Article de méthode

Imagerie de cellules vivantes de la perméabilisation de la membrane lysosomale pendant la nécroptose

DOI :

10.3791/69495

⸱

14 novembre 2025

 ,  ,  , 
1Center for Regenerative Medicine, Heart Institute, Department of Internal Medicine, Morsani College of Medicine, University of South Florida

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce protocole décrit une méthode d’imagerie de cellules vivantes pour surveiller la perméabilisation de la membrane lysosomale pendant la nécroptose, à l’aide de sondes fluorescentes qui détectent les changements dans l’intégrité de la membrane lysosomale et l’acidification.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La nécroptose, une forme de nécrose régulée, aboutit à la rupture de la membrane cellulaire. Notre laboratoire et d’autres ont découvert que la perméabilisation de la membrane lysosomale (LMP) est un événement précoce et crucial dans ce processus, précédant la rupture de la membrane. La LMP rapide libère de puissantes enzymes lysosomales, en particulier des protéases, dans le cytosol, favorisant activement la mort cellulaire. L’imagerie de cellules vivantes constitue un outil inestimable pour détecter en temps réel la PMT pendant la nécropse. Plusieurs colorants fluorescents sont très efficaces : (1) Les colorants LysoTracker sensibles au pH suivent les changements de pH lysosomal. Une diminution du signal de fluorescence indique une perte du gradient de pH lysosomal, un signe primaire de dysfonctionnement lysosomal, qui peut être un précurseur ou une conséquence directe de la LMP. (2) Les billes de dextran marquées à la fluorescéine sont internalisées et s’accumulent dans les lysosomes. Leur libération dans le cytosol signale la fuite complète de LMP et de cargaison. Ici, nous avons observé une perte progressive de la fluorescence du Lysotracker, avec diffusion de la fluorescence du Dextran dans le cytosol après induction de la nécroptose. Ainsi, la méthodologie d’imagerie de cellules vivantes permet aux chercheurs de suivre avec précision le moment et l’étendue du dysfonctionnement lysosomal, contribuant ainsi à une compréhension plus complète des mécanismes de nécroptose et mettant en lumière des interventions thérapeutiques potentielles.

Introduction

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La nécroptose est une forme de mort cellulaire régulée indépendante de la caspase, impliquée dans de nombreuses maladies inflammatoires, troubles neurodégénératifs, maladies pulmonaires, hépatiques et cardiaques 1,2,3. Cette voie est médiée par une cascade complexe de réactions qui aboutissent à l’activation de la protéine kinase 1 interagissant avec le récepteur (RIPK1), qui interagit avec la protéine kinase 3 interagissant avec le récepteur (RIPK3) via leurs domaines 4,5,6 du motif d’interaction RIP homotypique (RHIM). RIPK3, à son tour, recrute la protéine de type kinase de lignée mixte (MLKL) pour former le nécrosome 7,8. La phosphorylation de MLKL par RIPK3 conduit à son oligomérisation et à sa polymérisation ultérieure. Les polymères MLKL se déplacent ensuite vers les membranes cellulaires, conduisant finalement à la rupture de la membrane cellulaire et à la mort cellulaire 9,10,11. Cependant, les mécanismes par lesquels les polymères MLKL se déplacent vers les compartiments membranaires et induisent une rupture membranaire ne sont pas entièrement compris.

Les lysosomes sont des organites responsables de la dégradation et du recyclage des matériaux cellulaires. Dans sa lumière, il y a des protéases, des lipases, des nucléases et des hydrolases qui sont responsables de la digestion des macromolécules, maintenant ainsi l’homéostasie cellulaire12,13. Par conséquent, le maintien de l’intégrité lysosomale et du bon fonctionnement est essentiel pour assurer une clairance cellulaire efficace, des adaptations au stress et une survie cellulaire globale 14,15,16. Des études récentes indiquent une association entre la nécroptose et la perméabilisation membranaire lysosomale (LMP)17,18,19.

Nos observations récentes ont montré que la LMP est un événement précoce et significatif dans le processus de nécroptose, précédant la rupture finale de la membrane cellulaire19. Plus précisément, la polymérisation de MLKL sur la membrane lysosomale induit une LMP rapide pour libérer de puissantes enzymes lysosomales, en particulier des protéases, y compris la cathepsine B, dans le cytosol. Ces protéases clivent ensuite les protéines vitales pour favoriser la mort cellulaire. Il est important de noter que l’inhibition de l’activité CTSB protège fortement contre la mort cellulaire19,20. Ces données suggèrent que la LMP est un modulateur crucial de la voie de la nécroptose. Par conséquent, le suivi du moment de l’AMM pendant la nécroptose est essentiel pour comprendre les mécanismes moléculaires et identifier des cibles thérapeutiques potentielles.

De nombreuses méthodes conventionnelles de détection de la LMP, telles que l’immunomarquage, la microscopie électronique à transmission (MET) ou la cytométrie en flux, nécessitent des échantillons fixes ou ne fournissent que des informations sur les paramètres 21,22,23, ne parvenant pas à saisir le processus dynamique de la perturbation lysosomale, en particulier dans le contexte de la progression rapide de la nécroptose. En revanche, la méthode d’imagerie de cellules vivantes permet une visualisation haute résolution et en temps réel de la LMP pendant la nécroptose. Dans ce protocole, nous avons combiné deux marqueurs lysosomales complémentaires et induit une nécroptose dans les cellules HT-29 pour analyser l’intégrité de la membrane lysosomale en temps réel19. Cette technique fournit une plate-forme robuste et adaptable pour étudier la LMP non seulement dans la nécroptose, mais aussi potentiellement dans d’autres formes de stress cellulaire où l’intégrité lysosomale est compromise, en particulier dans le contexte de maladies ou de l’utilisation de thérapies ciblant les lysosomes 24,25,26.

Protocole

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1. Culture cellulaire - jour 0

  1. Plaquez 5 000 cellules dans 2 mL de DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) complété par 10 % de sérum de veau fœtal (FBS) et 1 % de pénicilline et de streptomycine (P/S) dans une boîte stérile à fond de verre.
  2. Incuber les cellules à 37 °C avec 5 % de CO2 pendant la nuit.

2. Chargement des billes de dextran - jour 1

  1. Diluer les billes vertes de dextran à 25 μg/mL dans du DMEM frais complété par 10 % de FBS et 1 % de P/S en ajoutant 20 μL de la solution mère à 2,5 mg/mL.
  2. Retirez l’ancien milieu et remplacez-le par 2 ml de DMEM contenant des billes complétés par 10 % de FBS et 1 % de P/S.
  3. Incuber la cellule pendant 24 h à 37 °C avec 5 % de CO2 pour permettre l’internalisation des billes dans les lysosomes.

3. Coloration au Lysotracker - jour 2 (jour d’expérience)

  1. Préparez le milieu de coloration en ajoutant 2 μL de 1 mM de solution mère de Lysotracker à 2 mL de DMEM frais complété par 10 % de FBS et 1 % de P/S pour obtenir une concentration finale de 1 μM. Remplacez l’ancien milieu par cette solution de coloration.
  2. Incuber à 37 °C avec 5 % de CO2 pendant 2 h, en suivant le temps d’incubation recommandé (30 min à 2 h) fourni dans les Directives d’utilisation des sondes moléculaires de Life Technologies27. Dans nos expériences, 2 h d’incubation dans des cellules HT-29 ont entraîné une coloration ponctuée robuste avec une forte colocalisation avec des billes de dextran, indiquant une fluorescence stable du colorant.
    REMARQUE : Allumez le microscope confocal 30 min avant l’imagerie de cellules vivantes.

4. Configuration du microscope confocal

  1. Allumez les composants du système confocal dans l’ordre suivant : microscope PC ; puissance du scanner ; puissance laser ; émission laser ; Puissance Leica.
  2. Activez les commandes environnementales : Le Cube - contrôleur de température ; Le contrôleur de mélangeur de gaz Brick - CO2 . Ouvrez l’alimentation en CO2 et O2 .
  3. Définir les paramètres de gaz :
    1. Réglez le régulateur de température (le cube) sur 37 °C.
    2. Réglez le contrôleur de gaz et d’humidité (la brique) à 5 % de CO2 et 95 % d’humidité.
  4. Assemblez la chambre d’imagerie comme illustré à la Figure 1.
  5. Mettre en place l’objectif confocal :
    1. Utilisez un objectif à immersion dans l’huile 63x/1.40 NA.
    2. Réglez les lasers d’excitation sur 488 nm (fluorophore vert) et 555 nm (fluorophore rouge).
    3. Pour le laser 488 nm, sélectionnez un détecteur hybride (HyD), et pour le laser 555 nm, sélectionnez un détecteur PMT.
      REMARQUE : La diaphonie de fluorescence a été minimisée en utilisant des portes prédéfinies dans le logiciel confocal, ce qui a confirmé l’absence de diaphonie entre les canaux.

5. Préparation post-coloration (après l’incubation du LysoTracker)

  1. Lavez soigneusement les cellules trois fois avec 2 ml de PBS.
  2. Ajouter 2 ml de DMEM frais complété par 10 % de FBS et 1 % de P/S.
  3. Appliquez une goutte d’huile d’immersion sur l’objectif avant l’imagerie.
  4. Montez la parabole sur la platine du microscope.
  5. Ajustez l’intensité et l’arrière-plan du laser.
    1. Réglez l’intensité du laser jusqu’à 3 %, mais pas plus de 5 %.
    2. Ajustez le gain du détecteur dans le logiciel du microscope pour optimiser le signal.
    3. Pour réduire l’arrière-plan, ajustez la barre de contraste.
  6. Acquérir des images de référence des cellules non traitées (avant l’ajout de T/S/Z), qui servent de condition de contrôle.
  7. Remettez la plaque dans la hotte à flux laminaire et ajoutez 1 mL de DMEM complété par 10 % de FBS et 1 % de P/S, contenant 100 ng/mL de TNF-α (T), 500 nM de SMAC mimétique (S) et 100 μM de Z-VAD-FMK (Z).
  8. Poursuivez l’imagerie sur le microscope confocal.
    REMARQUE : Les T/S/Z ont été ajoutés intentionnellement à des concentrations plus élevées que les protocoles standard. Ce choix a été fait pour accélérer la LMP et la mort cellulaire, permettant de capturer les événements précoces de manière plus fiable en imagerie en temps réel.

6. Paramètres d’acquisition d’images

  1. Dans le logiciel d’acquisition, définissez les paramètres comme suit : mode : xyt ; format : 512 x 512 ; vitesse : 400 ; zoom : 3 ; moyenne linéaire : 1 ; accumulation de lignes : 3 ; accumulation du cadre : 1 ; intervalle de temps : 3 min ; durée : 8 h ; Activez l’autofocus.
  2. Cliquez sur Démarrer pour commencer l’acquisition en accéléré.

Résultats

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Les procédures décrites dans ce protocole permettent l’acquisition d’images de cellules vivantes à l’aide de la microscopie confocale pour surveiller la PML en temps réel. La figure 1 illustre une représentation schématique du protocole expérimental, du placage des cellules à l’acquisition d’images. Le jour 0, 5 000 cellules HT-29 ont été mises en boîte et incubées pendant 24 h à 37 °C et 5 % de CO2. Après 24 h (jour 1), les cellules ont été incubées avec des billes de dextran marquées à la fluorescéine (25 μg/mL) pendant 24 h supplémentaires dans les mêmes conditions. Ces billes sont internalisées par l’endocytose et le trafic vers les lysosomes, où elles s’accumulent et apparaissent sous forme de ponctués brillants. Le jour 2 (jour de l’expérience), les cellules ont été traitées avec un colorant LysoTracker sensible au pH (1 μM) pendant 2 h à 37 °C et 5 % de CO2. LysoTracker concentre et présente une forte fluorescence dans les compartiments acides, tels que les endosomes tardifs et les lysosomes. Trente minutes avant l’imagerie, le système de microscope confocal a été mis sous tension et stabilisé, y compris les contrôleurs de température, de gaz et d’humidité, comme décrit à l’étape 4 du protocole. La chambre d’imagerie a été assemblée, comme le montre la figure 2. Les lasers de 488 nm (vert) et de 555 nm (rouge) ont été utilisés.

Après l’incubation avec LysoTracker, les cellules ont été soigneusement lavées trois fois avec du PBS, et 2 ml de DMEM frais complété par 10 % de FBS et 1 % de P/S ont été ajoutés. La plaque a été transférée au microscope et une goutte d’huile d’immersion a été appliquée sur l’objectif d’immersion dans l’huile 63x/1,40 NA. L’intensité du laser et les niveaux de bruit de fond ont ensuite été ajustés pour optimiser les conditions d’imagerie, comme décrit à l’étape 5.5. du Protocole. Nos premières images ont confirmé la présence de ponctués stables du Lysotracker et de dextran marqué à la fluorescéine, indiquant des lysosomes intacts (Figure 3). Les images de base ont été acquises avant T/S/Z et utilisées comme contrôle. Aucun véhicule n’a été utilisé.

Après avoir établi les paramètres initiaux d’imagerie et de microscopie, la plaque a été renvoyée dans la hotte à flux laminaire, et 1 mL de DMEM complété par 10 % de FBS et 1 % de P/S, contenant 100 ng/mL de TNF-α (T), 500 nM de SMAC mimétique (S) et 100 μM Z-VAD-FMK (Z) a été ajouté. L’imagerie s’est poursuivie sur le microscope confocal en utilisant le paramètre d’acquisition d’imagerie décrit à l’étape 6 du protocole. Comme le montre la figure 3, la vidéo supplémentaire S1 et la vidéo supplémentaire S2, la diminution progressive de la fluorescence de LysoTracker dans les cellules traitées T/S/Z a servi d’indicateur précoce de changement lysosomal. Cette perte a été suivie d’un efflux de dextran marqué à la fluorescéine des lysosomes dans le cytosol (décalage ponctué à diffus), indiquant une LMP. À 8 h, presque tout le signal du Lysotracker a disparu, cependant, de nombreuses cellules conservaient encore des points verts avec un signal vert cytosolique, suggérant que la perte du gradient de pH lysosomal précède la libération complète de LMP et de cargaison.

Figure 1
Figure 1 : Représentation schématique du protocole expérimental. (Créé en BioRender.com) Initialement, 5 000 cellules ont été plaquées (0 h) et incubées pendant 24 h ; après cela, des billes de dextran (25 μg/mL) ont été ajoutées et incubées pendant 24 heures supplémentaires. À 48 h, LysoTracker (1 μM) a été ajouté et incubé pendant 2 h. Les cellules ont été lavées trois fois avec du PBS (étape 1), suivies de l’ajout de 2 ml de DMEM frais complété par 10 % de FBS et 1 % de P/S (étape 2). Les paramètres de microscopie ont été ajustés (étape 3) et les cellules ont été traitées avec du TNF-α (T), un mimétique SMAC (S) et un inhibiteur de la pan-caspase Z-VAD-FMZ (Z) (étape 4), avant l’acquisition d’images de cellules vivantes (étape 5). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Schéma de la configuration de la chambre d’imagerie. (A) Le porte-échantillon, (B) la chambre d’incubation de gaz et (C) le couvercle supérieur. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Images représentatives des cellules HT29 avant et après le traitement T/S/Z. Les cellules ont été colorées avec des billes rouges Lysotracker et vertes Dextran et traitées avec du TNF-α (T), un mimétique SMAC (S) et un inhibiteur de la pan-caspase Z-VAD-FMZ (Z). Barre d’échelle : 10 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Film supplémentaire S1 : Time-lapse de cellules HT29 incubées avec des billes vertes de Dextran et traitées avec du T/S/Z. Les cellules ont été surveillées pendant plus de 6 heures pour évaluer la réponse cellulaire. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce film.

Film supplémentaire S2 : Time-lapse de cellules HT29 incubées avec LysoTracker red et traitées avec T/S/Z. Les cellules ont été surveillées pendant plus de 6 heures pour évaluer la réponse cellulaire. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce film.

Discussion

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Ce protocole a démontré que la combinaison de LysoTracker et de billes de dextran marquées à la fluorescéine permet une surveillance simultanée du pH lysosomal et de la libération de cargaison en temps réel. Les résultats représentatifs (Figure 3, Vidéo supplémentaire S1 et Vidéo supplémentaire S2) confirment que les cellules non traitées maintiennent un signal ponctuel stable pour les deux marqueurs. En revanche, le traitement T/S/Z indique une perte progressive de l’intensité du Lysotracker et un décalage du dextran du ponctué à la distribution cytosolique diffuse, compatible avec la LMP.

Une première étape essentielle de ce protocole consiste à sélectionner les cellules pour l’acquisition d’images. Nos données précédentes démontrent que le traitement T/S/Z provoque la mort d’environ 80 % des cellules HT-29 en 24 heures, les 20 % restants survivant19 heures. Comme LMP n’est pas présent au début de l’expérience, les cellules sont initialement sélectionnées en fonction de leur morphologie et de leur double signal positif pour les billes LysoTracker et Dextran. Bien que cette méthode ne puisse pas prédire quelles cellules spécifiques subiront une LMP, nous avons constamment observé qu’environ 60 % de la population surveillée finit par présenter une LMP pendant la période d’imagerie de 8 heures. Un autre défi découle de la nature inhérente de l’imagerie séquentielle. Une légère dérive de la position Z de la cellule, qui se produit lors de l’acquisition de l’image toutes les 3 minutes, empêche le suivi continu du même signal ponctuel pendant toute la durée de l’expérience. De plus, les cellules migrent et subissent des changements morphologiques en réponse au traitement T/S/Z28. Par conséquent, il est impossible de suivre la dynamique des lysosomes individuels tout au long de la période d’imagerie. Dans l’imagerie à long terme de cellules vivantes, la contribution potentielle de la phototoxicité en tant que médiateur de la mort cellulaire est une considération importante. L’excitation continue pendant des séances prolongées peut générer des espèces réactives de l’oxygène et altérer la viabilité cellulaire29, interférant potentiellement avec la véritable réponse nécroptotique. Pour minimiser cet effet, nous avons appliqué une faible puissance laser et des temps d’exposition courts. De plus, une concentration quintuple de T/S/Z a été administrée pour accélérer le processus de mort cellulaire. Cependant, nous ne pouvons pas entièrement exclure la contribution du stress induit par la lumière aux changements lysosomaux observés.

Un avantage important de ce protocole d’imagerie de cellules vivantes est sa capacité à surveiller les changements de pH lysosomaux et la LMP en temps réel, en capturant des événements dynamiques qui ne sont pas détectés par les analyses finales, telles que la MET, la cytométrie en flux et l’immunomarquage. Bien que la TEM offre un aperçu structurel à haute résolution, elle ne peut pas saisir la progression temporelle de la LMP. D’autres méthodes sur cellules vivantes, telles que les tests de relocalisation de l’orange acridine30 ou la formation de galectine-ponctuation31, sont également des outils précieux pour surveiller l’intégrité lysosomale, mais chacune présente des limites lorsqu’elle est utilisée isolément. Le dosage de l’orange acridine signale la redistribution du colorant des organites acides vers le cytosol, qui est influencée à la fois par les changements de pH lysosomal et la perméabilisation membranaire, et n’est donc pas directement corrélée avec la libération de cargaison. De même, la formation de galectine-ponctuation reflète l’exposition des glycanes luminaux au cytosol et marque ainsi les lésions de la membrane lysosomale31,32, mais elle ne fait pas de distinction entre la perméabilisation partielle et la rupture lysosomale complète.

La principale force de ce protocole réside dans la combinaison de LysoTracker et de billes de dextran, ce qui permet d’étudier simultanément l’acidification lysosomale et les fuites de cargaison. Cela fournit une lecture unique et double de la fonctionnalité lysosomale et de l’intégrité structurelle. L’évanouissement de LysoTracker agit comme un indicateur d’un changement de pH lysosomal, tandis que la libération de dextran signale directement la fuite physique du contenu lysosomal. En utilisant ces deux marqueurs ensemble, nous améliorons considérablement la détection de la PMT partielle et complète. Par conséquent, cette stratégie d’imagerie de cellules vivantes est largement applicable. Les chercheurs peuvent l’adapter pour l’utiliser avec d’autres types de cellules et différentes sondes fluorescentes afin d’étudier l’intégrité lysosomale dans diverses conditions expérimentales, y compris des perturbations pharmacologiques ou génétiques. Cette capacité est essentielle pour faire progresser notre compréhension des mécanismes de nécroptose et identifier les interventions thérapeutiques potentielles.

Déclarations de divulgation

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Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

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Les recherches dans le laboratoire du Dr Zhigao Wang sont financées par des subventions des NIH R35GM158455 et R01GM147474.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Cellules HT-29ATCCHTB-38Cellules du cancer du côlon
Plat à fond en verre de 35 mmMatTek CorporationP35G-1.5-14-C-GRD
Incubateur à CO2PHCBIMCO-170AICUVL
Confocal MicroscopeLeicaSP8WLL
Billes vertes de DextranThermoFisherD1820Dextran, fluorescéine, 10 000 MW, anionique, lysine réparable
Eagle Medium Modifié (DMEM) de DulbeccoCorning  ;10-013-CV
Sérum fœtal bovin (FBS)Cytiva  ;SH30910.03
LysoTracker Rouge DND-99InvitrogenL7528
Immersion à l’huile de type HFSciences de la microscopie électronique16915-01
Pénicilline et Streptomycine (P/S) & nbsp ;Sigma-AldrichP4333
Solution physiologique tamponnée au phosphate (PBS)Corning21-040-CV
Smac mimétique (S)BV6, ApexBio, CatalogueB4653Concentration finale, 1 mM
The Brick  ;Services d’imagerie de la vie13685Contrôleur de CO2 à mélangeur de gaz
Le CubeServices d’imagerie de la vieCBO2AMicroscopes à chambre de contrôle de température
Facteur de nécrose tumorale alpha (TNF-& alpha - T)Peprotech30001A100UGConcentration finale, 20 ng/ml
z-VAD-FMK (Z)ApexBioA1902Concentration finale, 20 mM

Références

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  1. Shan, B., Pan, H., Najafov, A., Yuan, J. Necroptosis in development and diseases. Genes Dev. 32, 327-340 (2018).
  2. Kang, K., Park, C., Chan, F. K. Necroptosis at a glance. J Cell Sci. 135 (17), jcs260091(2022).
  3. Ai, Y., Meng, Y., Yan, B., Zhou, Q., Wang, X. The biochemical pathways of apoptotic, necroptotic, pyroptotic, and ferroptotic cell death. Mol Cell. 84, 170-179 (2024).
  4. Zhang, D. W., et al. RIP3, an energy metabolism regulator that switches TNF-induced cell death from apoptosis to necrosis. Science. 325, 332-336 (2009).
  5. He, S., et al. Receptor interacting protein kinase-3 determines cellular necrotic response to TNF-α. Cell. 137 (6), 1100-1111 (2009).
  6. Cho, Y. S., et al. Phosphorylation-driven assembly of the RIP1-RIP3 complex regulates programmed necrosis and virus-induced inflammation. Cell. 137 (6), 1112-1123 (2009).
  7. Sun, L., et al. Mixed lineage kinase domain-like protein mediates necrosis signaling downstream of RIP3 kinase. Cell. 148, 213-227 (2012).
  8. Zhao, J., et al. Mixed lineage kinase domain-like is a key receptor interacting protein 3 downstream component of TNF-induced necrosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (14), 5322-5327 (2012).
  9. Chen, X., et al. Translocation of mixed lineage kinase domain-like protein to plasma membrane leads to necrotic cell death. Cell Res. 24 (1), 105-121 (2014).
  10. Cai, Z., et al. Plasma membrane translocation of trimerized MLKL protein is required for TNF-induced necroptosis. Nat Cell Biol. 16, 55-65 (2014).
  11. Liu, S., et al. MLKL forms disulfide bond-dependent amyloid-like polymers to induce necroptosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 114, E7450-E7459 (2017).
  12. Lawrence, R. E., Zoncu, R. The lysosome as a cellular centre for signalling, metabolism and quality control. Nat Cell Biol. 21, 133-142 (2019).
  13. Ballabio, A., Bonifacino, J. S. Lysosomes as dynamic regulators of cell and organismal homeostasis. Nat Rev Mol Cell Biol. 21, 101-118 (2020).
  14. Aits, S., Jaattela, M. Lysosomal cell death at a glance. J Cell Sci. 126, 1905-1912 (2013).
  15. Repnik, U., Hafner Cesen, M., Turk, B. Lysosomal membrane permeabilization in cell death: concepts and challenges. Mitochondrion. 19 (Pt A), 49-57 (2014).
  16. Alu, A., et al. The role of lysosome in regulated necrosis. Acta Pharm Sin B. 10 (10), 1880-1903 (2020).
  17. Werneburg, N. W., Guicciardi, M. E., Bronk, S. F., Gores, G. J. Tumor necrosis factor-α-associated lysosomal permeabilization is cathepsin B dependent. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 283, G947-G956 (2002).
  18. Vanden Berghe, T., et al. Necroptosis, necrosis and secondary necrosis converge on similar cellular disintegration features. Cell Death Differ. 17, 922-930 (2010).
  19. Liu, S., et al. MLKL polymerization-induced lysosomal membrane permeabilization promotes necroptosis. Cell Death Differ. 31, 40-52 (2024).
  20. Guicciardi, M. E., Miyoshi, H., Bronk, S. F., Gores, G. J. Cathepsin B knockout mice are resistant to tumor necrosis factor-α-mediated hepatocyte apoptosis and liver injury: implications for therapeutic applications. Am J Pathol. 159, 2045-2054 (2001).
  21. Aits, S., Jaattela, M., Nylandsted, J. Methods for the quantification of lysosomal membrane permeabilization: a hallmark of lysosomal cell death. Methods Cell Biol. 126, 261-285 (2015).
  22. Barral, D. C., et al. Current methods to analyze lysosome morphology, positioning, motility and function. Traffic. 23, 238-269 (2022).
  23. Huang, K., Jiang, X., Du, J., Zeng, H. Protocol for detecting lysosome quantity and membrane permeability in acute myeloid leukemia cell lines. STAR Protoc. 5, 103309(2024).
  24. Ferrari, V., et al. Lysosome quality control in health and neurodegenerative diseases. Cell Mol Biol Lett. 29, 116(2024).
  25. Otoda, T., Aihara, K. I., Takayama, T. Lysosomal stress in cardiovascular diseases: therapeutic potential of cardiovascular drugs and future directions. Biomedicines. 13, (2025).
  26. Cao, M., Luo, X., Wu, K., He, X. Targeting lysosomes in human disease: from basic research to clinical applications. Signal Transduct Target Ther. 6, 379(2021).
  27. Fisher, T. LysoTracker and LysoSensor probes. Thermo Fisher Scientific. , https://documents.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/mp07525.pdf (2013).
  28. Wang, Z., Jiang, H., Chen, S., Du, F., Wang, X. The mitochondrial phosphatase PGAM5 functions at the convergence point of multiple necrotic death pathways. Cell. 148 (1-2), 228-243 (2012).
  29. Kiepas, A., Voorand, E., Mubaid, F., Siegel, P. M., Brown, C. M. Optimizing live-cell fluorescence imaging conditions to minimize phototoxicity. J Cell Sci. 133 (4), jcs242834(2020).
  30. Eriksson, I., Vainikka, L., Persson, H. L., Ollinger, K. Real-time monitoring of lysosomal membrane permeabilization using acridine orange. Methods Protoc. 6 (4), 72(2023).
  31. Aits, S., et al. Sensitive detection of lysosomal membrane permeabilization by lysosomal galectin puncta assay. Autophagy. 11, 1408-1424 (2015).
  32. Hoyer, M. J., Swarup, S., Harper, J. W. Mechanisms controlling selective elimination of damaged lysosomes. Curr Opin Physiol. 29, 100590(2022).

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M canismes de la n croptosedysfonctionnement lysosomalsondes fluorescentescolorants LysoTrackerbilles de dextranemicroscopie confocaleimagerie time lapseinduction de la mort cellulaire

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