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Article de recherche

Mécanisme de la décoction de Jianpi Shengxue dans l’atténuation de la myélosuppression induite par la cyclophosphamide chez la souris

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DOI :

10.3791/69542

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2 janvier 2026

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1Hunan University of Chinese Medicine, 2Department of Traditional Chinese Medicine /Integrative Oncology, Hunan Cancer Hospital/The Affiliated Cancer Hospital of Xiangya School of Medicine, Central South University

Dans cet article

Résumé

Ce protocole explique systématiquement comment la décoction de Jianpi Shengxue atténue la myélosuppression induite par la cyclophosphamide grâce à une approche intégrée de pharmacologie en réseau et d’expériences animales, révélant ses mécanismes multi-cibles et son potentiel en tant que thérapie adjuvante.

Résumé

L’article vise à étudier comment la décoction Jianpi Shengxue (JPSXD) soulage la myélosuppression induite par la chimiothérapie grâce à la pharmacologie en réseau et à des expériences animales. Pour ce faire, les composants clés et cibles ont été analysés, ainsi que le réseau d’interaction protéine-protéine (IPP) et des réseaux herbe-composant-cible ont été construits. Gene Ontology (GO) et l’enrichissement de l’Encyclopédie des gènes et génomes de Kyoto (KEGG) ont identifié les principales voies. Un modèle de myélosuppression induit par la cyclophosphamide (CTX) a été établi chez 60 souris C57/BL6. JPSXD a été administré à différentes doses pendant 7 jours. Les numérations sanguines périphériques, les cytokines (thrombopoïétine [TPO], érythropoïétine [EPO], facteur stimulant la colonie granulocyte-macrophage [GM-CSF]), l’indice du thymus, la morphologie de la moelle osseuse, les cellules CD34+, ainsi que l’expression d’AKT1, JAK2 et EGFR ont été évaluées. L’analyse réseau a identifié 172 composés et 454 cibles, mettant en évidence les voies PI3K-Akt et JAK-STAT. In vivo, CTX a réduit les niveaux de leucocytes et de protéines de signalisation, tandis que JPSXD a rétabli les comptages, augmenté les AKT1, JAK2 et EGFR, et amélioré l’indice thymus (p < 0,05). Des doses moyennes et élevées de JPSXD ont augmenté le TPO, L’EPO, GM-CSF, CD34+ et amélioré la moelle osseuse, la dose élevée ayant montré l’effet le plus fort. En conclusion, JPSXD soulage la myélosuppression grâce à une régulation multi-cibles et multi-voies, soutenant son potentiel comme thérapie complémentaire pour la leucopénie induite par chimiothérapie.

Introduction

La chimiothérapie est une pierre angulaire dans le traitement de diverses malignités, principalement en inhibant la prolifération des cellules cancéreuses etla survie 1,2, prolongeant ainsi la survie des patients. Cependant, en raison du manque de sélectivité dans le ciblage des tissus normaux, les médicaments chimiothérapies causent souvent de graves dommages aux cellules et tissus sains, entraînant une série d’effetsindésirables 3. L’un des effets secondaires les plus courants et graves de la chimiothérapie est la myélosuppression, caractérisée par une réduction de la production de globules blancs, y compris les globules blancs (globules blancs), les globules rouges (globules rouges) et les plaquettes (PLTs)2,4. La myélosuppression altère gravement le système de défense immunitaire, augmentant le risque d’infections, de saignements, d’anémie et d’autres complications. Cela diminue également considérablement la qualité de vie des patients et peut même êtremortel 5. Ainsi, soulager et prévenir la myélosuppression induite par la chimiothérapie est essentiel pour améliorer la tolérance des patients à la chimiothérapie et leur survie globale.

Les traitements cliniques actuels de la myélosuppression impliquent principalement des facteurs de croissance hématopoïétiques tels que le facteur stimulant la colonie de granulocytes [G-CSF], l’érythropoïétine [EPO]) et la thérapie partransfusion 6,7. Cependant, ces approches sont souvent associées à des coûts élevés, des effets secondaires potentiels et une efficacité limitée. Par conséquent, l’exploration de méthodes plus sûres et plus efficaces pour prévenir et soulager la myélosuppression reste un axe de recherche majeur. Ces dernières années, la médecine traditionnelle chinoise (MTC) a attiré une attention particulière pour son rôle dans le traitement du cancer et la gestion des effets secondaires induits par lachimiothérapie 8,9. De nombreuses formulations de MTC sont considérées comme ayant des effets tonifiants et régulateurs du système immunitaire, telles que ladécoction 10 de Shengxuebao, les comprimés 11 de DihuangShengbai et les composésde ginsénoside 12, qui protègent non seulement les cellules normales et réduisent les effets secondaires toxiques, mais améliorent également l’efficacité antitumorale.

La décoction Jianpi Shengxue (JPSXD) est une formule classique de la MTC qui illustre les principes thérapeutiques de tonifier le Qi et de nourrir lesang 13. Cette formule est une modification sophistiquée de la décoction Sijunzi combinée à Er Zhi Wan, intégrant les effets synergiques de plusieurs plantes pour traiter la carence en Qi eten sang 14. La formule comprend du ginseng (Ren Shen), de l’astragalus (Huang Qi), de l’épimedium (Yin Yang Huo), de l’atractylodes (Bai Zhu), de l’igname (Shan Yao), de la salvia (Dan Shen), de la rehmannia préparée (Shu Di Huang), de la graine de dodder (Tu Si Zi), de la baie de loup (Gou Qi Zi), du ligustrum (Nv Zhen Zi), de l’angélica (Dang Gui), de l’orge frite (Chao Mai Ya), du gésier au poulet frit (Chao Ji Nei Jin), écorce de mandarine séchée (Chen Pi), graines de coix (Yi Yi Ren) et plusieurs autres herbes aromatiques. Chaque herbe joue un rôle spécifique dans la formule, respectant le principe de la MTC des plantes souveraines, ministres, assistantes et guides, ce qui garantit un effet thérapeutique équilibré et ciblé.

La décoction Sijunzi, une formule fondamentale de la MTC, est reconnue pour sa capacité à tonifier le Qi et à renforcer la rate. Il a été largement utilisé pour traiter des affections associées au Qi et à la carence sanguine, telles que la fatigue, un manque d’appétit et une immunité affaiblie. Des études pharmacologiques modernes ont démontré que la décoction Sijunzi améliore la fonction immunitaire, favorise l’hématopoïèse et améliore les capacités d’auto-réparationde l’organisme 15,16. S’appuyant sur cette base, JPSXD intègre des plantes supplémentaires pour renforcer son efficacité dans la nutrition sanguine et traiter des carences plus complexes. Par exemple, la rehmannia préparée et l’angélique sont des herbes clés nourrissant le sang17, tandis que l’astrágale et le ginseng agissent en synergie pour augmenter le Qi et améliorer la vitalitéglobale 18.

Des études récentes ont mis en lumière les effets antitumoraux potentiels du JPSXD, suggérant que son approche multi-composantes et multi-cibles pourrait inhiber la croissance tumorale et renforcer l’efficacité des traitements conventionnels contrele cancer 19,20. La capacité de la formule à moduler les réponses immunitaires et à améliorer la fonction hématopoïétique la rend particulièrement précieuse pour soutenir les patients en chimiothérapie ou radiothérapie, qui souffrent souvent de carences en Qi et sanguine comme effets secondaires dutraitement 21. De plus, l’inclusion d’herbes comme la salvia et l’épimedium a démontré qu’elle améliore la microcirculation et améliore les mécanismes de réparation cellulaire, contribuant ainsi aux bienfaits thérapeutiques globauxde la formule 22.

Des études pharmacologiques modernes ont démontré que chaque plante individuelle du JPSXD possède des activités pharmacologiques liées à la fonction hématopoïétique, à l’anti-myélosuppression, à l’immunomodulation et à l’antioxydation, ainsi qu’à une amélioration microcirculatoire, fournissant un soutien indirect à la recherche pour l’utilisation du JPSXD dans l’atténuation de la myélosuppression induite par chimiothérapie. Le tableau 1 résume les principaux effets pharmacologiques de chaque plante ainsi que les références correspondantes, en se concentrant sur les études portant sur l’hématopoïèse, l’activité antimyélosuppressive, l’immunomodulation et les propriétés antioxydantes ou d’amélioration de la microcirculation. La synergie complexe des composants dans JPSXD implique à la fois des interactions coopératives et antagonistes entre les plantes, ciblant plusieurs voies pour obtenir un effet thérapeutique holistique. Par exemple, alors que le ginseng et l’astragale agissent ensemble pour tonifier le Qi, la salvia et la rehmannia préparée collaborent pour nourrir le sang et améliorer la circulation. En même temps, des herbes comme l’écorce de mandarine séchée et l’orge frite aident à réguler la digestion et à prévenir la stagnation, garantissant que les effets tonifiants de la formule sont efficacement absorbés et utilisés par le corps. Cette approche multifacette s’inscrit dans la philosophie de la MTC qui consiste à traiter la cause profonde de la maladie tout en traitant ses symptômes.

En conclusion, JPSXD est une formule de MTC bien équilibrée et scientifiquement étayée qui incarne les principes du Qi et de la détoxification sanguine. Ses applications potentielles pour renforcer l’immunité, promouvoir l’hématopoïèse et soutenir la thérapie antitumorale en font un ajout précieux tant aux pratiques médicales traditionnelles qu’aux pratiques modernes. Cependant, les preuves cliniques de haute qualité évaluant directement l’efficacité du JPSXD dans l’atténuation de la myélosuppression induite par la chimiothérapie restent insuffisantes. Des recherches supplémentaires sont nécessaires pour en élucider les mécanismes sous-jacents et optimiser ses stratégies d’application clinique. Par conséquent, cette étude vise à fournir une preuve de concept des effets thérapeutiques potentiels du JPSXD d’un point de vue mécaniste préclinique.

La pharmacologie de réseau, avec sa nature systémique et intégrative, a été largement utilisée pour identifier les ingrédients actifs des médicaments chinois et élucider leurs mécanismesd’action 24,25. Dans cette étude, la pharmacologie en réseau a été utilisée pour analyser les voies de signalisation potentielles et les cibles clés affectées par JPSXD dans le contexte de la myélosuppression. De plus, un modèle murin myélosuppresseur induit par la cyclophosphamide (CTX) a été mis en place pour évaluer les indicateurs pertinents et évaluer les effets du JPSXD sur la myélosuppression. Une validation préliminaire des cibles clés et des voies identifiées via la pharmacologie du réseau a également été réalisée. Il s’agit de la première étude à intégrer systématiquement la pharmacologie en réseau avec des expériences animales afin d’élucider le mécanisme moléculaire par lequel JPSXD soulage la myélosuppression induite par la chimiothérapie grâce à la régulation multi-cible des voies de signalisation, telles que la voie PI3K-AKT, comblant ainsi une lacune dans la compréhension mécaniste des effets protecteurs hématopoïétiques de cette formule composée.

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Protocole

Toutes les expériences sur les animaux ont été menées en stricte conformité avec le Règlement sur l’administration des animaux de laboratoire et les directives éthiques du Centre des animaux expérimentaux de l’Hôpital du cancer du Hunan. Le protocole d’étude a été approuvé par le Comité d’éthique animale de l’Hôpital du cancer du Hunan (Approbation n° : KNZY-202416). Tout au long de l’étude, les chercheurs ont fait tout leur possible pour minimiser le nombre d’animaux utilisés et pour soulager leur souffrance.

Préparation animale
Un total de 60 souris mâles C57/BL6 âgées de 10 semaines ont été obtenus auprès de Hunan Slack Jingda Laboratory Animal Co., Ltd. (Licence n° : SCXK [Hu] 2021-0002). Toutes les souris ont été hébergées au Centre Expérimental des Animaux de l’Hôpital du Cancer du Hunan dans des conditions environnementales contrôlées : température : 23 ± 2 °C, humidité : 50 % ± 10 %, et cycle clair/obscur de 12 h (8:30-20:30). Les souris avaient un accès ad libitum à la nourriture et à l’eau. Avant l’expérimentation, ils étaient acclimatés à l’environnement par manipulation quotidienne pendant 5 minutes sur une période de 3 jours. Après acclimatation, les 60 souris ont toutes été stratifiées par poids corporel et réparties aléatoirement en six groupes (n = 10 par groupe) à l’aide d’un tableau des nombres aléatoires généré par ordinateur. Les groupes comprenaient : témoin à blanc, modèle, sérum physiologique normal (NS) témoin, JPSXD à dose élevée (40 mg/kg), JPSXD à dose moyenne (30 mg/kg) et JPSXD à faible dose (20 mg/kg). Le processus de randomisation n’a permis de garantir aucune différence significative de poids corporel moyen entre les groupes (p > 0,05). La séquence de randomisation a été générée et exécutée par des chercheurs non impliqués dans des procédures expérimentales ultérieures afin de minimiser les biais.

Préparation des matériaux
Sécurité et élimination des déchets : Cette étude a impliqué le CTX, un agent chimiothérapeutique hautement toxique. Toutes les procédures ont été menées en stricte conformité avec le Règlement sur la gestion de la sécurité des substances dangereuses et les normes de laboratoire de niveau 2 de biosécurité. Les précautions spécifiques comprenaient l’utilisation de vêtements de protection jetables, de gants en nitrile, de respirateurs N95 et de lunettes de protection par tout le personnel. La préparation et l’administration du CTX étaient effectuées à l’intérieur d’une armoire de biosécurité de classe II. La préparation de la solution d’injection CTX a été réalisée dans une hotte à fumée à l’aide d’instruments dédiés pour empêcher la formation d’aérosols. Les objets tranchants et les objets contaminés par le CTX, tels que les seringues et les gants, étaient jetés dans des contenants à objets tranchants résistants aux perforations. D’autres matériaux contaminés (par exemple, litière, tissus animaux) ont été inactivés par immersion dans un hypochlorite de sodium à 10 % pendant 24 heures puis incinérés par un professionnel certifié en gestion des déchets médicaux. En cas de déversement de CTX, la zone était immédiatement recouverte de coton absorbant et neutralisée avec une solution de thiosulfate de sodium à 1 %. L’incident a ensuite été signalé au superviseur de la sécurité.

Médicaments et réactifs : l’injection CTX a été obtenue auprès de Baxter Oncology GmbH, Allemagne (Lot n° : HJ20160467). Le JPSXD a été préparé par le département de médecine traditionnelle chinoise de l’hôpital du cancer du Hunan. Il se composait de 15 herbes traditionnelles — Panax ginseng, Astragalus membranaceus, Epimedium brevicornum, Atractylodes macrocephala, Dioscorea opposita, Salvia miltiorrhiza, Rehmannia glutinosa, Cuscuta chinensis, Lycium barbarum, Ligustrum lucidum, Angelica sinensis, malt frit, revêtement de gésier de poulet, écorce de mandarine séchée et graines de Coix — combinées selon des ratios de compatibilitéclassiques 20. La décoction a été concentrée jusqu’à une concentration finale de 3 kg/L (c’est-à-dire 3 g/mL). Avant le vavage, le concentré était dilué avec du NS pour atteindre les concentrations requises pour chaque groupe de dose : 4 mg/mL pour le groupe à haute dose (40 mg/kg), 3 mg/mL pour le groupe à dose moyenne (30 mg/kg), et 2 mg/mL pour le groupe à faible dose (20 mg/kg)26. Le volume de gavage a été calculé comme 0,1 mL pour 10 g de poids corporel, ce qui donne un volume d’administration final de 0,2 à 0,25 mL par souris (basé sur une fourchette de poids de 20 à 25 g)27.

Kits ELISA : Des kits ELISA disponibles dans le commerce pour le facteur stimulant des colonies de granulocytes et macrophages (GM-CSF), EPO et thrombopoïétine (TPO) ont été utilisés. Les échantillons séromiques ont été dilués à 1:5 dans un tampon PBS (pH 7,4) avant le test. Les étalons ont été reconstitués en 100 μL par puits.

Anticorps secondaire : l’IgG anti-lapin de chèvre conjugué à HRP a été dilué à 1:5000 (concentration finale : 0,04 μg/mL) dans un tampon TBST contenant 5 % de lait écrémé et 0,05 % de préadolescents-20. La solution a été fraîchement préparée et incubée à température ambiante pendant 1 heure.

Les anticorps principaux contre le Western blot : GAPDH (polyclonal de lapin), AKT (polyclonal de lapin), JAK2 (monoclonal de lapin) et EGFR (monoclonal de souris) ont été utilisés. Tous les anticorps ont été dilués dans un tampon TBST contenant 5 % de BSA : GAPDH (1:1000), AKT (1:1000), JAK2 (1:800) et EGFR (1:800). Le volume d’incubation était de 100 μL par membrane.

Fixateur tissulaire : Une solution de paraformaldéhyde (PFA) à 4 % a été préparée en dissolvant de la poudre de PFA dans du PBS (pH 7,4). Les mouchoirs ont été fixés pendant 24 heures.

Solution de coloration pour l’hématoxyline et l’éosine (H&E) : La solution d’hématoxyline (0,1 % d’hématoxyline Harris) et la solution d’éosine Y (0,5 %) ont été préparées selon les protocoles de pathologiestandard 28. Les durées de coloration étaient de 5 minutes pour l’hématoxyline et de 3 minutes pour l’éosine.

Tampon bloquant l’immunofluorescence : Tampon PBS contenant 10 % de sérum de chèvre et 1 % de BSA a été utilisé pour le blocage, avec une incubation de 30 minutes.

Tampon de dilution d’anticorps pour l’immunofluorescence : Les anticorps primaires (CD34+, TPO, EPO, GM-CSF) pour l’immunofluorescence ont été dilués dans un tampon PBS contenant 1 % de BSA, suivant le rapport de dilution recommandé par le fabricant (1:200), donnant une concentration finale de 2,5 μg/mL. Le volume d’incubation était de 50 μL par section tissulaire.

Induction d’un modèle animal
60 souris ont été réparties aléatoirement en six groupes (n = 10 par groupe) : témoin blanc, modèle, dose élevée, dose moyenne, faible dose et témoin NS. À l’exception du groupe témoin à blanc, toutes les souris ont reçu des injections intrapéritonéales de CTX (20 mg/kg) une fois par jour pendant 3 jours consécutifs afin d’établir un modèle de myélosuppression. Toutes les souris modèles présentaient des globules blancs < 1,8 × 109/L, PLT < 85 × 10⁹/L, et une réduction de >55 % des cellules nucléées de la moelle osseuse après 24 h après l’injection finale. Ce protocole s’aligne avec les modèles établis de myélosuppression induite parCTX 29,30. Après l’injection, les souris étaient surveillées quotidiennement pour l’état général, y compris le niveau d’activité, l’apparence du pelage et les variations de poids corporel. Du début de la modélisation jusqu’à la fin de l’expérience, le poids corporel était enregistré à la même heure chaque jour à l’aide d’une balance électronique. Le taux de changement de poids corporel a été calculé comme suit : (poids final / poids initial) x 100 %, afin d’évaluer l’état physiologique général et l’effet protecteur potentiel du JPSXD. Après l’injection, les souris étaient hébergées dans des cages ventilées individuellement (VCI), chacune clairement identifiée comme contaminée par CTX. La literie était changée tous les deux jours, et toute la literie utilisée était éliminée conformément aux protocoles de gestion des déchets dangereux décrits ci-dessus.

Administration intragastrique
Les souris des groupes à dosage élevée, moyenne et faible ont reçu JPSXD via gavage à des doses de 40 mg/kg, 30 mg/kg et 20 mg/kg respectivement. Le groupe témoin saline a reçu un volume égal de NS. Les solutions de Gavage ont été préparées à des concentrations de 4 mg/mL, 3 mg/mL et 2 mg/mL respectivement, et administrées à un volume de 0,1 mL pour 10 g de poids corporel. Toutes les souris ont été abattues 2 fois par jour pendant 7 jours consécutifs. Le groupe témoin du sérum a reçu entre 0,2 et 0,25 mL par souris de NS. Aucun traitement n’a été donné aux groupes blanc et modèle. L’absence de toux ou de douleur pendant le gavage indiquait une bonne technique d’administration.

Prélèvement sanguin et préparation sérique
Letroisième jour suivant l’injection CTX, 0,2 mL de sang a été prélevé dans la veine caudale pour évaluer le succès de l’établissement du modèle en mesurant les numéros globulaires périphériques à l’aide d’un analyseur hématologique entièrement automatisé. À 24 heures après la dernière fourrage de JPSXD, du sang a été prélevé dans le sinus orbitaire de souris sélectionnées au hasard (n = 10 par groupe). Une partie du sang a été utilisée pour une numération sanguine complète, tandis que le reste a été traité pour la préparation sérique. Les échantillons ont été centrifugés à 3 000 x g pendant 15 minutes à 4 °C. Le surnageant (une couche supérieure claire, jaune pâle) a été prélevé sous forme de sérum et aliquoté pour être stocké à -80 °C lors des tests ELISA ultérieurs et des tests de fonction hépatique/rénal. La couche sérique a été observée clairement séparée de la couche cellulaire sanguine, sans signe d’hémolyse ni de turbidité. Les paramètres hématologiques mesurés comprenaient les niveaux de globules blancs, de globules rouges, de PLT et d’hémoglobine (Hb).

Évaluation de la fonction hépatique et rénale
Un analyseur biochimique entièrement automatisé a été utilisé pour mesurer les marqueurs de fonction hépatique sérique — alanine aminotransférase (ALT) et aspartate aminotransférase (AST) — ainsi que les marqueurs de fonction rénale — urée sanguine azote (BUN) et créatinine (Cre). Toutes les procédures suivaient le protocole de fonctionnement standard de l’instrument. Plus précisément, 100 μL de sérum ont été mélangés aux kits de test correspondants (ALT, AST, BUN et Cre) et incubés à 37 °C pendant 5 minutes. L’absorption a été mesurée à 340 nm. Chaque échantillon a été testé en double, et la valeur moyenne a été utilisée pour l’analyse.

Calcul de l’indice d’orgue
À 24 heures après l’administration finale de la JPSXD, les souris ont été euthanasiées par inhalation progressive de dioxyde de carbone (CO2) (débit : 20 % volume de chambre/min) suivie d’une luxation cervicale comme méthodesecondaire 31. Immédiatement après l’euthanasie, le foie, les reins, la rate et le thymus ont été prélevés aseptiquement par une incision ventrale de la ligne médiane. Les organes étaient délicatement disséqués des tissus conjonctifs et de la graisse environnants, puis rincés dans une solution salaire normale (NS) glacée pour éliminer le sang résiduel. Les organes étaient séchés avec du papier filtre pré-pesé sous une pression standardisée (3 presses douces) et pesés immédiatement sur une balance électronique calibrée (précision : ±0,1 mg) à température ambiante (22 ± 1°C).

Toutes les procédures ont été réalisées sur un plateau en acier inoxydable pré-refroidi afin de minimiser l’autolyse. L’indice d’organe a été calculé en fonction du poids de l’organe (mg) divisé par le poids corporel (g) afin d’évaluer les effets du JPSXD sur les organes majeurs. Des portions de chaque tissu ont été réservées à l’analyse Western blot, tandis que les échantillons restants ont été fixés en PFA à 4 % pour une évaluation histologique ultérieure.

ELISA
Les concentrations sériques de TPO, EPO et GM-CSF ont été mesurées à l’aide de kits ELISA selon les instructions du fabricant. Toutes les étapes de centrifugation, y compris le lavage de l’échantillon et la reconstitution du réactif, ont été effectuées à température ambiante à 1 000 x g pendant 5 minutes. Les étapes de lavage ont été effectuées à l’aide d’un tampon PBST (PBS contenant 0,05 % Tween-20), avec 300 μL de solution de lavage ajoutés par puits et répétés 3 fois. Après le lavage, aucun liquide résiduel ne reste au fond des puits. Après le développement des couleurs, un précipité bleu distinct était visible. L’absorbance a été mesurée à 450 nm à l’aide d’un lecteur de microplaques après la fin de la réaction.

Coloration H&E
Après l’euthanasie, le thymus et le fémur ont été prélevés. Le thymus était pesé pour calculer l’indice du thymus (poids du thymus [mg]/poids corporel [g]). Après pesée, une partie du thymus a été utilisée pour l’analyse Western blot, tandis que le reste, ainsi que le fémur, ont été fixés à 4 % de PFA. Les échantillons de fémur ont subi une déshydratation à l’éthanol graduée (70 %, 80 %, 95 % et 100 % chacun pendant 1 heure). Une déshydratation correcte était indiquée par un aspect uniformément blanc, sans ramollissement ni déformation. Des blocs tissulaires incrustés de paraffine ont été sectionnés à une épaisseur de 4 μm à l’aide d’un microtome rotatif équipé de lames en carbure de tungstène de haute précision (Type H31). Les sections étaient flottées sur un bain-marie à 40 °C contenant une solution de gélatine à 0,5 % pour éliminer les plis, puis montées sur des lames de microscope. Toutes les sections présentaient une morphologie intacte, des bords lisses et une translucidité uniforme sous microscopie optique, confirmant une qualité optimale de sectionnement. Une teinture H&E a été réalisée, suivie d’un montage avec un milieu de montageaqueux 28. Après la coloration, les noyaux apparaissaient bleus et le cytoplasme rose, avec une architecture cellulaire bien définie sous observation microscopique au microscope inversé. L’analyse histomorphologique a été réalisée à l’aide de logiciels. Pour chaque section colorée par H&E, trois champs aléatoires étaient sélectionnés à un grossissement de 200x. Le logiciel quantifiait automatiquement le nombre de cellules nucléées par unité de surface après délimitation manuelle de la région d’intérêt, et les résultats étaient exprimés en moyenne ± écart-type (x̄ ± s).

Tache occidentale
Les tissus du thymus (50 ± 2 mg/échantillon) ont été homogénéisés dans un tampon RIPA glacé contenant 1x cocktail inhibiteur de protéase à un ratio précis de 100 mg de tissu par 1 mL de tampon, à l’aide d’un homogénéiseur de pilon à pellets motorisé équipé de pilons sans RNase. L’homogénéisation a été réalisée sur glace avec 15 impulsions (1 s de pouls/2 s de pause), suivie d’une incubation de 30 minutes sur glace avec vortex toutes les 10 minutes. L’homogénéat a été centrifugé à 12 000 x g pendant 20 minutes à 4 °C, et le surnageant obtenu a été collecté pour la quantification des protéines. Le surnageant paraissait clair et transparent, dépourvu de précipités ni de couches lipidiques. La concentration en protéines a été mesurée à l’aide d’un kit de test protéique BCA, avec une plage de courbes standard de 0 à 2000 μg/mL. Western blot a été réalisé pour évaluer les niveaux d’expression d’AKT1, JAK2 et EGFR dans le tissu thymus, en utilisant le GAPDH comme contrôle interne. Après électrophorèse et transfert membranaire, le marqueur protéique (10-200 kDa) affichait des bandes claires, et les bandes cibles alignées avec les poids moléculaires attendus (AKT1 : 60 kDa, JAK2 : 130 kDa, EGFR : 170 kDa, et GAPDH : 37 kDa).

L’analyse densitométrique des bandes Western blot a été réalisée à l’aide de logiciels. Avant l’analyse, les bandes ont été inspectées visuellement pour confirmer l’absence de bavage ou de diffusion. La procédure d’analyse comprenait : la sélection manuelle des régions de bandes cibles après l’importation de l’image, avec détection automatisée des contours par le logiciel, suivie d’une soustraction locale de fond en utilisant les régions adjacentes aux bandes pour corriger les valeurs de gris. Ensuite, le calcul du rapport de valeurs grises entre la protéine cible et le contrôle interne pour la quantification relative a été effectué. La formule de normalisation utilisée était la suivante :

Expression relative de la protéine cible = (valeur grise de la bande cible −fond local) / (valeur grise du contrôle interne −fond local)

Immunohistochimie
Une coloration immunohistochimique a été réalisée sur des sections du fémur. Les tranches ont été perméabilisées avec 0,1 % de Triton X-100 pendant 10 minutes, suivies d’un blocage pendant 30 minutes. Les anticorps primaires ont été incubés toute la nuit à 4 °C, et les anticorps secondaires ont été incubés pendant 1 heure à température ambiante. Après la coloration, des signaux positifs distincts avec un fond faible et sans coloration non spécifique ont été observés au microscope optique. Les lames étaient montées à l’aide d’un milieu anti-décoloration contenant du DAPI, qui colorait les noyaux en bleu. L’expression de CD34+, TPO, EPO et GM-CSF a ensuite été évaluée. Les images d’immunohistochimie ont été analysées à l’aide d’un logiciel de pathologie numérique (Version 2.1.0). Avant l’analyse, les images étaient vérifiées comme exemptes de surexposition ou de dégradation du signal. Le processusd’analyse 32comprenait :

Sélection du modèle : Un modèle de segmentation de la moelle osseuse pré-entraîné (basé sur U-Net) a été utilisé pour identifier automatiquement les régionstissulaires 33.
Réglage du seuil : Les seuils de signal positif ont été définis en fonction du groupe témoin négatif. Les régions dont l’intensité chromogénique dépassait la moyenne de fond de trois écarts-types ont été classées positives.
Définition du ROI : Le logiciel a automatiquement divisé chaque champ en régions de grille de 500 × 500 μm et a calculé le nombre de cellules positives par unité de surface (nombre positif de cellules/surface de champ).
Exportation de données : Un rapport statistique de densité cellulaire positive a été généré automatiquement.

Analyse statistique
L’analyse statistique a été réalisée à l’aide du logiciel SPSS (Version 22.0). Les données étaient exprimées sous forme de x̄ ± s. Avant les comparaisons intergroupes, la normalité a été évaluée à l’aide du test de Shapiro-Wilk, et l’homogénéité des variances a été évaluée avec le test de Levene. Si la distribution normale (p > 0,05) et l’homogénéité de variance (p > 0,05) étaient confirmées, l’ANOVA unidirectionnelle a été utilisée pour les comparaisons de groupes. Des comparaisons multiples post hoc ont été réalisées en utilisant la méthode de la moindre différence significative (LSD) ; pour contrôler l’erreur de type I, toutes les valeurs p post-hoc ont été ajustées à l’aide de la correction de Bonferroni, le p < ajusté 0,05 étant considéré comme statistiquement significatif.

Si les données ne respectaient pas les hypothèses de normalité ou d’homogénéité de variance (p ≤0,05 dans l’un ou l’autre test), le test de Kruskal-Wallis était appliqué, suivi du test de Dunn pour l’analyse post hoc avec correction de Bonferroni. Tous les graphiques statistiques et visualisations ont été générés à l’aide de GraphPad Prism (Version 9.0). Le niveau de signification a été fixé à α = 0,05. Toutes les valeurs p rapportées étaient des valeurs ajustées. Les valeurs aberrantes ont été identifiées à l’aide du test de Grubbs (α = 0,05) et exclues uniquement si elles sont clairement attribuables à une erreur expérimentale. Toutes les données restantes ont été incluses dans l’analyse finale. Les résultats sont présentés sous forme de x̄ ± s.

Méthodologie de la pharmacologie des réseaux
Cette étude a utilisé une approche de pharmacologie en réseau pour explorer les mécanismes potentiels par lesquels JPSXD atténue la myélosuppression induite par la chimiothérapie. Tout d’abord, les constituants chimiques du JPSXD et leurs cibles correspondantes ont été extraits de la Plateforme de Base de Données et d’Analyse des Systèmes de Pharmacologie de la Médecine Traditionnelle Chinoise (TCMSP, https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php). Les critères de dépistage étaient définis comme suit : biodisponibilité orale (OB) ≥30 % et ressemblance au médicament (DL) ≥0,18. Pour les composés non inclus dans la base de données TCMSP, la prédiction des cibles a été réalisée via la plateforme SwissTargetPrediction (https://www.swisstargetprediction.ch/).

Pour s’assurer que les composés sélectionnés couvraient les principaux constituants bioactifs du JPSXD, il a été référencé à la Pharmacopée de la République populaire deChine 34. Plus précisément, nous avons identifié des composés marqueurs tels que les ginsénosides, l’astragaloside IV, l’icariine et les acides salvianoliques en examinant les sections Identification et Analyse pour chaque plante. Ces composés, couramment utilisés comme marqueurs de contrôlequalité 35, possèdent des structures chimiques définies et des exigences quantitatives. Pour des raisons d’exactitude, nous avons croisé les Avis généraux et annexes de la Pharmacopée afin de confirmer les conventions de dénomination et les méthodes analytiques (par exemple, chromatographie liquide haute performance, HPLC). L’analyse a confirmé que les critères de dépistage (OB ≥30 %, DL ≥0,18) capturaient efficacement les composés principaux de laformule 36, y compris des constituants pharmacopéens clés tels que les ginsénosides Rg1 et Rb1 (provenant de Panax ginseng), l’astragaloside IV (provenant d’Astragalus membranaceus) et l’icariine (provenant d’Epimedium brevicornum), indiquant que les composés sélectionnés sont représentatifs et englobent les principaux principes actifs responsables de la tonification du qi et du sang de JPSXD Effets.

Par la suite, les cibles génétiques associées à la myélosuppression ont été extraites de la base de données GeneCards (https://www.genecards.org/), et les résultats ont été téléchargés dans un tableur. Des gènes avec un score de pertinence ≥44 ont été sélectionnés pour une analyse approfondie. L’intersection des cibles médicamenteuses et des gènes liés à la maladie a été visualisée à l’aide d’un diagramme de Venn, et les gènes superposés ont été importés dans la base de données STRING (https://string-db.org/). L’organisme était défini sur humain, et les sources d’interaction étaient limitées aux expériences et bases de données avec un score d’interaction minimum requis > 0,7. Le réseau d’interaction protéine-protéine (IPP) résultant a ensuite été analysé pour ses caractéristiques topologiques afin d’identifier les cibles principales et visualisé à l’aide de Cytoscape 3.10.2.

Sur la base des cibles principales identifiées, des analyses d’enrichissement de Gene Ontology (GO) et de Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) ont été réalisées à l’aide de la base de données DAVID (https://david.ncifcrf.gov/). Les paramètres étaient définis comme suit : compte ≥5, score EASE ≥0,05, et valeur p < 0,01. Les résultats d’enrichissement ont été visualisés via la plateforme Microbiological Letter (http://www.bioinfo-cloud.org/). L’analyse des voies a également clarifié les principales voies de signalisation et marqueurs régulateurs impliqués, révélant ainsi les mécanismes potentiels par lesquels JPSXD atténue la myélosuppression induite par la chimiothérapie.

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Résultats

Analyse de pharmacologie de réseau
Identification des composés actifs et des cibles
Nous avons d’abord identifié les principaux composés marqueurs de chaque plante dans JPSXD sur la base de la littérature afind’assurer une sélection complète34. Plus précisément, en consultant les entrées pharmacopéennes des herbes concernées (par exemple, Panax ginseng, Astragalus membranaceus, Angelica sinensis), nous avons compilé une l...

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Discussion

Face à l’augmentation de l’incidence mondiale du cancer, la communauté médicale est confrontée à deux défis : non seulement le traitement du cancer lui-même, mais aussi la prise en charge des effets secondaires associés, parmi lesquels la myélosuppression est une réaction indésirable particulièrement fréquente et grave43. Cette étude a étudié de manière systématique le rôle et les mécanismes potentiels du JPSXD dans l’atténuation de la myélosuppression induite par...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

Cette recherche a été financée par le projet Integral Western and Traditional Chinese Medicine Focus-DCA Mode Intervention for Preventing Postoperatic Infections in Elderly Patients with Gastrointestinal Malignities, avec le numéro de projet A2023053, financé par l’Administration provinciale de la médecine traditionnelle chinoise du Hunan.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
4 % de paraformaldéhyde (PFA)Sigma-AldrichP6148
AKT (pan) Rabbit mAbTechnologie de signalisation cellulaire#4691
Laveuse automatique de microplaquesBioTek (Agilent)ELx405
Analyseur d’hématologie auto BC-2800vetMindrayBC-2800vet
Cryostat MicrotomeThermo Fisher ScientificCryoStar NX50
Cyclophosphamide InjectionBaxter Oncology GmbHN/A (Promotion : HJ20160467)
E100 MicroscopeNikonE100
Anticorps EGFR (A-10)Santa Cruz BiotechnologieSC-373746
Machine d’IntégrationLeicaEG1150
Kit EPO (souris) ELISAR& Systèmes DMEP00B
Anticorps polyclonal GAPDH RabbitProteintech10494-1-AP
Kit GM-CSF (souris) ELISAR& Systèmes DMMC00B
Anti-Lapins IgG conjugué HRPJackson ImmunoResearch111-035-003
H& Kit de coloration ESigma-AldrichHT10
Centrifugeuse réfrigérée à grande vitesseThermo Fisher ScientificSorvall ST 16R
Broyeur de tissus à haut débitServicebioKZ-II
Stylo d’immunohistochimieLaboratoires VectorH-4000
JAK2 Rabbit mAbAbcamab108596
Décoction Jianpi Shengxue (JPSXD)Pharmacie de l’Hôpital du Cancer du HunanFormulation personnalisée
Lecteur de microplaquesBioTek (Agilent)Synergie H1
Solution saline normaleBaxter2B1324X
Microtome rotatifLeicaRM2016
Processeur tissulaireLeicaASP300S
Kit TPO (souris) ELISAR& Systèmes DMTP00B
Mélangeur à vortexServicebioMX-F

Références

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