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Article de méthode

Approches expérimentales pour l’analyse biochimique de la protéine acide fibrillaire gliale et de ses variantes associées à la maladie

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DOI :

10.3791/69523

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28 novembre 2025

 , 
1Institute of Molecular Medicine, College of Life Sciences and Medicine, National Tsing Hua University

Dans cet article

Résumé

Cette étude présente des méthodes expérimentales pour caractériser biochimiquement le GFAP et ses mutations pathogènes, en se concentrant sur l’assemblage, l’agrégation et la modification post-traductionnelle des filaments. Des protéines GFAP de haute pureté ont été analysées, révélant des informations sur les mécanismes de la maladie d’Alexander qui pourraient fournir un cadre pour étudier les cibles thérapeutiques potentielles et comprendre les mutations GFAP et les troubles associés.

Résumé

La protéine acide gliale fibrillaire (GFAP) est une protéine intermédiaire clé du filament, essentielle pour maintenir l’intégrité structurelle et la fonction des astrocytes dans le système nerveux central. Les mutations du GFAP sont la cause principale de la maladie d’Alexander (AxD), un trouble neurodégénératif rare et souvent fatal, caractérisé par une élévation des niveaux de GFAP et une accumulation de GFAP sous forme de fibres de Rosenthal. Nous présentons ici un ensemble complet d’approches expérimentales pour la caractérisation biochimique du GFAP et de ses variants responsables de la maladie. Grâce à une expression optimisée et des techniques avancées de purification, nous avons obtenu des rendements et une pureté élevés des protéines GFAP de type sauvage et mutantes. Des analyses biochimiques ont été utilisées pour évaluer les effets des mutations pathogènes sur l’assemblage, la solubilité et l’agrégation des filaments. Nous avons également exploré le rôle des modifications post-translationnelles aberrantes dans l’agrégation GFAP et leur impact sur les propriétés des filaments. Ce travail fait progresser notre compréhension du rôle du GFAP dans l’AxD et pose les bases du développement de stratégies thérapeutiques ciblant le dysfonctionnement du GFAP. De plus, les méthodologies présentées ici constituent des outils précieux pour étudier les conséquences biochimiques des mutations GFAP et faire progresser les interventions pour les troubles liés à la GFAP.

Introduction

La maladie d’Alexander (AxD) est un trouble génétique résultant de mutations dominantes dans le gène qui code pour la protéine acide fibrillaire gliale (GFAP)1, une protéine intermédiaire filament (FI) de type III que l’on trouve principalement dans les astrocytes matures. L’AxD se caractérise par la régulation à la haussede GFAP 2, une astroglioseréactive 3, et l’accumulation de fibres de Rosenthal, qui sont des inclusions protéiques composées principalement de GFAP ainsi que de protéines associées telles que la αB-cristalline4 et l’ubiquitine5. Les mutations du gène GFAP perturbent l’assemblage normal dufilament 6, entraînant une agrégation anormale, l’induction de réponses au stresscellulaire 7, et une déstabilisation supplémentaire par des modifications post-traductionnelles aberrantes (PTM) telles que la phosphorylation8,l’oxydation 9 et l’ubiquitination10.

Malgré le rôle central de la GFAP dans la pathologie de l’AxD, les mécanismes moléculaires par lesquels la GFAP mutante perturbe l’assemblage des filaments, favorise l’agrégation et induit le stress cellulaire restent peu compris. Cette lacune de connaissances freine le développement de thérapies ciblées pour traiter l’agrégation et la toxicité des GFAP. L’étude des propriétés biochimiques du GFAP et de ses variantes associées à l’AxD est cruciale pour découvrir les mécanismes moléculaires sous-jacents à la progression de la maladie. Cependant, la propriété sujette à l’agrégation de la GFAP et son comportement d’assemblage modifié dans les variantes associées à la maladie présentent des défis uniques pour l’analyse expérimentale. Les études biochimiques contrôlées nécessitent un GFAP purifié, obtenu soit à partir de modèles animaux, soit par expression recombinante, afin d’étudier les effets des mutations d’AxD sur l’assemblage, l’agrégation et les modifications pathologiques des filaments.

Les approches expérimentales présentées dans cette étude offrent plusieurs avantages par rapport aux techniques alternatives. Par exemple, bien que les modèlescellulaires 11 et les études immunohistochimiques12 fournissent des informations précieuses sur l’expression et la localisation du GFAP, ils ne parviennent souvent pas à capturer les mécanismes biochimiques précis de l’assemblage et de l’agrégation des filaments en raison de la complexité des environnements cellulaires. En revanche, les méthodes décrites ici, telles que les tests d’assemblage de filaments in vitro , les analyses de sédimentation et la caractérisation des PTM, permettent une investigation contrôlée des propriétés biochimiques intrinsèques du GFAP et de ses variantes associées à la maladie. Ces approches permettent aux chercheurs de disséquer le comportement d’assemblage et d’agrégation des filaments dans un système simplifié, facilitant l’identification des mécanismes moléculaires sous-jacents à la dysfonction GFAP. Des études antérieures ont démontré l’utilité de telles techniques biochimiques pour analyser les protéines du FI, notamment le desmin13 et lakératine 14, soulignant leur applicabilité à la recherche sur le GFAP.

De plus, ce manuscrit fournit des informations pour aider les lecteurs à déterminer si les méthodes décrites sont appropriées à leurs applications spécifiques. Les chercheurs intéressés par l’étude des propriétés biochimiques du GFAP, de son comportement d’assemblage, ou PTM, trouveront ces techniques particulièrement utiles pour étudier les variantes associées à la maladie et leurs effets pathologiques. En intégrant ces approches biochimiques avec d’autres systèmes expérimentaux, tels que des études cellulaires ou des modèles animaux, les chercheurs peuvent obtenir une compréhension plus complète du dysfonctionnement du GFAP dans l’astrocytopathie AxD et autres similarités.

L’objectif global de cette méthode est de présenter des approches expérimentales pour l’analyse biochimique du GFAP et de ses variantes associées à l’AxD, incluant les techniques de purification des protéines, les tests d’assemblage in vitro des filaments, les analyses de sédimentation et la caractérisation des PTM. Ces méthodes fournissent des éclairages essentiels sur la base moléculaire du dysfonctionnement du GFAP chez AxD, ouvrant la voie au développement thérapeutique. De plus, l’application de ces techniques expérimentales fera progresser notre compréhension de la biochimie GFAP dans l’AxD et contribuera au champ plus large de la recherche sur le FI.

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Protocole

Les animaux utilisés dans cette étude sont des rats modèles AxD avec la mutation dedéclenchement R237H 11. Toutes les expériences animales ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux du Collège des sciences de la vie et de médecine de l’Université nationale Tsing Hua (Approbation IACUC n° 109088 et 111060 de la NTHU) et conformément aux directives du Guide agricole pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire.

1. Purification du GFAP recombinant à partir de bactéries (Figure 1)

  1. Transformer la souche pLysS BL21(DE3) d’E. coli avec un vecteur pET 23b contenant de l’ADN cF soit de WT soit de GFAP mutant.
  2. Cultiver des bactéries dans 1 L de milieu Luria-Bertani complété avec 100 μg/mL d’ampicilline et 34 μg/mL de chloroamphénicol à 37 °C à 600 OD de ~0,2.
  3. Ajouter de l’isopropyle β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG, 0,5 M) à une concentration finale de 0,5 mM pour induire une expression de GFAP à 37 °C pendant 4 heures.
  4. Prélever les bactéries par centrifugation à 6 371x g pendant 30 minutes à 4 °C.
  5. Lyse bactérien dans 50 mL de tampon TEN (20 mM Tris-HCl, pH 8, 5 mM EDTA, 150 mM NaCl) complétée avec 0,2 mM phnénylméthansulfonylfluorure (PMSF) par homogénéisation dans un homogénéisateur Dounce.
  6. Centrifugez les lyses bactériennes à 22 045x g pendant 20 minutes à 4 °C, puis extrayez le pellet dans le tampon Triton X-100 (DIX avec 1 % (v/v) Triton X-100).
  7. Après centrifugation dans les mêmes conditions, extraire la pastille résultante dans le tampon à haute teneur en sel (TEN avec 1 % (v/v) de Triton X-100 et 1,5 M KCl).
  8. Après centrifugation dans les mêmes conditions, lavez la pastille avec un tampon TEN.
  9. Dissoudez le dernier pellet dans 10 mL de tampon d’urée (8 M urée, 20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 5 mM EDTA et 0,2 mM PMSF) en remuant pendant 3 h à température ambiante.
  10. Extraits d’urée centrifugeuse à 80 000x g dans une ultracentrifugeuse de table à 4 °C pendant 20 minutes.
  11. Ajoutez la polyéthyléneimine (1 % (v/v)) à la fraction soluble en urée jusqu’à une concentration finale de 0,06 % (v/v) et faites couver sur glace pendant 5 minutes.
  12. Centrifugez à 80 000g à 4 °C pendant 20 minutes, puis dialysez la fraction surnageante contre le tampon A (6 M urée, 20 mM MES, pH 6,0, 14,4 mM β-mercaptoéthanol).
  13. La charge dialyse sur une colonne d’échange d’ions CM-Sepharose pré-équilibrée dans le tampon A dans un système de chromatographie NGC.
  14. Protéines élutes avec un gradient linéaire de 0 à 0,5 M de NaCl dans le tampon A sur 1 h à un débit de 1 mL/min.
  15. Poolez les fractions contenant du GFAP et dialysez contre le tampon B (6 M urée, 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) et 1 mM EDTA).
  16. La charge dialyse sur une colonne d’échange d’anions pré-équilibrée dans le tampon B. Les protéines élutent avec un gradient linéaire de 0-0,5 M NaCl dans le tampon B sur 1 h à un débit de 1 mL/min.
  17. Analysez les fractions de colonnes par coloration SDS-PAGE et bleu Coomassie. Collectez celles contenant du GFAP purifié et conservez-les à -80 °C.
    REMARQUE : La lyse bactérienne peut être facilitée par plusieurs cycles de congélation et de décongélation. La concentration finale de polyéthyléneimine ne doit pas dépasser 0,06 % (v/v), au-delà de laquelle les protéines précipitent également. Lorsqu’on travaille avec des matériaux dangereux comme le PMSF et le β-mercaptoéthanol, il est essentiel d’inclure des directives claires de sécurité et des instructions pour l’élimination des déchets dangereux. Le PMSF est hautement toxique et peut provoquer des irritations de la peau, des yeux et des voies respiratoires. Préparez les solutions PMSF fraîchement dans une hotte à fumée et évitez le contact direct. Utilisez β-mercaptoéthanol dans un endroit bien ventilé car il émet de fortes vapeurs toxiques.

2. Assemblage in vitro et dosage de sédimentation (Figure 2)

  1. Diluer le WT purifié ou GFAP mutant à 0,3 mg/mL dans 6 M d’urée dans un tampon pauvre en sel (10 mM Tris-HCl, pH 8, 1 mM EDTA et 14,4 mM β-mercapéthanol).
  2. Dialyser les échantillons contre le tampon pauvre en sel contenant 4 M puis 2 M d’urée pendant 4 heures à température ambiante.
  3. Dialyser les échantillons contre le tampon pauvre en sel sans urée pendant la nuit à 4 °C.
  4. Dialyser les échantillons contre le tampon d’assemblage (10 mM Tris-HCl, pH 7, 50 mM NaCl et 14,4 mM β-mercapéthanol) à température ambiante pendant 12 à 16 h.
  5. Transférez les mélanges d’assemblage sur le dessus d’un coussin de saccharose contenant 0,2 mL de saccharose 0,85 M dans le tampon d’assemblage.
  6. Dans le test de sédimentation à grande vitesse, centrifugez les mélanges à 80 000x g pendant 20 minutes à 20 °C à l’aide d’une micro-ultracentrifugeuse de table.
  7. Concentrez le GFAP non assemblé dans la fraction surnageante en effectuant des précipitations méthanol/chloroforme 15. Le précipite de résuspension dans 0,2 mL de tampon d’échantillon de Laemmli (25 mM de Tris-HCl (pH 6,8), 1 % (p/v) de dodécyl sulfate (SDS), 12,5 % (v/v) de glycérol, 0,01 % (v/v) de bleu de bromophénol et 355 mM de β-mercaptoéthanol).
  8. Resuspendez le GFAP assemblé dans la fraction de pellets dans le tampon d’échantillon de Laemmli.
  9. Faites appliquer à la fois des fractions de surnageant et de pellets sur un gel d’électrophorèse en gel de polyacrylamide SDS à 10 % (p/v) et colorez avec 10 mL de bleu Coomassie.
  10. Dans le test de sédimentation à basse vitesse, les mélanges d’assemblage de centrifugeuses à 3 000x g pendant 5 minutes à 20 °C à l’aide d’une centrifugeuse de paillasson.
  11. Ajoutez 0,2 mL de tampon d’échantillon de Laemmli aux formes non agrégées de GFAP dans la fraction surnageante.
  12. Resuspendez le GFAP agrégé directement dans la fraction de pellets dans le tampon d’échantillon de Laemmli, dans un volume proportionnel à la fraction surnageante.
  13. Analysez à la fois les fractions de surnageant et de pellets par gel SDS-PAGE à 10 % (v/v), suivies d’une coloration bleue de Coomassie.
    REMARQUE : Le méthanol et le chloroforme sont des solvants toxiques et peuvent entraîner de graves effets sur la santé. Évitez le contact cutané et l’inhalation. Manipulez avec précaution dans une hotte à fumée pour éviter les déversements.

3. Coloration négative et microscopie électronique (Figure 2)

  1. Évacuez par glow les grilles en cuivre Formvar/revêtues de carbone pendant 45 s à 20 mA dans un système de nettoyage par décharge glow.
  2. Livrez les mélanges d’assemblage à la grille déchargée par phosphorescence et laissez les échantillons se lier au film de support pendant 60 s.
  3. Éliminez l’excès de liquide en absorbant le bord de la grille avec une feuille de papier buvant.
  4. Lavez les grilles à l’eau distillée, puis colorez avec 20 μL d’acétate d’uranyle à 1 % (p/v) pendant 60 secondes.
  5. Retirez l’excès de solution de teinture et laissez la grille sécher à l’air pendant 30 secondes.
  6. Examinez les grilles sous un microscope électronique à transmission (TEM) H-7600 en mode haute résolution à une tension d’accélération de 100 kV.
    REMARQUE : Décharger les grilles sous phosphore dans un évaporateur sous vide avant d’ajouter l’échantillon de protéine améliore l’adsorption de l’échantillon à la grille. L’acétate d’uranyle est un produit chimique radioactif et hautement toxique couramment utilisé en microscopie électronique pour la coloration négative. La manipulation nécessite le respect strict des protocoles de sécurité et des instructions sur l’élimination des déchets dangereux afin de minimiser les risques d’exposition pour le personnel et l’environnement. Préparez des solutions d’acétate d’uranyle uniquement dans une hotte à fumée pour éviter l’inhalation de particules ou de vapeurs en suspension dans l’air.

4. Modification oxydative (Figure 3)

  1. Diluez le GFAP à 0,3 mg/mL dans 6 M d’urée dans un tampon faible en sel (10 mM de Tris-HCl, pH 8, 1 mM d’EDTA et 14,4 mM de β-mercapéthanol) à température ambiante pendant 2 h.
  2. Dialyser contre le tampon faible en sel contenant 4 M d’urée pendant 2,5 h à température ambiante. Remuez doucement le tampon à l’aide d’un agitateur magnétique pour maintenir une distribution uniforme et éviter les gradients de concentration.
  3. Après 2,5 h, transférez la membrane de dialyse dans le tampon pauvre en sel contenant 2 M urea pendant encore 2,5 h à température ambiante, en assurant un remuage doux tout au long du processus.
  4. Dialyser contre le tampon faible en sel sans urée à 4 °C pendant 18 h.
  5. Traiter les échantillons dialysés avec 10 mMH 2O2 pendant 15 minutes, suivi d’un traitement avec 10 ou 100 mM de dithiothréitol (DTT) pendant 15 minutes supplémentaires à température ambiante.
  6. Analysez les échantillons de protéines par SDS-PAGE standard à 10 % (v) sans β-mercapéthanol et colorez avec 10 mL de bleu Coomassie.
    REMARQUE : Lorsque vous utilisez duH2O2, manipulez avec prudence car c’est un agent oxydant puissant et peut provoquer des brûlures. Portez un équipement de protection individuelle pour éviter tout contact avec la peau et les yeux. La DTT peut provoquer des irritations de la peau, des yeux et du système respiratoire. Lorsqu’on travaille avec la TDT etH2O2, il est essentiel de suivre des protocoles de sécurité appropriés pour minimiser les risques.

5. Purification du GFAP à partir du cerveau des rats AxD (Figure 4A,B)

  1. Extraire les tissus cérébraux avec 10 mL de tampon TEN (10 mM Tris-HCl, pH 7,4, 100 mM NaCl et 5 mM EDTA) à l’aide d’un homogénéiseur Douce.
  2. Centrifugez le cerveau homogénéisé à 76 000g x g à 4 °C pendant 20 minutes, puis extrayez la pellete résultante avec 10 mL de tampon Triton X-100 (1 % (v/v) Triton X-100 dans un tampon TEN).
  3. Centrifugez à 76 000x g à 4 °C pendant 20 minutes, puis extrayez la pellete résultante avec 10 mL de tampon de saccharose (0,85 M de saccharose et 0,5 % (v/v) de Triton X-100 dans un tampon TEN).
  4. Centrifugez à 76 000x g à 4 °C pendant 20 minutes, puis extrayez la pellete résultante avec 10 mL de tampon à haute teneur en sel (1,5 M KCl et 0,5 % (v/v) de Triton X-100 dans un tampon TEN).
  5. Centrifugez à 76 000g à 4 °C pendant 20 minutes, puis extrayez le dernier pellet avec 10 mL de tampon d’urée (8 M urée, 10 mM Tris-HCl, pH 7,4 et 5 mM EDTA).
  6. Collectez la fraction surnageante et dialysez contre le tampon de la colonne Q (6 M urée, 10 mM Tris-HCl, pH 8, 5 mM EDTA et 14,4 mM β-mercaptoéthanol).
  7. Chargez les dialysats sur une colonne d’échange d’anions dans un système de chromatographie NGC.
  8. Éluez la protéine liée avec un gradient linéaire de 0-0,5 M de NaCl dans un tampon Q à un débit de 1 mL/min.
  9. Poolez la fraction contenant GFAP et dialysez contre le tampon de la colonne S (6 M urée, 20 mM MES, pH 6 et 14,4 mM β-mercaptoéthanol).
  10. Appliquez des dialysats à une colonne d’échange cationique, puis éluez les protéines liées avec un gradient linéaire de 0-1 M NaCl dans un tampon S à un débit de 1 mL/min.
  11. Analysez les fractions élues par SDS-PAGE et coloration bleue de Coomassie, et collectez celles contenant du GFAP purifié.

6. Analyse de l’ubiquitination du GFAP par immunoblotting (Figure 4C)

  1. Utilisez un GFAP purifié sur un gel SDS-PAGE à 10 % (avec v).
  2. Transférez les protéines du gel vers une membrane de nitrocellulose.
  3. Bloquez la membrane en l’incubant avec 10 mL d’albumine sérique bovine à 3 % (p/v) dans une solution saline tamponnée à Tris (TBS : 20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl) contenant 0,1 % (v/v) Tween 20 (TBST) pendant 1 h à température ambiante.
  4. Incubez la membrane avec 5 μL d’anti-GFAP et 5 μL d’anticorps primaires anti-ubiquitine dilués dans 5 mL de TBST à 4 °C pendant la nuit. Lavez la membrane trois fois avec du TBST.
  5. Incubez la membrane avec 5 μL d’anticorps secondaires conjugués avec des colorants fluorescents, dilués dans 5 mL de TBST, à température ambiante pendant au moins 1 h. Lavez la membrane trois fois avec du TBST.
  6. Acquérez des images à l’aide d’un système de détection d’images fluorescent.
  7. Analysez l’assemblage in vitro de GFAP natif par tests TEM et de sédimentation (Figure 5) en utilisant la même procédure que décrite aux étapes 2.1 à 2.13 et 3.1 à 3.6.

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Résultats

Pour étudier comment les mutations responsables de l’AxD affectent les propriétés d’assemblage du GFAP, nous avons produit des protéines recombinantes chez des bactéries en utilisant un système d’expression basé sur le PET. Nous détaillons les protocoles pour exprimer et purifier GFAP, en prenant WT GFAP comme exemple. Après l’induction IPTG (Figure 1A, voie 2), le GFAP a été purifié par un processus en trois étapes impliquant la préparation du corps d’inclusion (Figure ...

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Discussion

Ce protocole établit un cadre expérimental complet pour la caractérisation biochimique du GFAP et de ses mutants associés à la maladie. En fournissant une approche fiable et standardisée, cette méthode est une ressource précieuse qui améliore notre compréhension des rôles biologiques du GFAP et de ses implications pathologiques, en particulier dans le contexte de l’AxD. Dans cette section, nous abordons plusieurs aspects critiques du protocole, notamment les modifications potentielles et...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Nous remercions le Dr Tracy Hagemann (Waisman Center, Université du Wisconsin-Madison) pour avoir fourni les rats de remplacement R237H. La suggestion et le soutien du Professeur Albee Messing (Waisman Center, Université du Wisconsin-Madison) pour cette étude sont grandement appréciés. Ce travail a été soutenu par des subventions du ministère des Sciences et de la Technologie (111-2320-B-007-008 et 112-2320-B-007-006 à N.-H. L. et M.-D.P.). Nous remercions également BioTEM de l’Université nationale Tsing Hua (MOST-104-2731-M-007-002) pour l’utilisation de l’équipement dans cette étude.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Solution acrylamide/Bis 30 % 37,5:1Biorad1610158
Persulfate d’ammonium (APS)Biorad1610700
AmpicillineUSB11259
Anticorps anti-GFAPTechnologie de signalisation cellulaire12389
Anticorps anti-ubiquitineMilliporeST 1200Clone FK2
Centrifugeuse Avanti J-26S XPBeckman
ChloroamphénicolUSB23660
CM-SephroseCytiva1707 1901
Colorant bleu CoomassieUSB32826
Grille en cuivreTed Pella01753-F
CS 150 NX Micro ultracentrfugeHitachiNA
Homogénéiseur de dounceWheaton
TDTURTDT
Souche pLysS d’E. coli BL21(DE3)Agilent
EasiGlowTed Pella
Réactif ECLPerkinElmerNEL 105001
EDTAUSB15699
H2O2Sigma-Aldrich18312
Colonne HiRes SCytiva2927 5877
Colonne Q HiTrapCytiva1711 5301
IPTGURIPTG
KClHoneywell12636
LB medium (LB Agar)USB75851
Médium LB (LB Broth)BD Difco244620
MercaptoéthanolSigma-AldrichM3148
MESSigma-AldrichM8250
NaClHoneywell31434S
Système de chromatographie NGCBioRad
Ultracentrifugeuse Optima XE-90Beckman
PMSFACROS ORGANICS215740050
PolyehtylénémineSigma-AldrichP3143
RotorBeckman
S55S RotorHitachi
S80AT3 RotorHitachi
SDSUSB75819
SDS-PAGEBiorad
StarBright Blue 520 anti-souris IgG  ;Biorad12005867
StarBright Blue 700 anti-lapin IgG  ;BioRad12004161
SaccharoseSigma-AldrichS5391
TEMEDUSB76320
Microscope électronique à transmission H-7700)HitachiNA
TrisUSB75825
Triton X-100Sigma-AldrichT9284
Acétate d’uranyleSciences du microscope électronique & nbsp ;22400
uréeHoneywell15604H

Références

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