Article de méthode

Purification des trophoblastes extravilleux HLA-G+ à partir de tissus placentaires humains pour le phénotypage et l’analyse fonctionnelle

545 vues

⸱

DOI :

10.3791/69545

⸱

13 mars 2026

 ,  ,  , 
1Division of Immunobiology, Cincinnati Children's Hospital Medical Center, 2Department of Obstetrics and Gynecology, Faculty of Medicine, University of Toyama, 3Immunology Graduate Program, University of Cincinnati College of Medicine, 4Department of Pediatrics, University of Cincinnati College of Medicine

Dans cet article

Résumé

Ce protocole permet la purification, la caractérisation et la culture des trophoblastes extravilleux primaires HLA-G+ (EVT) à partir de la base de la déduite basale et de la membrane chorionique des placentas humains à terme. Les cultures primaires d’EVT maintiennent leur viabilité pendant 96 heures, permettant la coculture avec des cellules immunitaires maternelles correspondantes à l’échantillon et l’analyse cytométrique et moléculaire de leurs interactions en flux subséquente.

Résumé

L’interface materno-fœtale humaine représente un environnement immunologique unique où les cellules immunitaires maternelles et les trophoblastes extravilleux fœtaux (EVT) entrent en contact cellulaire direct pour établir et maintenir une tolérance immunitaire. Les EVT présentent un immunophénotype distinct caractérisé par l’expression de molécules tolérogènes, dont HLA-G,-L1 et-L2, qui jouent un rôle clé dans la modulation des réponses immunitaires maternelles. De plus, les EVT humains expriment HLA-C qui peuvent être directement reconnus par les cellules NK et T maternelles et favorisent leur activation. Il est important de noter qu’aucun orthologue de HLA-C ou HLA-G n’est présent dans les modèles animaux utilisés pour la recherche, et que les trophoblastes murines ne présentent pas d’expression de MHC. Ainsi, l’étude des propriétés phénotypiques et fonctionnelles de la TEVE humaine à partir des tissus placentaires, tant dans des conditions physiologiques que pathologiques, est essentielle pour élucider les mécanismes sous-jacents au maintien de la grossesse et à la physiopathologie de l’inflammation placentaire associée à la prééclampsie, à la naissance prématurée, à la restriction de croissance fœtale et à la décroissance du placenta accrét. Ce protocole présente une méthodologie complète pour l’isolement et la caractérisation de la TEV humaine primaire à partir du tissu placentaire à terme sain ainsi qu’après la naissance prématurée et la prééclampsie. Elle comprend : (1) la dissection des tissus placentaires et de la membrane chorionique ; (2) la digestion enzymatique et la préparation de suspensions unicellulaires ; (3) purification EVT par tri FACS ; (4) Caractérisation phénotypique par cytométrie en flux de haute dimension ; et (5) culture in vitro à court terme et co-culture avec des cellules immunitaires maternelles pendant jusqu’à 96 heures. L’accent est mis sur l’obtention d’EVT hautement pure et viable, adaptée aux applications en aval telles que les tests fonctionnels immunologiques, l’analyse de l’expression protéique et génique. La mise en œuvre de ce protocole permet une plateforme robuste et reproductible pour faire progresser la compréhension de l’EVT et des interactions des cellules immunitaires maternelles ainsi que de leurs implications tant dans les grossesses saines que compliquées.

Introduction

Le placenta humain contient quatre grandes catégories de types de trophoblastes : cellules souches trophoblastiques, syncytiotrophoblastes, cytotrophoblastes villeux et trophoblastes extravilleux (EVT), chacun ayant des fonctions et des caractéristiques phénotypiques distinctes. Parmi eux, les EVT présentent des caractéristiques immunologiques uniques, notamment une forte expression de molécules immunosuppressives, telles que HLA-G,-L1,-L2, et des membres de la famille B7, ainsi que des HLA-Cpolymorphes 1,2,3,4,5,6. La TEVE envahit profondément les tissus déciduals maternels, les artères spirales et le myomètre, les plaçant en contact direct avec les cellules immunitairesmaternelles 7. Les EVT se caractérisent par une expression marquée de HLA-C polymorphe, un médiateur clé des interactions avec les cellules T et NK maternelles qui doivent être contrôlées pour préserver la tolérance immunitaire pendant la grossesse. En tant que seule molécule classique de CMH exprimée par la TRVE, HLA-C permet également la présentation d’antigènes aux lymphocytes T à mémoire maternelle et soutient la protectionimmunitaire 8. Cependant, plusieurs études ont montré que la TRE augmente directement les cellules T régulatrices CD4 et les états tolérogènes des cellules T CD8 et des cellules NK afin de se protéger contre la cytotoxicité et le rejetimmunitaire 9,10,11,12,13. De plus, certaines études ont rapporté des modifications immunologiques des cellules immunitaires maternelles et de la TRE des placentas obtenus après prééclampsie, accouchement prématuré ou fausse couche par rapport aux témoinsen santé 14,15,16,17,18,19,20,21 . Plusieurs possibilités peuvent sous-tendre ces changements immunologiques, notamment i) une anomalie préexistante des lymphocytes T maternels ; ii) des fonctions immunosuppressives altérées de la TRE ; ou iii) perturber les interactions entre les deux types cellulaires. Pour clarifier les facteurs mécanistiques sous-jacents, des systèmes expérimentaux de modélisation ex vivo permettant l’évaluation des cellules immunitaires maternelles et des interactions avec la EVT sont essentiels.

Les méthodes et approches présentées ici présentent plusieurs avantages par rapport aux méthodes existantes qui utilisent des lignées classiques de trophoblast, des modèles de cellules souches de trophoblastes ou des organoïdes. Plus important encore, les lignées cellulaires classiques de trophoblastes et les modèles de cellules souches trophoblastiques ne reproduisent pas les caractéristiques essentielles de la TRE primaire, y compris leurs profils d’expressionMHC 3,5,22,23. Deuxièmement, les besoins complexes en milieu des cellules souches trophoblastiques humaines (hTSC) et des cultures organoïdes, qui incluent plusieurs inhibiteurs moléculaires, affectent directement les fonctions et le phénotype des cellules immunitaires, empêchant une évaluation adéquate de la TRE et des interactions entre les cellulesimmunitaires 22,24,25,26,27 . Enfin, la diversité cellulaire des cultures de hTSC après différenciation et la nature inversée des organoïdes placentaires permettent des interactions immunitaires avec des types de trophoblastes qui manquent de pertinence inn-vivo, réduisant la clarté desétudes 22,27.

Ici, nous décrivons des méthodes pour purifier l’EVT primaire HLA-G+ à partir de tissus placentaires humains à terme, permettant une culture jusqu’à 96 heures en présence ou absence de populations de cellules immunitaires. Le milieu ne possède pas d’inhibiteurs moléculaires qui affectent la TEVE et les fonctions des cellules immunitaires tout en maintenant leur viabilité. Cette approche offre une plateforme précieuse pour des études directement ex vivo sur l’EVT et les interactions des cellules immunitaires dans des grossesses saines et complexes. Il est censé contribuer à la découverte des principaux facteurs clés de la tolérance immunitaire materno-fœtale et à identifier des cibles thérapeutiques pour résoudre l’inflammation placentaire.

Protocole

Le comité d’examen institutionnel de l’Hôpital pour enfants de Cincinnati a approuvé ce protocole de recherche (Approbation #2021-0336), qui répond aux exigences relatives aux considérations bioéthiques, à la gestion des informations personnelles, aux agents pathogènes infectieux et aux procédures de consentement éclairé conformément à la loi américaine. Chaque laboratoire doit obtenir une approbation conforme aux directives nationales de recherche avant de commencer l’expérience.

Ce protocole se concentre sur la culture de l’EVT primaire HLA-G+ qui maintiennent la viabilité jusqu’à 96 heures pour un test fonctionnel secondaire en améliorant notre protocoleprécédent 2,28. Veuillez consulter Hamilton et al.2 pour établir la lignée cellulaire HLA-G+ de type EVT et Ikumi et al.28 pour impliquer des lymphocytes déciduals maternels appariés.

1. Installer le laboratoire (jour 0).

REMARQUE : Utilisez un cabinet de biosécurité de classe II (BSL2) pour manipuler les échantillons.

  1. Installez deux bains-marie à 39 °C et 37 °C. Installezun incubateur de CO 2 humidifié à 37 °C.
  2. Préparez 1x PBS, lavez le milieu A, lavez le milieu B, et les médiums EVT A, B et C (Tableau 1 et Tableau 2).
  3. Décongelez 15 mL de solution de DNase I à 10 mg/mL (Tableau 1) et 500 mL de trypsine/EDTA à 0,25 % dans un bain-marie à 37 °C.
  4. Placez un récipient rempli de solution biocidale/virucide (par exemple, 10 % d’eau de Javel) dans l’armoire BSL2 pour la collecte des déchets liquides. Installez un contenant à déchets avec un sac de biohazard dans l’armoire BSL2 pour les déchets solides.
  5. Préparez des tampons absorbants, des outils de dissection stériles (pinces à pointe courbe et ciseaux de 6 1/2"), des filtres métalliques stériles, des supports à tubes et des tubes coniques stériles de 50 mL dans l’armoire BSL2.
  6. Préparez trois tubes coniques de 50 mL (deux avec 1 PBS chacun et un avec un milieu de lavage A pour la collecte des morceaux de tissu placentaire lors de la dissection).

2. Prélèvement d’échantillons (jour 0)

REMARQUE : Utilisez des placentas humains avec des membranes obtenues par césarienne entre 24 et 42 semaines de gestation. Un placenta délivré par voie vaginale peut entraîner moins d’EVT.

  1. Commencez à traiter immédiatement le placenta dans une armoire BSL2, idéalement dans les 1 à 2 heures suivant l’accouchement, afin de maximiser le rendement des cellules viables. Maintenez le placenta à température ambiante en permanence.
  2. Inspectez le placenta et, si nécessaire, notez sa taille, son poids et son apparence morphologique globale.

3. Dissection tissulaire (jour 0)

  1. Dissection membranaire
    1. Placez le placenta face au côté fœtal vers le haut (la partie d’insertion du cordon est visible). Retirer l’amnion, qui est la couche membranaire la plus proche du côté fœtal, en décollant manuellement la membrane latérale vers le site d’insertion du cordon ombilical ; Coupez et jetez l’amnion.
    2. Coupez la membrane choriodéciduale en bandes de 2 pouces à partir de la base du placenta vers le haut, tout en laissant la membrane fixée au placenta.
    3. Placez la bande de membrane choriodéciduale sur les deux doigts orientés vers le haut et grattez doucement la déducua pariétale maternelle du chorion à l’aide des pinces à pointe courbe stériles.
      REMARQUE : Travaillez efficacement et ne laissez pas la membrane chorionique se dessécher.
    4. Collectez la membrane chorionique dans un tube conique de 50 mL avec 20 mL de milieu de lavage A.
    5. Collectez la décidua parietalis pour l’isolement des lymphocytes déciduals dans la sonde conique de 50 mL avec 20 mL de PBS et suivez le protocole décrit par Ikumi et al. pour l’isolement deslymphocytes 28.
    6. Coupez la membrane chorionique avec des ciseaux dans le tube de 50 mL jusqu’à ce qu’elle devienne de petits morceaux de <2mm 2.
      REMARQUE : La quantité totale de membrane déposée est idéalement de 30 mL après la coupe.
    7. Jetez le Medium de lavage A et lavez plusieurs fois avec PBS jusqu’à ce que le surnageant devienne clair.
  2. Dissection du placenta
    1. Placez le placenta face au côté maternel vers le haut et retirez les caillots sanguins. Coupez les morceaux de la plaque basale du placenta (longueur 2 cm, largeur 2 cm, profondeur 0,5 cm) à l’aide de ciseaux stériles, en évitant les parties nécrotiques, calcifiées ou ischémiques.
    2. Placez le morceau de decidua basalis sur les doigts faisant face aux villosités (côté fœtal) vers le haut. Retirez soigneusement les villosités de la basale de la cadua avec des ciseaux pour obtenir 2 à 3 mm de membrane, ne laissant qu’une fine couche de villosités sur la basale de la decidua.
    3. Collectez le tissu de la base de la feuille de cœud dans le tube conique de 50 mL avec 20 mL de PBS. Coupez les feuilles de cadua basalis jusqu’à ce qu’elles deviennent de petits morceaux de <2mm 2.
      REMARQUE : La quantité totale de tissu déposé est idéalement de 15 mL après coupage.
    4. Jetez le PBS et lavez le basal décidual avec du PBS plusieurs fois jusqu’à ce que le surnageant devienne clair, sans sang visible.
    5. Divisez 15 mL de suspension tissulaire en deux tubes coniques de 50 mL (7,5 mL dans chaque tube).
      REMARQUE : Le protocole d’isolement des lymphocytes à partir de la decidua basalis est distinct de ce protocole. Référez-vous au protocole fourni dans Hamilton et al.2.

4. Digestion des tissus (jour 0)

  1. Après le lavage final de membrane chorionique et de décidua basalis dans la section 3, remplissez tous les tubes avec 1x PBS, centrifugez-les à 200 × g pendant 1 minute, puis versez le surnageant.
  2. Préparez le cocktail enzymatique de digestion tissulaire (Tableau 1). Ajoutez 150 mL de cocktail enzymatique tiède pour digestion tissulaire dans une bouteille en verre de 300 mL, puis ajoutez 30 mL de membrane chorionique dans la bouteille.
  3. Ajoutez 20 mL de DMEM/F20 tiède et 80 mL de cocktail enzymatique tiède pour digestion tissulaire dans deux bouteilles en verre de 300 mL, puis ajoutez 7,5 mL de Decidua Basalis dans chaque bouteille.
  4. Incubez la bouteille avec une membrane chorionique dans le bain-marie à 39 °C et les deux bouteilles avec la decidua basalis dans le bain-marie à 37 °C. Pendant les 15 minutes d’incubation, secouez toutes les bouteilles toutes les 3-4 minutes (première digestion).
  5. Après la digestion, filtrez le tissu digéré à travers des tamis métalliques (maille de taille 40). Ajoutez le Wash Medium B aux tissus pour rincer et dissoudre la substance gélatineuse.
  6. Filtrez les suspensions cellulaires sur un filtre de 100 μm dans des tubes de 50 mL marqués par type de tissu et numéro de digestion.
  7. Procédez à la deuxième digestion en transférant les tissus non digérés dans les flacons moyens de 300 mL, ajoutez le cocktail enzymatique de digestion tissulaire comme décrit à l’étape 4.2, et répétez les étapes 4.2-4,6.
    REMARQUE : Tous les tissus de Decidua basalis sont transférés dans une seule bouteille de 300 mL. Séparez les cellules obtenues après la première digestion et la seconde.
  8. Faites tourner la suspension à 650 × g pendant 8 minutes et jetez le surnageant.
  9. Combinez les granulés (mais gardez séparés la première et la seconde) du même type de tissu et du même numéro de digestion dans un seul tube. Remplissez avec le Wash Medium B jusqu’à 25 mL.

5. Gradient de densité de Ficoll (jour 0)

  1. Préparez quatre tubes coniques de 50 mL marqués par type de tissu et numéro de digestion. Versez 12 mL de Ficoll dans les tubes.
  2. Chargez soigneusement les suspensions des cellules sur le Ficoll. Centrifugez les tubes à 800 × g pendant 20 minutes (température ambiante) sans frein.
  3. Transférez soigneusement la couche cellulaire à l’interface Ficoll-milieu dans des tubes coniques propres de 50 mL, marqués par type de tissu et nombre de digestion après centrifugation.
    REMARQUE : Collectez soigneusement la couche sans perturber l’interface à l’aide d’une pipette de transfert stérile.
  4. Remplissez les tubes avec du Wash Medium B, puis centrifugez à 650 × g pendant 8 minutes.
  5. Jetez le surnageant et resuspendez les granulés cellulaires avec le milieu restant (environ 0,5 mL). Si nécessaire, gardez environ 10 % de la suspension cellulaire séparée pour le phénotypage et utilisez 90 % pour le tri cellulaire. Comptez les cellules pour déterminer le nombre de cellules et la viabilité.

6. Tri de l’EVT (jour 0)

  1. Placez les granulés cellulaires en suspension dans des tubes FACS stériles marqués par type de tissu et numéro de digestion. Ajoutez l’anti-CD45-BV785 (1:100), l’anti-HLA-G-APC (1:125) et l’anti-EGFR1-BV711(1:160) (Tableau 3). Faites couver les tubes pendant 20 minutes à température ambiante dans le noir.
  2. Ajoutez 1 mL de Wash Medium B et centrifugez-les à 650 × g pendant 8 minutes.
  3. Éliminez le surnageant et resuspendez les granulés cellulaires avec le Wash Medium B pour obtenir environ 1 × 10suspensions de cellules de 6 cellules / mL.
  4. Filtrez les cellules à travers un filtre cellulaire de 40 μm, juste avant le tri cellulaire, puis triez CD45-HLA-G+EGFR+ EVT dans des tubes contenant 1 mL de milieu de culture EVT A selon la stratégie de filtrage décrite à la Figure 1A.
    REMARQUE : Pour une viabilité optimale des trophoblasts, un trieur de cellules à jet en air (par exemple, Bigfoot ou MoFlo) doit être utilisé avec une buse de 100 μm. Les trieurs basés sur la fluidique (par exemple, DB S6 ou Sony Nano) peuvent réduire la viabilité des trophoblastes, tandis que les stratégies de tri des cellules magnétiques (par exemple, Easysep ou MACS) peuvent préserver la viabilité mais avoir une faible pureté, entraînant une prolifération des cellules stomiques dans les cultures.
  5. Centrifugez les tubes FACS avec les cellules triées, jetez le surnageant et resuspendez les granulés cellulaires avec le milieu de culture EVT B.
    REMARQUE : Passez à la section suivante pour préparer les plaques de culture lors du tri des cellules.

7. Culture primaire HLA-G+ EVT pour le test secondaire (jours 0 - 1)

  1. Enduit les puits des plaques de culture cellulaire à fond plat de 96 puits avec 50 μL de fibronectine à 20 μg/mL (Tableau 2) à température ambiante pendant 45 minutes.
  2. Retirez la fibronectine et ajoutez la suspension cellulaire avec le milieu de culture EVT B dans les puits. Visez 0,5 × 10 cellules EVTà 5 basaux / 200 μL de milieu/puits et 1,0 × 10 cellules EVTà 5 chorions / 200 μL de milieu/puits. Incubez les plaques de culture cellulaire pendant 12 à 18 heures dans l’incubateur deCO2 humidifié à 37 °C (incubation jour 0).
  3. Le premier jour, retirez le milieu B, lavez doucement les cellules avec 1x PBS, puis ajoutez le milieu de culture EVT C avec ou sans cellules T pour une (co)culture supplémentaire (voir la section 8).

8. Co-culture de l’EVT primaire HLA-G+ avec des lymphocytes T activés (jours 0 - 4)

  1. Stimulation des cellules CD8+T par un donneur detroisième personne ( jours 0-1)
    1. Lors du tri de la HLA-G+ EVT (jour 0), isolez les populations de cellules immunitaires du sang périphérique provenant soit du sang maternel apparié par échantillons, soit de donneurs non apparentés, en utilisant le cocktail d’enrichissement des cellules T CD8+ humaines référencées (voir le tableau des matériaux), suivi d’une centrifugation par gradient de densité de Ficoll ou d’un tri FACS.
    2. Préstimulez les cellules T ou NK avec des billes ou cytokines anti-CD3/28 (par exemple, IL2, IL15, IL12 ou IL18) dans le milieu de culture cellulaire lymphocytaire selon le souhait.
  2. Co-culture EVT avec les lymphocytes T activés (jours 1-4)
    1. Comptez le nombre de lymphocytes et réalisez des suspensions cellulaires avec un milieu de culture cellulaire lymphocytaire à une concentration de 0,5 × 106 / mL. Ajouter 1 × 105 lymphocytes dans les puits primaires de la TRE (le volume de milieu de culture EVT C : Milieu de culture cellulaire de lymphocytes = 1:1). Incubez les plaques pendant 24 à 72 heures dans un incubateur deCO2 humidifié à 37 °C.
    2. Prélever les lymphocytes pour l’analyse de cytométrie en flux et collecter les surnadants pour l’analyse des cytokines.
    3. Prélever la TRVE par trypsinisation et prélever l’EVT dans les tubes FACS pour l’analyse de cytométrie en flux au jour 4 (voir section 9).

9. Phénotypage de la TRV primaire HLA-G+

REMARQUE : Procédez immédiatement à la coloration cytométrique en flux et gardez la TEVE et toutes les solutions nécessaires à température ambiante en permanence.

  1. Centrifugez les tubes FACS avec EVT primaire à 650 × g pendant 7 minutes et jetez le surnageant.
  2. Ajoutez la solution colorante caspase 3/7 (Tableau 3) aux granulés cellulaires et mélangez-les doucement.
  3. Colorez les cellules avec des anticorps (Tableau 3), mélangez-les doucement, puis incubez-les pendant 20 minutes supplémentaires (un total de 30 minutes d’incubation).
  4. Ajoutez 1 mL de milieu de culture EVT C, centrifugez les tubes à 650 × g pendant 7 minutes, puis jetez le surnageant.
  5. Resuspendez la pellete cellulaire avec 0,4 mL de milieu de culture EVT cellulaire C. Ajoutez la solution de coloration 7-AAD (5 μL/suspension cellulaire) dans les tubes et analysez immédiatement sur un cytomètre en flux.

Résultats

Rendements attendus des cellules

À partir de 15 mL de basal de la décidue, l’EVT HLA-G+ attendu donne 0,1-0,3 × 106 cellules lors de la première digestion et 0,1 à 0,6 × 106 cellules lors de la seconde digestion (total 0,2-0,8 × 106 cellules). Sur 30 mL de membrane chorionique, les rendements attendus de HLA-G+ EVT sont de 0,4 à 1,0 × 106 cellules lors de la première digestion et de 0,4 à 1,5 × 106 cellules lors de la seconde digestion (total 0,8-2,5 × 106 cellules). La proportion de caspases 3/7-7-AAD-EVT vivant dans les isolats devrait être de 90 à 95 %.

Culture primaire HLA-G+ EVT

L’analyse par cytométrie en flux des marqueurs de lignée (HLA-G, HLA-C, EGFR) et des marqueurs de mort cellulaire a montré que ce protocole fournit une culture primaire viable d’EVT jusqu’au jour 4 (96 h après le plaquage de l’EVT triée) (Figure 1B-D). Des images représentatives de la microscopie optique de la TRV chorionique primaire et de la DLA-G+ d.basalis sont présentées après 24, 48 et 72 heures de culture (Figure 2A-F).

Co-culture de l’EVT primaire HLA-G+ avec les lymphocytes T

Ce protocole a amélioré la viabilité de l’EVT primaire 96 heures après l’isolement du placenta, une amélioration par rapport à notre rapportprécédent 1, 2, 10. Il permet donc d’analyser les réponses à la TEVE après une co-culture avec des lymphocytes pré-stimulés, ce qui imite une inflammation aiguë à l’interface materno-fœtale. Les EVT expriment des HLA-C polymorphes ainsi que des molécules coinhibitrices immunosuppressives, telles que-L1,-L2, PVR (également connue sous le nom de CD155), B7H3 et HLA-E, déterminée par coloration par cytométrie de flux extracellulaire (Figures 3A,B). La TRE a augmenté l’expression de HLA-C, ainsi que de-L1,-L2 et HLA-E, mais n’a pas augmenté l’expression de PVR et B7H3 lors de la co-culture avec des lymphocytes activés pendant 72 heures selon la section 8 du protocole (Figure 4A,B). De plus, aucune augmentation des décès par EVT n’a été observée, comme le montrent les colorations 7AAD et caspase 3/7 (Figure 4C,D).

Figure 1
Figure 1. La stratégie de filtrage pour le tri des cellules EVT et la cytométrie en flux se présente après la culture de l’EVT triée. (A) La stratégie de porte représentative pour trier l’EVT de la base de la décision et de l’EVT chorionique. R1 est la porte de cellules vivantes dans le diagramme de diffusion du côté avant. R2 est la porte d’exclusion des leucocytes CD45+. R3 est la porte HLA-G+EGFR+EVT. R4 est le 7-AAD-caspase3/7- EVT en direct. Bien que la porte R4 ne soit pas nécessairement nécessaire pour le tri, elle est ici démontrée pour démontrer la viabilité de l’EVT primaire. (B) Graphiques représentatifs de cytométrie en flux de HLA-G+EGFR+EVT triés, après 96 h de culture in vitro. (C,D) Fréquences de caspase 3/7 - 7-AAD - EVT en direct pendant le tri (jour 0) et 96 heures de culture (jour 4). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 2
Figure 2. La morphologie de la TRE lors de la culture in vitro . Images représentatives de la microscopie optique de la TRV chorionique après (A) 24 h, (B) 48 h, et (C) 72 h de culture et de la EVT de la feuillua basale après (D) 24 h, (E) 48 h et (F) 72 h de culture. Barre d’échelle = 50 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3. Phénotypes immunologiques de la TRE primaire. (A) Les graphiques de flux représentatifs des HLA et des molécules co-inhibitrices sur la TEVE primaire, déterminés par coloration par cytométrie de flux extracellulaire (jour 0). (B) Les diagrammes de raies appariées montrent l’IMF brut du contrôle IgG et la coloration complète de chaque marqueur à partir de l’EVT de d. basalis (bleu) et de l’EVT chorionique (vert) le jour 0. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 4
Figure 4. Phénotypes immunologiques de la TRE primaire avec ou sans lymphocytes activés (jour 4). (A) Diagrammes de flux représentatifs de la TRVE suivant la culture sur 72 heures (jour 4) avec ou sans lymphocytes tiers activés. (B) Les graphiques linéaires appariés montrent l’IMF de la TRVE avec ou sans lymphocytes tiers activés. Les parcelles bleues représentent l’EVT de la cadua basalis, et les parcelles vertes représentent l’EVT chorionique. (C) Graphiques représentatifs de cytométrie en flux pour la caspase 3/7-7-AAD - EVT vivant avec ou sans lymphocytes tiers activés au jour 4. (D) Les diagrammes linéaires appariés montrent la fréquence de la caspase 3/7-7-AAD-EVT vivante avec ou sans lymphocytes tiers activés. Les parcelles bleues représentent l’EVT de la cadua basalis, et les parcelles vertes représentent l’EVT chorionique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Tableau 1. Des réactifs clés pour la dissection et la digestion des tissus. Voiraussi 1,2,24. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 2. Réactifs clés pour la culture et la co-culture de l’EVT avec les lymphocytes T. Voiraussi 1,2,24. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 3. Anticorps et réactifs clés pour le tri et l’analyse par cytométrie en flux. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Discussion

Étapes critiques du protocole

Pour obtenir une EVT viable, il est crucial de commencer l’isolement cellulaire du placenta immédiatement après l’accouchement, et d’effectuer toutes les procédures, de l’isolement au tri à température ambiante. Comme les EVT sont plus gros et plus adhérents que les lymphocytes, les précautions suivantes doivent être prises pour le tri afin d’éviter l’obstruction : i) passer la suspension cellulaire à travers une passoire cellulaire de 40 μm avant le tri, ii) utiliser un milieu contenant de la DNase pour la suspension cellulaire, iii) éviter de surconcentrer les suspensions cellulaires (idéalement ~ 1 × 10⁶ cellules/mL), et iv) utiliser une buse d’au moins 100 μm. Un trieur Jet-in-Air (par exemple, Bigfoot, MoFlo) obtient un rendement EVT viable plus élevé comparé aux trieurs cellulaires à fluidique (par exemple, trieurs BD, Sony Nano).

Modifications et dépannage de la méthode

Surdigérée ou sous-digérée après la première digestion de la Decidua basalis EVT

L’efficacité digestive du tissu de la base de la décision varie selon les placentas. Les tissus surdigérés forment de gros agrégats collants difficiles à traverser dans le tamis métallique. En général, l’ajout de 10 à 30 mL de Wash Medium B aide à disperser ces agrégats lors de la filtration. Si cela ne résout pas le problème, ajoutez 1 à 2 mL de DNase directement dans les tissus. Si la première digestion entraîne une surdigestion, réduisez la concentration du cocktail enzymatique de digestion tissulaire de 80 % à 70 % pour la seconde digestion. Après la filtration de la première digestion, le volume résiduel du tissu doit être réduit à environ moins de la moitié. Si le volume résiduel des tissus reste inchangé, augmentez la concentration du cocktail enzymatique de digestion tissulaire de 80 % à 90 à 100 % pour la seconde digestion. Les tissus de la membrane chorionique sont systématiquement digérés à travers les placentas. Par conséquent, ajuster la concentration du cocktail enzymatique de digestion tissulaire est généralement inutile.

Pour la digestion de volumes tissulaires plus importants que ceux décrits dans le protocole ci-dessus

Pour des digestions de plus de 30 mL de membrane chorionique ou de plus de 15 mL de tissu basal de la feuille de ciède, utilisez des flacons supplémentaires avec le Mix d’enzymes de digestion tissulaire. Augmenter le volume tissulaire dans une seule bouteille tend à entraîner une sous-digestion.

Limites de la méthode

Des rendements plus faibles en EVT sont attendus à partir des placentas délivrés par voie vaginale. L’EVT ne peut pas être cryopréservé avant ou après le tri, car ils sont sensibles au stress de congélation-dégel, ce qui limite considérablement leur viabilité et leur fonction. Ainsi, ce protocole n’inclut aucun point d’arrêt.

L’importance de la méthode par rapport aux méthodes existantes

Nous avions précédemment rapporté le protocole pour établir des lignées cellulaires HLA-G+ de type EVT à partir de placentas à terme en utilisant le milieu B en culture tissulaire et des plaques recouvertes de collagène. Cependant, plusieurs inhibiteurs présents dans le milieu et le collagène peuvent affecter la fonction des lymphocytes T dans le système de co-culture2. Un autre rapport antérieur n’ayant pas utilisé le milieu B de culture tissulaire permettait l’évaluation des lymphocytes T en coculture, mais pas de la TRV en raison de la variabilité cellulaire 1,10. L’avantage du protocole actuel est qu’il minimise l’influence du milieu de culture tout en permettant la culture d’EVT primaire viable. Ce protocole offre une plateforme expérimentale pour étudier la fonction immunologique de la TEVE et leurs modifications fonctionnelles en réponse aux cellules immunitaires environnantes — un domaine qui a été sous-étudié.

Déclarations de divulgation

Il n’y a aucun conflit d’intérêts lié à cette étude.

Remerciements

Nous tenons à remercier Sherry Thornton et le Research Flow Cytometry Core de la Division de Rhumatologie du Cincinnati Children’s Hospital Medical Center pour toute leur aide en cytométrie en flux et en tri cellulaire ; Tous les infirmiers et médecins des hôpitaux participants pour leurs efforts de collecte de matériel placentaire ; Tous les membres du laboratoire de Tilburgs et le corps professoral d’immunologie du CCHMC pour leurs discussions utiles ; Ce travail a été soutenu par le NIH R01HD116852 (T.T.) ; Fondation de recherche pour l’enfance de Cincinnati (T.T.) ; Prix de la grossesse nouvelle génération du Burroughs Wellcome Fund #NGP10115 (T.T.) ; et la bourse collaborative March of Dimes Ohio (T.T.). S.T. est soutenue par les subventions JSPS KAKENHI numéros 22KK0287 et 25K12697.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
0.25% Trypsin/EDTAGibco25200-072
15 mL Centrifuge tubesThermo Fisher14-955-238
-20 °C freezerany supplier
37 °C 5% CO2 Incubatorany supplier
4 °C fridgeany supplier
50 mL Conical Centrifuge tubesThermo Fisher14-955-240
55 mM β-MercaptoethanolGibco21985-023
6 ½” scissorsany supplier
7-AAD Viability Staining SolutionBiolegend420403
-80 °C freezer any supplier
A83-01REPROCELL04-0014
AF700, mouse, IgG1 k Isotype ControlBiolegend400144
APC/Cy7 Rat IgG2a, κ Isotype ControlBiolegend400524
B7H3 PE/Dazzle594Biolegend351012
BD FACSymphony A5 SE Cell AnalyzerBD Biosciences
Bigfoot Spectral Cell SorterThermo Fisher
Bovine Serum Albumin (BSA)Sigma-AldrichA3294
BSL2 biosafety cabinetany supplier
BV605 Mouse IgG1, κ Isotype ControlBD Biosciences562652
BV750 Mouse IgG1, κ isotype Control Biolegend400105
BV785 Mouse IgG1, κ Isotype CotrolBiolegend400170
CD45 BV785Biolegend304048
Cell dissociation sieveMillipore Sigma CD1-1KT (mesh size 60)
Cell strainers 40µm, 70µm, 100µmThermo Fisher22363547; 22363548; 22363549
CellEvent caspase-3/7 Green Detection ReagentinvitrogenC10423
Centrifugeany supplier
CHIR99021, 3mMSigma-AldrichSML 1046-5MG
Curved tip tweezersany supplier
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)VWR Life Science97063-136
DMEM/F12ThermoFisher11320-033
DNAse ISigma-AldrichDN25
Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 for T Cell Expansion and ActivationThermo Fisher Scientific11131D
EGF, Human, Recombinant, Animal FreePeproTechAF-100-15-1MG
EGFR1 BV711Biolegend352920
FACS DIVA softwareBD Bioscienceshttps://www.bdbiosciences.com/ja-jp/products/software/instrument-software/bd-facsdiva-software
Ficoll Paque PlusCytivia17144003
FlowJo SoftwareFlowJohttps://www.flowjo.com/
HLA-C PEBD Biosciences566372
HLA-E PE/Cy7Biolegend342608
HLA-G APCabcamAB40915
Human AB serumCorning35060CI
Human chorionic gonadotropin (hCG) (2500IU/mL)Sigma-AldrichC1063
Human fibronectin (1mg/mL)Corning354008
Human recombinant IL-2PeproTech200-02
Insulin-Transferrin-Selenium, 100x (ITS-G)Thermo Fisher Scientific41400-045
ITGA6 APC/cy7Biolegend313627
L-Ascorbic AcidSigma-AldrichA0278
magnet separatorpromegaZ5342
Newborn Calf Serum (NCS)gibco16010-159
PD-L1 AF700invitrogen56-5983-42
PD-L2  BV750Biolegend345528
PE/Cy7 mouse, IgG1 k, Isotype ControlBiolegend400126
PE/Dazzle594 Mouse IgG1, κ Isotype CotrolBiolegend400176
Penicillin and Streptomycin Gibco15140-122
Phosphate Buffered Saline 10X SolutionThermoFisherBP399-4
PVR BV605BD Biosciences748276
Research grade FBSThermo Fisher ScientificFB12999102
RosetteSep Human CD8+ T Cell Enrichment CocktailStem Cell15023
SB431542. 10 mMApex-BioA8249
Shaking water bath 37 °Cany supplier
Tryple Express 1x No Phenol RedThermo Fisher Scientific12604013
VPASigma-AldrichP4543
X-VIVO 10 Serum-free Hematopoietic Cell MediumLonza04-380Q
Y27632Sigma-Aldrich688000-1MG

Références

  1. Papuchova, H., et al. Three types of HLA-G+ extravillous trophoblasts that have distinct immune regulatory properties. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (27), 15772-15777 (2020).
  2. Hamilton, I., Ikumi, N. M., Kshirsagar, S., Goodman, W. A., Tilburgs, T. Utilizing primary HLA-G+ extravillous trophoblasts and HLA-G+ EVT-like cell lines to study maternal-fetal interactions. STAR Protoc. 4 (2), 102276(2023).
  3. Tilburgs, T., et al. Human HLA-G+ extravillous trophoblasts: Immune-activating cells that interact with decidual leukocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (23), 7219-7224 (2015).
  4. Yu, J., et al. Progestogen-driven B7-H4 contributes to onco-fetal immune tolerance. Cell. 187 (17), 4713-4732.e19 (2024).
  5. Apps, R., et al. Genome-wide expression profile of first trimester villous and extravillous human trophoblast cells. Placenta. 32 (1), 33-43 (2011).
  6. Apps, R., Gardner, L., Hiby, S. E., Sharkey, A. M., Moffett, A. Conformation of human leucocyte antigen-C molecules at the surface of human trophoblast cells. Immunology. 124 (3), 322-328 (2008).
  7. Moffett, A., Loke, C. Immunology of placentation in eutherian mammals. Nat Rev Immunol. 6 (8), 584-594 (2006).
  8. Papúchová, H., Meissner, T. B., Li, Q., Strominger, J. L., Tilburgs, T. The dual role of HLA-C in tolerance and immunity at the maternal-fetal interface. Front Immunol. 10, 2730(2019).
  9. Vander Zwan, A., et al. Mixed signature of activation and dysfunction allows human decidual CD8+ T cells to provide both tolerance and immunity. Proc Natl Acad Sci U S A. 115 (2), 385-390 (2018).
  10. Salvany-Celades, M., et al. Three types of functional regulatory T cells control T cell responses at the human maternal-fetal interface. Cell Rep. 27 (9), 2537-2547.e5 (2019).
  11. Mahajan, S., et al. Antigen-specific decidual CD8+ T cells include distinct effector memory and tissue-resident memory cells. JCI Insight. 8 (17), e171806(2023).
  12. Crespo, ÂC., Strominger, J. L., Tilburgs, T. Expression of KIR2DS1 by decidual natural killer cells increases their ability to control placental HCMV infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (52), 15072-15077 (2016).
  13. Burton, G. J., Redman, C. W., Roberts, J. M., Moffett, A. Pre-eclampsia: Pathophysiology and clinical implications. BMJ. 366, 12381(2019).
  14. Inada, K., Shima, T., Nakashima, A., Aoki, K., Ito, M., Saito, S. Characterization of regulatory T cells in decidua of miscarriage cases with abnormal or normal fetal chromosomal content. J Reprod Immunol. 97 (1), 104-111 (2013).
  15. Tsuda, S., et al. Clonally expanded decidual effector regulatory T cells increase in late gestation of normal pregnancy but not in preeclampsia. Front Immunol. 9, 1934(2018).
  16. Tsuda, S., et al. CD4+ T cell heterogeneity in gestational age and preeclampsia using single-cell RNA sequencing. Front Immunol. 15, 1401738(2024).
  17. Pique-Regi, R., et al. Single-cell transcriptional signatures of the human placenta in term and preterm parturition. eLife. 8, e52004(2019).
  18. Yang, J., et al. Single-cell RNA-seq reveals developmental deficiencies in placentation and decidualization in late-onset preeclampsia. Front Immunol. 14, 1142273(2023).
  19. Morita, K., et al. Analysis of TCR repertoire and PD-1 expression in decidual and peripheral CD8+ T cells reveals distinct immune mechanisms in miscarriage and preeclampsia. Front Immunol. 11, 1082(2020).
  20. Sasaki, Y., et al. Proportion of peripheral blood and decidual CD4+ CD25bright regulatory T cells in pre-eclampsia. Clin Exp Immunol. 149 (1), 139-145 (2007).
  21. Sasaki, Y. Decidual and peripheral blood CD4+CD25+ regulatory T cells in early pregnancy and spontaneous abortion. Mol Hum Reprod. 10 (5), 347-353 (2004).
  22. Shannon, M. J., et al. Single-cell assessment of primary and stem cell-derived human trophoblast organoids as placenta-modeling platforms. Dev Cell. S1534-5807, 00043-00051 (2024).
  23. Apps, R., Murphy, S. P., Fernando, R., Gardner, L., Ahad, T., Moffett, A. HLA expression of primary trophoblast cells and placental cell lines. Immunology. 127 (1), 26-39 (2009).
  24. Okae, H., et al. Derivation of human trophoblast stem cells. Cell Stem Cell. 22 (1), 50-63.e6 (2018).
  25. Shimizu, T., et al. CRISPR screening in human trophoblast stem cells reveals shared and distinct aspects of placental development. Proc Natl Acad Sci U S A. 120 (51), e2311372120(2023).
  26. Hori, T., et al. Trophoblast stem cell-based organoid models of the human placental barrier. Nat Commun. 15 (1), 962(2024).
  27. Wang, M., et al. Single-nucleus multi-omic profiling of human placental syncytiotrophoblasts. Nat Genet. 56 (2), 294-305 (2024).
  28. Ikumi, N. M., Koenig, Z., Mahajan, S., Gray, C. M., Tilburgs, T. Purification of primary human placental leukocytes. STAR Protoc. 4 (2), 102277(2023).

Réimpressions et autorisations

Demander l’autorisation de réutiliser le texte ou les figures de cet article JoVE

Demander une autorisation

Mots-clés

Expression de HLA Gtissu placentaireinterface materno f taletol rance immunitairecytom trie en fluxtri FACScaract risation ph notypiqueinteraction des cellules immunitairesdigestion enzymatique

Articles connexes