Method Article

Procédure d’échantillonnage basée sur le fil rouge phénol pour les lipidomiques du liquide lacrymal non ciblé dans la découverte de biomarqueurs

DOI:

10.3791/69474

⸱

December 12th, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Centre for Myopia Research, School of Optometry, The Hong Kong Polytechnic University, 2Centre for Eye and Vision Research (CEVR), 3Department of Food Science and Nutrition, The Hong Kong Polytechnic University, 4Research Centre for SHARP Vision (RCSV), The Hong Kong Polytechnic University, 5Department of Applied Biology and Chemical Technology, The Hong Kong Polytechnic University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce protocole décrit un protocole clinique unique pour la collecte d’échantillons de liquide lacrymal humain à l’aide de filaments rouges de phénol et d’un flux de travail basé sur la chromatographie liquide-spectrométrie de masse tandem (LC-MS/MS) pour découvrir le profil lipidomique des larmes. La méthode simple de séparation biphasique entre méthyl tert-butyl et méthanol permet une extraction rapide des lipides lacrymaux avec une récupération élevée pour la découverte de biomarqueurs lacrymales.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les lipides lacrymaux sont essentiels à la stabilité du film lacrymal et à la santé de la surface oculaire. Les modifications de la composition des larmes pourraient être associées à des maladies oculaires et systémiques telles que le dysfonctionnement des glandes de Meibomius et la dyslipidémie. Le profilage des lipides lacrymaux peut aider à la découverte de biomarqueurs pour le diagnostic et la prise en charge de la maladie. Cependant, les méthodes courantes d’échantillonnage des larmes présentent des limites distinctes : les bandes de Schirmer provoquent fréquemment irritation et inconfort oculaire en raison de leur grande surface de contact avec la surface oculaire, tandis que la collecte par tube microcapillaire peut entraîner une faible reproductibilité en raison de la variabilité de l’opérateur, surtout lorsqu’elle est réalisée par un personnel différent. Ces limitations pourraient compromettre la précision et la cohérence des données lipidomemiques. Cette étude introduit une méthode d’échantillonnage à base de fil rouge de phénol (PRT) peu invasive, optimisée pour la lipidomie des larmes. La structure fine du PRT minimise le risque d’irritation oculaire et permet une collecte rapide et douce des larmes. Cette méthode conviviale et facile à réaliser convient aux sujets ayant un volume lacrymal réduit ou une tolérance plus faible aux sensations de corps étranger, et elle permet une collecte d’échantillons plus reproductible en réduisant la variabilité dépendante de l’opérateur. Les lipides lacrymoles collectés par la PRT ont été extraits à l’aide d’un protocole de séparation de phase metanol/méthyl tert-butyl (MTBE) optimisé et analysés par LC-Orbitrap-IQX MS/MS haute résolution avec le logiciel LipidSearch. Le flux de travail a identifié plus de 700 espèces uniques de lipides lacrymaux, chacune caractérisée par des ions produits spécifiques dérivés des acides gras. Ces résultats indiquent que l’échantillonnage basé sur la PRT permet une récupération robuste des lipides pour l’analyse lipidomique des larmes. Cette approche minimalement invasive et reproductible offre une plateforme pratique pour la recherche clinique et expérimentale sur les lipides lacrymales. En fin de compte, cela pourrait également faciliter la découverte de biomarqueurs et la surveillance des maladies.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le film lacrymal est la barrière la plus externe qui protège la surface oculaire contre les agents pathogènes et maintient l’homéostasieoculaire 1,2, tandis que la couche lipidique du film lacrymal est le composant clé pour prévenir l’évaporation lacrymale et maintenir la stabilité du filmlacrymal 3,4. La dysrégulation de la composition des lipides lacrymaux a été liée à diverses maladies oculaires, notamment la maladie de l’œil sec (DED), la dysfonction des glandes de Meibomius (MGD) et la conjonctivite allergique 5,6,7,8. En conséquence, la caractérisation détaillée des lipidomes lacrymaux est devenue une orientation de recherche essentielle et en tendance pour une compréhension plus complète des pathologies moléculaires sous-jacentes à ces affectionsoculaires.

Bien que l’approche lipidomique des larmeses ait une importance clinique significative, un défi crucial en lipidomiques larmuraux est d’établir un flux de travail standardisé et reproductible de collecte et d’analyse. Les méthodes actuelles d’échantillonnage par larmes, les bandes de Schirmer et le tube microcapillaire, présentent chacune des limites distinctes. Les bandes de Schirmer ont une grande surface de contact avec la surface oculaire qui provoque souvent des irritations oculaires et des déchiruresréflexes 9,10. En comparaison, la collecte de tubes microcapillaires dépend fortement de la technique de l’opérateur et peut donner des résultats incohérents lorsqu’elle est réalisée par différentsmembres du personnel 11. De plus, une utilisation inappropriée de ces outils d’échantillonnage peut également comporter un risque de blessure à la surface oculaire. Ces limitations pourraient compromettre la précision et la reproductibilité des données enaval 12,13. De plus, les méthodes de collecte des larmes, nécessitant des procédures complexes de manipulation, peuvent limiter leur accessibilité et leur standardisation selon les laboratoires et les milieux cliniques. Il est donc urgent d’établir un flux de travail de collecte et de traitement des larmes, non invasif, robuste et reproductible, capable de préserver le profil lipidique natif.

Des études récentes ont mis en lumière l’utilité du fil rouge phénol (PRT) pour les analyses en aval des flux de travail LC-MS/MS dans les applications protéomiques et métabolomiques14,15. La PRT offre des avantages inhérents en tant qu’outil de collecte des larmes. Sa structure mince, sa nature peu invasive et sa procédure d’échantillonnage simple pourraient minimiser la complexité technique et diminuer la variabilité dépendante de l’opérateur, tout en étant bien tolérés par la plupart dessujets 14,16. Cependant, un flux de travail standardisé spécifiquement pour l’analyse lipidomique des larmes basée sur la PRT n’a pas encore été établi.

Ce protocole introduit un flux de travail intégré pour la lipidemie des larmes reproductibles : une méthode de collecte des larmes adaptée à l’analyse lipidique adaptée à l’analyse lipidique basée sur un PRT, un protocole d’extraction optimisé méthyl-tert-butyl éther (MTBE)/méthanol avec des rapports solvant/échantillon définis et des contrôlesde stockage 17,18, ainsi qu’une méthode modifiée d’identification lipidique utilisant des LC-MS/MS haute résolution. Cette approche standardisée permet un profilage lipidomique des déchirures cohérent pour la découverte en aval de biomarqueurs et la caractérisation de la maladie. De plus, il convient particulièrement bien aux sujets ayant un faible volume larmal ou une tolérance réduite aux sensations de corps étrangers (Figure 1).

figure-introduction-1
Figure 1 : Aperçu schématique du flux de travail basé sur le Phenol Red Thread (PRT) pour la lipidemie des larmes. Le liquide lacrymal est prélevé sur les sujets utilisant l’approche PRT, ce qui permet une collecte d’échantillons régulière avec un minimum d’inconfort. Le traitement des échantillons implique une extraction biphasique séquentielle de MTBE/méthanol, une concentration médiée par SpeedVac, et la reconstitution d’extraits de lipides lacrymaux pour la chromatographie liquide-spectrométrie de masse tandem (LC-MS/MS). Les profils lipidomiques sont ensuite acquis via LC-MS/MS et soumis à une annotation et à une identification à l’aide du logiciel LipidSearch. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L’étude a été approuvée par le Conseil d’Éthique Institutionnelle (IRB) de l’Université polytechnique de Hong Kong. Les sujets ont fourni un consentement éclairé écrit avant de participer à l’étude. Les réactifs et l’équipement utilisés sont listés dans le tableau des matériaux.

1. Collecte de liquide lacrymal humain à base de fil rouge phénol (PRT)

  1. Portez des gants et désinfectez le poste de travail pour éviter la contamination des échantillons.
  2. Assurez-vous que le paquet PRT est scellé et non périmé avant de l’ouvrir.
  3. Tiens le fil à l’extrémité opposée au crochet plié. Évitez toujours de toucher la moitié du crochet plié du PRT.
  4. Demandez au sujet de regarder la direction nasale supérieure.
  5. Tirez doucement vers le bas la paupière inférieure du sujet et insérez le PRT avec le crochet plié positionné dans la conjonctive palpébrale temporale inférieure, près du canthus externe de l’œil du sujet (Figure 2).

figure-protocol-1
Figure 2 : Position du fil rouge phénol lors de la collecte des larmes. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

  1. Demandez au sujet de fermer doucement les yeux et d’incliner légèrement sa tête vers l’avant pour empêcher le PRT de toucher sa peau faciale.
    REMARQUE : L’absorption par la larme induirait progressivement un front de colorant rouge, indiquant la région échantillonnée de PRT due au phénol rouge sensible au pH. Pour garantir une quantité suffisante de liquide lacrymal pour l’analyse lipidomique, il est préférable de collecter un volume lacrymal équivalent à 50 mm de PRT, généralement réalisé en moins de 2 minutes.
  2. Tirez doucement vers le bas de la paupière du sujet et retirez le PRT échantillonné. Évitez de toucher la région échantillonnée.
  3. Notez la longueur de la région échantillonnée du PRT et transférez le PRT dans un nouveau tube d’échantillon à l’aide de pinces stériles.
    REMARQUE : Si la longueur du PRT échantillonné est de <50 mm, veuillez demander au sujet de se reposer 1 à 3 minutes et répéter la collecte avec le même regard. Transférez chaque PRT échantillonné dans un tube d’échantillonnage séparé.
  4. Marquez et bouchez correctement les tubes d’échantillons.
  5. Nettoyez soigneusement les gants et les pinces avec du méthanol et des lingettes en papier propres pour enlever les résidus de larmes ou les contaminants, puis laissez-les sécher.
  6. Répétez les étapes 1.2-1.10 pour l’autre œil.
  7. Scellez les tubes d’échantillon avec du parafilm et stockez immédiatement l’échantillon à -20°C pour un stockage temporaire ou à -80°C pour un stockage à long terme. Évitez les cycles de gel et de dégel inutiles et protégez le PRT échantillonné de la lumière.

2. Traitement du PRT échantillonné

  1. Pré-laver les micro-ciseaux avec du méthanol avant de traiter les PRT.
  2. Jetez l’extrémité tordue du crochet (c’est-à-dire les 3 premiers mm) des PRT (Figure 3).

figure-protocol-2
Figure 3 : Apparence physique du fil rouge phénol (PRT). (A) PRT inutilisé avec l’extrémité du crochet courbée. (B) Utilisé du PRT avec la section indiquée coupée et collectée pour extraction lipidique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

  1. Découpez la région échantillonnée du PRT (c’est-à-dire la région au-dessus du devant du colorant rouge phénol) en morceaux de 2 mm et transférez ces morceaux dans un tube de microcentrifugation propre tolérant aux solvants organiques de 1,5 mL.

3. Séparation biphasique MTBE/méthanol pour l’extraction lipidique à partir de PRT échantillonné

ATTENTION : Le MTBE et le méthanol sont inflammables et volatils. À utiliser dans un endroit bien ventilé ou dans une hotte à fumée. Évitez les flammes ouvertes et les étincelles. Porte des gants et une blouse de laboratoire. Lavez-vous les mains après la manipulation.

  1. Mettez les échantillons sur la glace.
  2. Ajoutez 232 μL de méthanol glacé (qualité MS) à chaque échantillon et formez un vortex pendant 15 s.
  3. Sonicez les échantillons dans un nettoyant ultrasonore pré-refroidi pendant 15 minutes.
  4. Ajoutez 774 μL de MTBE (grade HPLC) et 194 μL d’eau déionisée à chaque échantillon et vortex pendant 15 secondes. Le rapport volumique résultant de MTBE :méthanol :eau dans l’échantillon devrait être de 4:1,2:1 (v/v/v).
  5. Sonicez à nouveau les échantillons dans un nettoyeur ultrasonique pré-refroidi pendant 15 minutes.
  6. Incubez l’échantillon dans le thermomixeur pendant 8 heures à 4 °C, en secouant à 1 200 tr/min.
  7. Laissez reposer le mélange à température ambiante pendant 10 minutes.
  8. Centrifugez les mélanges obtenus à 10 000 × g pendant 10 minutes à 4 °C.
  9. Après centrifugation, les mélanges sont séparés en deux phases (Figure 4).
    REMARQUE : À la fin de la séparation de phase, inspectez l’échantillon pour deux couches distinctes : la phase organique supérieure (riche en MTBE) doit apparaître transparente avec une légère opacité lactée, tandis que la phase aqueuse inférieure présente une coloration jaune due à la présence d’un indicateur rouge phénol. Ne procéder que si ces caractéristiques de phase sont observées, comme montré à la Figure 4.

figure-protocol-3
Figure 4 : Séparation de phase de l’extraction lipidique à l’aide de MTBE-méthanol-eau : phase organique supérieure et phase aqueuse inférieure. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

  1. Collectez soigneusement 700 μL de la fraction organique supérieure contenant des lipides et transférez-les dans un nouveau tube microcentrifuge pré-refroidi de 1,5 mL.
  2. Rejetez la phase aqueuse inférieure contenant des résidus de MTBE et du méthanol comme déchets chimiques dangereux. Collectez les déchets dans des contenants étiquetés et scellés et jetez-les conformément aux protocoles institutionnels de gestion des déchets dangereux et aux réglementations locales. Ne versez pas de solvants dans le drain.
  3. Séchez les extraits lipidiques à l’aide d’un concentrateur SpeedVac réfrigéré pendant 4 h à 4 °C.
    REMARQUE : Pour garantir un séchage complet, vérifiez périodiquement la sécheresse de l’échantillon à partir de 2 heures. Prolongez le temps de séchage si nécessaire jusqu’à ce que les échantillons soient complètement séchés.
  4. Conservez les extraits lipidiques séchés à -20 °C pour un stockage à court terme ou à -80 °C pour un stockage à long terme.

4. Reconstitution des lipides larmuraux extraits pour l’analyse LC-MS/MS

  1. Reconstituer les extraits lipidiques séchés avec 50 μL du mélange méthanol glacé (grade MS)/chloroforme (grade HPLC) (1:1, v/v) comme solvant (1 μL de solvant pour 1 mm de PRT utilisé) puis par sonication dans un nettoyant ultrasonique pré-refroidi pendant 15 minutes.
  2. Centrifugez les extraits lipidiques reconstitués à 14 000 × g et 4 °C pendant 10 minutes.
  3. Transférez soigneusement 40 μL du surnageant dans un flacon en verre autoéchantillonneur avec un insert en verre installé.
  4. Bouchez fermement le flacon avec un capuchon ouvert sur le haut du cloison septum sans fente et soyez prêt pour l’analyse LC-MS/MS.

5. Acquisition d’échantillons par LC-MS/MS

  1. Pour la chromatographie liquide, réglez respectivement la chambre de colonne et la température de l’échantillonneur à 50 °C et 4 °C.
  2. Pour chaque injection, chargez 5 μL de l’échantillon sur une colonne LC à phase inverse (C18 ; 1,7 μm, 100 mm × 2,1 mm) et fractionnez les lipides à un débit de 0,3 mL/min sur un gradient de séparation de 24 minutes.
    1. Utilisez la phase mobile A comprenant un mélange d’acétonitrile 60:40 (grade MS) : eau (v/v) avec 5 mM de formate ammonium (grade MS) et 0,1 % (v/v) d’acide formique (grade MS) et la phase mobile B contenant 90:10 d’isopropanol (grade MS) : acétonitrile (v/v) avec 5 mM de formate ammonium et 0,1 % (v/v) d’acide formique.
    2. Utilisez le gradient suivant : 0-2 min : 40 % B ; 2-2,5 min : 40 % B ; 2,5-3 min : 58 % B ; 3-18 min : 99 % B ; 18-20 min : 99 % B ; 20-20,1 min : 40 % B ; 20,1-24 min : 40 % B.
  3. Pour le spectromètre de masse Orbitrap, réglez la tension de pulvérisation à +3,5 kV en mode positif ou -2,5 kV en mode négatif.
  4. Ajustez le débit de gaz de la gaine à 45 Arb et le débit de gaz auxiliaire à 10 Arb.
  5. Réglez le débit de gaz de balayage à 2 Arb.
  6. Réglez la température du tube de transfert d’ions à 300 °C et celle du vaporisateur à 320 °C.
  7. Utilisez le mode acquisition dépendante des données (DDA).
  8. Pour MS1, réglez la résolution à 120 000, la plage de balayage à 100-2000 m/z, la cible AGC standard, le temps d’injection automatique, l’exclusion dynamique à 6 s, et le seuil d’intensité à 5,0e4.
  9. Pour MS2, réglez la résolution à 15 000, la portée d’auto-balayage, la cible AGC standard, le temps d’injection dynamique, la fenêtre d’isolation à 1,6 m/z, le type d’énergie de collision en dissociation collisionnelle à haute énergie (HCD), et l’énergie de collision normalisée (NCE) à des valeurs écrannées de 15, 30 et 40.
  10. Analysez les données brutes avec le logiciel LipidSearch ou d’autres plateformes compatibles.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Des échantillons composites de larmes ont été prélevés sur 16 volontaires en bonne santé lors de trois visites indépendantes espacées de deux semaines (R1, plus ancienne série ; R2, R3 collectés séquentiellement deux semaines après chacun). En utilisant LipidSearch avec des critères stricts (c’est-à-dire rapport signal/bruit ≥100, grade C ou plus, et intensité ionique ≥30 000), nous avons identifié respectivement 773, 890 et 1 025 espèces lipidiques uniques dans R1-R3 (

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Avantages de l’échantillonnage des larmes et de l’extraction lipidique à base de PRT
Le flux de travail de lipidomiques des larmes basé sur le PRT présenté ici offre une méthode d’échantillonnage peu invasive et pratique pour un profilage complet des lipides larmes. Comparé aux bandes de Schirmer, qui nécessitent un contact prolongé et des volumes d’échantillons plus importants, l’échantillonnage PRT est rapide, peut être réalisé en moins de 2 minutes, est bien toléré...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce travail a été soutenu par l’initiative InnoHK, le gouvernement de la région administrative spéciale de Hong Kong et le Centre de recherche pour la vision SHARP à l’Université polytechnique de Hong Kong. Les auteurs reconnaissent également avec gratitude le soutien technique de l’University Research Facility in Chemical and Environmental Analysis (UCEA) et du University Research Facility in Life Sciences (ULS) de la Hong Kong Polytechnic University.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Acétonitrile (ACN), grade LC-MSRCI LabscanLM1005
ACQUITY UPLC CSH C18 ColonneWaters Corporation186005297130 & Aring ;, 1,7 & micro ; m, 2,1 mm x 100 mm
Formate d’ammonium, grade LC-MSSigma-Aldrich55674
Fiole en verre autoéchantillonneurWell Rich Scientific2ML-9-V1002Fiole de filetage à base plate 12 mL de 2 mL à base plate 9-425 avec étiquette (AVEC bloc-notes)
Bouchon à vis nervuré ouvert Blue 9-425   ;Well Rich Scientific9-SP1003avec 9mm, PTFE blanc/silicone rouge septa 1mm
Chloroforme, grade HPLCRéactifs de Duksan1271
Tubes à verrouillage Eppendorf, 1,5 mLEppendorf30120086
acide formique (FA),   ; Grade LC-MSThermoFisher ScientificA117-50
Micro-insert en verreWell Rich Scientific2ML-N2002250 & micro ; Insert en L, verre transparent, base conique avec polyspring, taille : 5,8*28,5 mm
Isopropanol, grade LC-MSRCI LabscanLM1162
Logiciel LipidSearchThermoFisher ScientificOPTON-30879Version 5
Méthanol   ; Grade LC-MSRCI LabscanLM1115
Fil rouge phénol & nbsp ; (PRT)Tianjin Jingming New Technology Development Co., Ltd20192160086
Centrifugeuse réfrigéréeThermoFisher Scientific75007200
Concentrateur centrifuge réfrigéré CentriVap et pièges à froid CentriVapLabconco16108335
Micro-tubes à bouchon à visThermoFisher Scientific3488
Éther méthylique-tert-butyle (MTBE), grade HPLCRéactifs de Duksan1070
Thermo Scientific Dionex UltiMate 3000 HPLCThermoFisher ScientificULTIM3000RSLCNANO
Thermo Scientific Orbitrap IQ-X Tribrid MSThermoFisher ScientificFSN05-10001
ThermoMixer CEppendorf5382000015
Nettoyant ultrasonoreUltrasons CrestP500D-45
Mélangeur à vortexRéférenceBV1003

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Esam, S., Singh, S., Konda, N., Gandhi, R., Vemuganti, G. K. Tear film lipid layer thickness: Measurement techniques, normative values and alteration in ocular surface diseases. Curr Eye Res. , (2025).
  2. Ambaw, Y. A., et al. Profile of tear lipid mediator as a biomarker of inflammation for meibomian gland dysfunction and ocular surface diseases: Standard operating procedures. Ocul Surf. 26, 318-327 (2022).
  3. Sheppard, J. D., Nichols, K. K. Dry eye disease associated with meibomian gland dysfunction: Focus on tear film characteristics and the therapeutic landscape. Ophthalmol Ther. 12 (3), 1397-1418 (2023).
  4. Lam, S. M., et al. Lipidomic analysis of human tear fluid reveals structure-specific lipid alterations in dry eye syndrome. J Lipid Res. 55 (2), 299-306 (2014).
  5. Borchman, D., Ramakrishnan, V., Henry, C., Ramasubramanian, A. Differences in meibum and tear lipid composition and conformation. Cornea. 39 (1), 122-128 (2020).
  6. Miyamoto, M., Sassa, T., Sawai, M., Kihara, A. Lipid polarity gradient formed by ω-hydroxy lipids in tear film prevents dry eye disease. eLife. 9, 53582(2020).
  7. Zhao, H., et al. Lipidomics profiles revealed alterations in patients with meibomian gland dysfunction after exposure to intense pulsed light. Front Neurol. 13, 827544(2022).
  8. Bland, H. C., Moilanen, J. A., Ekholm, F. S., Paananen, R. O. Investigating the role of specific tear film lipids connected to dry eye syndrome: A study on o-acyl-ω-hydroxy fatty acids and diesters. Langmuir. 35 (9), 3545-3552 (2019).
  9. Khanna, R. K., et al. Metabolomics and lipidomics approaches in human tears: A systematic review. Surv Ophthalmol. 67 (4), 1229-1243 (2022).
  10. Winiarczyk, M., Biela, K., Michalak, K., Winiarczyk, D., Mackiewicz, J. Changes in tear proteomic profile in ocular diseases. Int J Environ Res Public Health. 19 (20), 13341(2022).
  11. Bertram, M., et al. Influence of Schirmer strip wetness on volume absorbed, volume recovered, and total protein content in canine tears. Vet Ophthalmol. 24 (4), 425-428 (2021).
  12. Zhan, X., Li, J., Guo, Y., Golubnitschaja, O. Mass spectrometry analysis of human tear fluid biomarkers specific for ocular and systemic diseases in the context of 3p medicine. EPMA J. 12 (4), 449-475 (2021).
  13. Gijs, M., et al. Pre-analytical sample handling effects on tear fluid protein levels. Sci Rep. 13 (1), 1317(2023).
  14. Kecskeméti, G., Tóth-Molnár, E., Janáky, T., Szabó, Z. An extensive study of phenol red thread as a novel non-invasive tear sampling technique for proteomics studies: Comparison with two commonly used methods. Int J Mol Sci. 23 (15), 8647(2022).
  15. Barmada, A., Shippy, S. A. Quantifying sample collection and processing impacts on fiber-based tear fluid chemical analysis. Transl Vis Sci Technol. 9 (10), 23(2020).
  16. Hao, Y., et al. Validation of the phenol red thread test in a Chinese population. BMC Ophthalmol. 23 (1), 498(2023).
  17. Matyash, V., Liebisch, G., Kurzchalia, T. V., Shevchenko, A., Schwudke, D. Lipid extraction by methyl-tert-butyl ether for high-throughput lipidomics. J Lipid Res. 49 (5), 1137-1146 (2008).
  18. Ulmer, C. Z., Jones, C. M., Yost, R. A., Garrett, T. J., Bowden, J. A. Optimization of Folch, Bligh-Dyer, and Matyash sample-to-extraction solvent ratios for human plasma-based lipidomics studies. Anal Chim Acta. 1037, 351-357 (2018).
  19. Lam, S. M., et al. Extensive characterization of human tear fluid collected using different techniques unravels the presence of novel lipid amphiphiles. J Lipid Res. 55 (2), 289-298 (2014).
  20. Quah, J. H., Tong, L., Barbier, S. Patient acceptability of tear collection in the primary healthcare setting. Optom Vis Sci. 91 (4), 452-458 (2014).
  21. Saini, R. K., Prasad, P., Shang, X., Keum, Y. S. Advances in lipid extraction methods-a review. Int J Mol Sci. 22 (24), 13643(2021).
  22. Chen, J., Nichols, K. K., Wilson, L., Barnes, S., Nichols, J. J. Untargeted lipidomic analysis of human tears: A new approach for quantification of o-acyl-omega hydroxy fatty acids. Ocul Surf. 17 (2), 347-355 (2019).
  23. Köfeler, H. C., et al. Recommendations for good practice in MS-based lipidomics. J Lipid Res. 62, 100138(2021).
  24. Ulmer, C. Z., et al. A review of efforts to improve lipid stability during sample preparation and standardization efforts to ensure accuracy in the reporting of lipid measurements. Lipids. 56 (1), 3-16 (2021).
  25. Sens, A., et al. Pre-analytical sample handling standardization for reliable measurement of metabolites and lipids in LC-MS-based clinical research. J Mass Spectrom Adv Clin Lab. 28, 35-46 (2023).
  26. Salem, M., Bernach, M., Bajdzienko, K., Giavalisco, P. A simple fractionated extraction method for the comprehensive analysis of metabolites, lipids, and proteins from a single sample. J Vis Exp. (124), e55802(2017).
  27. Fong, P. Y., et al. Role of tear film biomarkers in the diagnosis and management of dry eye disease. Taiwan J Ophthalmol. 9 (3), 150-159 (2019).
  28. Sanroque-Muñoz, M., et al. Tear-derived extracellular vesicles as diagnostic biomarkers for ocular and neurodegenerative diseases: Opportunities and challenges. Extracell Vesicles Circ Nucl Acids. 6 (3), 609-625 (2025).
  29. Vera-Montecinos, A., et al. High throughput tear proteomics with data independent acquisition enables biomarker discovery in allergic conditions. Sci Rep. 15 (1), 31181(2025).

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