœtal (FBS), 1 % d’antibiotique-antimycosique et 1 % de pyruvate de sodium.
    3. Ensemencer les cellules au passage 3 sur les substrats obtenus à l’étape 4.1.3 à une densité de 5 000 cellules/cm2 afin de minimiser les effets confusionnels potentiels dus au contact cellule-cellule.
  3. Coloration et imagerie par immunofluorescence
    1. Après 16 h de culture (37 °C, 5 % de CO2), fixez les cellules avec 4 % de paraformaldéhyde pendant 10 min à température ambiante et lavez-les 3 fois avec du PBS. Ensuite, perméabilisez les cellules avec 0,1 % de Triton X-100 pendant 15 min à température ambiante et lavez-les 3x avec du PBS.
    2. Pour la visualisation du cytosquelette, colorez l’actine F à l’aide de phalloïdine (dilution 1:500) pendant 20 minutes à température ambiante, et lavez-la 3 fois avec suffisamment de PBS pour éliminer tout colorant résiduel.
    3. Monter le substrat avec coloration simultanée des noyaux cellulaires. Appliquez une goutte de glycérine avec du DAPI pour couvrir les cellules. Ensuite, placez soigneusement une lamelle sur le substrat et scellez les marges avec du vernis à ongles. Évitez autant que possible les bulles.
    4. Acquérez des images de fluorescence capturant la morphologie cellulaire et le positionnement nucléaire à l’aide d’un microscope à fluorescence inversée.

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Résultats

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La photolithographie a été utilisée pour fabriquer des moules maîtres en silicone réutilisables présentant des microstructures parallèles à crêtes et rainures. Deux modèles ont été créés, avec une largeur de rainure (la largeur de la crête est identique à la largeur de la rainure) de 20 et 50 μm, respectivement. Chaque zone à motifs mesurait 7 mm × 7 mm. La précision et la réutilisation des moules en silicone ont considérablement simplifié le processus de fabrication répétée de substrats. Le moule maître a ensuite été ut...

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Discussion

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Cette étude présente une nouvelle approche pour concevoir un substrat bicouche à base de PDMS conçu pour introduire des variations de rigidité localisées tout en maintenant une surface topographiquement uniforme et sans caractéristiques. Cette approche permet une modulation mécanique uniquement par le biais de variations dans la géométrie de la sous-structure, tout en maintenant une chimie de surface et une topographie cohérentes. Par conséquent, il découple efficacement le signal de rig...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cette étude a été soutenue financièrement par le Fonds de recherche fondamentale pour les universités centrales de Chine (n° 2042024YXB018 à W. Ji).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
  ; 4 % de paraformoldéhydeTechnologie ServicebioG1101
AcétoneShanghai Aladdin10000418
Anti-AntiGibco15240-062Antibiotique-Antimycotique
Milieu de montage antifade avec DAPIBeyotime BiotechnologyP0131glycérine avec DAPI & nbsp ;
Plaque de culture cellulaireNID70200124 puits
DessiccateurSichuan Shubo (Group) Co., Ltd913354-30SNDiamètre intérieur = 180 mm
Sérum fœtal bovinHyCloneSV30208.02
Microscope à fluorescence inverséeOlympeDP74
IsopropanolShanghai Aladdin80109218GC&ge ; 99.7%
Aligneur de masqueSichuan Nanguang Vacuum Technology Co., LtdH94-37
Modification de MEM AlphaHyCloneSH30265.01
Analyse du nanoscopeBrukerVersion 3.0Logiciel de traitement et d’analyse d’images AFM.
Système d’imagerie à haut contenu Opera Phenix PlusPerkin Elmer2400L23248  ;Équipé d’un objectif aérien de 10 fois
PGMEASuzhou NanoMicro Technology Co., Ltd171011-1Révélateur Photorésine Négatif ; SPEC : UL ; Pourcentage : min99,7 %
PhalloïdineUelandy  ;YP0052L594-Phalloidine
Solution saline tamponnée au phosphateHyCloneSH30256.01
Nettoyeur plasmaTechnologie du plasma (Allemagne)Flecto 10  ;
Poly-D-lysineBeyotime BiotechnologyST508Numéro CAS 27964-99-4
Microscope à sonde à balayageBrukerIcône dimensionnelleUtilise des logiciels de contrôle Nanoscope, incluant les espaces de travail expérimentaux PeakForce Quantitative Nanomechanical Mapping (PF-QNM) et Point-and-Shooting Ramping.
Embout en silicium sur levier nitrureBrukerSCANASYST-AIRLa sonde est dotée d’un seul porte-à-faux en forme de V, recouvert d’un réflexe en aluminium ; k = 0,4 N/m (nominal), f0 = 70 kHz.
Plaquettes de siliciumShenzhen Rigorous Technology Co., Ltd-50,8 et plus ; 0,3 mm de diamètre, (100) orienté, 525 et plus de 525 mm ; 25 & mu ; Épaisseur m
Sodium PyruvateGibco11360-070
Coasseur à filageInstitut de microélectronique de l’Académie chinoise des sciencesKW-4A
SU-8 3025Suzhou NanoMicro Technology Co., Ltd-Photo-résine négatif ; 72,3 % de solides ; Viscosité 4400 ; Densité 1,143g/ml
Kit d’élastomère silicone SYLGARD 184La société Dow Chemical01673921
Trichloro(1H,1H,2H,2H,2H-tridecafluoro-n-octyl)silaneShanghai Aladdin78560-45-9
Triton X-100BioFroxx1139ML1000,1 % de Triton X-100 pour la perméabilisation
Trypsine-EDTAGibco25200-0720,25 % de Trypsine-EDTA (1x)
Four à videMemmert (Allemagne) & nbsp ;VO 200  ;

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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