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Échantillonnage en temps réel du liquide interstitiel adventitial artérieux fémoral du rat par pose d’une sonde de microdialyse

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DOI :

10.3791/69551

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30 décembre 2025

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1Beijing Hospital, National Center of Gerontology, Institute of Geriatric Medicine, Chinese Academy of Medical Sciences, 2Peking Union Medical College, 3The Key Laboratory of Geriatrics, Beijing Institute of Geriatrics, Institute of Geriatric Medicine, China Academy of Chinese Medical Sciences, 4Institute of Acupuncture and Moxibustion, China Academy of Chinese Medical Sciences

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Cette étude introduit une technique de microdialyse qui facilite l’échantillonnage en temps réel et anatomiquement précis du liquide interstitiel adventitial (AISF) chez les rats anesthésiés, révélant des variations métaboliques distinctes et affirmant son importance physiologique unique. Comparée aux méthodes existantes d’échantillonnage des fluides interstitiels (ISF), cette approche offre une résolution moléculaire et une stabilité d’échantillonnage améliorées.

Résumé

Le liquide interstitiel (ISF) est un élément vital du microenvironnement extracellulaire, facilitant l’échange métabolique et la communication intercellulaire. Néanmoins, la profondeur anatomique et la proximité des structures vasculaires rendent l’ISF advential (AISF) particulièrement difficile à prélever sans introduire de contamination ni perturbation tissulaire. Dans cette étude, nous introduisons une méthode en temps réel et minimalement invasive pour la collecte d’AISF grâce à l’utilisation de la microdialyse chez des rats anesthésiés. Des sondes doubles de 20 kDa ont été implantées chirurgicalement dans l’adventite artérioveineuse fémorale et la veine jugulaire afin de permettre un prélèvement continu de l’ISF et du sang, respectivement. La perfusion avec du liquide extracellulaire artificiel a permis la diffusion sélective de métabolites de faible poids moléculaire. Grâce à l’analyse des composantes principales (ACP) et à l’analyse discriminante des moindres carrés partiels orthogonals (OPLS-DA), une divergence métabolique distincte entre l’AISF et le sang a été observée, identifiant 146 métabolites significativement différentiels. Les schémas d’enrichissement du lactate et de la sérotonine ont confirmé la spécificité anatomique et la fiabilité fonctionnelle de la méthode. Il est important de noter que l’AISF était enrichi en métabolites synthétisés localement absents dans le plasma, soulignant sa signification physiologique unique. Comparée aux méthodologies actuelles d’échantillonnage du fluide interstitiel (ISF), telles que les microaiguilles, les ampoules d’aspiration et l’iontophorèse inverse, la microdialyse offre une résolution moléculaire améliorée, une meilleure stabilité d’échantillonnage et une invasion réduite. Cette technique constitue une plateforme fiable pour l’analyse in vivo des analytes dans le liquide interstitiel (AISF) et présente un potentiel significatif pour faire progresser la découverte de biomarqueurs et la recherche en physiopathologie vasculaire.

Introduction

Le liquide tissulaire, ou fluide interstitiel (ISF), constitue un élément crucial du microenvironnement cellulaire, avec des recherches académiques remontant à la fin du XIXe siècle. En 1896, Starling a introduit la théorie de la filtration-réabsorption capillaire, qui a d’abord caractérisé l’ISF comme un fluide homogène généré par ultrafiltration plasmique, jouant un rôle vital dans le transport des nutriments et l’élimination des déchetsmétaboliques 1. Au cours des deux dernières décennies, les avancées en technologie d’imagerie microscopique et en biologie moléculaire ont enrichi la compréhension par les chercheurs de la grande diversité de la distribution, de la composition et de la fonction anatomique del’ISF 2.

La recherche sur le liquide interstitiel (ISF) sur divers sites anatomiques a permis d’élucider ses fonctions distinctes au sein de différents tissus. Par exemple, dans les tissus cérébraux, l’ISF facilite l’élimination des métabolites neurotoxiques, tels que β-amyloïde, pendant le sommeil via le systèmeglymphatique 3. Inversement, le liquide interstitiel tumoral (TIF) contribue à l’invasion et à l’évasion immunitaire en favorisant un microenvironnement acide par l’accumulation d’acidelactique 4. Ces résultats suggèrent que l’ISF agit non seulement comme médiateur de l’échange métabolique, mais aussi comme régulateur actif des processus pathophysiologiques spécifiques aux tissus. Dans ce contexte, le Fluide Interstitiel Adventitial (AISF) présente un défi de recherche unique en raison de sa localisation anatomique spécifique et de sa complexité fonctionnelle. L’AISF est située à l’interface entre l’adventite et les tissusenvironnants 5, jouant un rôle crucial dans l’interaction entre la paroi vasculaire et les systèmes nerveux et immunitaire. Cependant, sa position anatomique profonde et sa proximité avec le sang et les fluides lymphatiques ont posé d’importants défis techniques pour l’échantillonnage in situ et l’analyse compositionnelle.

Les techniques traditionnelles d’échantillonnage ISF, y compris la méthode à mèche et le drainage chirurgical, rencontrent des difficultés importantes pour obtenir des échantillons d’AISF de haute pureté en raison du risque de contamination sanguine et de lésions tissulaires. Par exemple, l’ablation chirurgicale de l’épithélium vasculaire peut entraîner des lésions des nerfs périphériques ou des vaisseaux lymphatiques, entraînant un mélange de biomolécules nonciblées 6. De plus, ces méthodes sont limitées par de faibles taux d’échantillonnage, de l’instabilité, la susceptibilité aux interférences et une faible reproductibilité, souvent attribuables à une inflammation induite par l’insertion sous-cutanéede la mèche 7 et à des lésions cellulaires lors de l’implantation musculaire. Le développement de la microdialyse présente une approche plus efficace pour les études ISF. Cette technique permet la capture in situ et dynamique de petites molécules, telles que les métabolites et les cytokines, au sein de l’ISF sans compromettre la structure vasculaire, grâce à l’utilisation d’une sonde membranaire semi-perméable. La sonde peut être positionnée précisément dans l’espace épithélial vasculaire, réduisant ainsi le risque de contamination par le sang ou les fluides lymphatiques. De plus, il facilite l’échantillonnage continu, ce qui permet une surveillance en temps réel des changements dynamiques du métabolisme de l’ISF sous diverses conditions. Assurez-vous d’assurer une surveillance continue et stable de ces processus métaboliques pendant l’expérience.

Protocole

Les expériences sur les animaux ont été menées après approbation du Comité d’éthique animale du Collège médical de l’Union de Pékin. Toutes les procédures ont strictement respecté les protocoles établis. Les réactifs et l’équipement utilisés sont listés dans le tableau des matériaux.

1. Préparation expérimentale

  1. Illustrez le système d’échantillonnage de microdialyse et les instruments chirurgicaux associés tels que présentés à la Figure 1.
  2. Préparez un liquide extracellulaire artificiel (ECE) contenant 153,5 mM Na, 4,3 mM K, 0,41 mM Mg, 0,71 mM Ca, 139,4 mM Cl et 1,25 mM de glucose, puis ajustez le pH à 7,4.
  3. Préparez deux sondes mD de 20 kDa et désignez-les comme Sonde 1 (sonde de fluide tissulaire) et Sonde 2 (sonde sanguine). Placez la sonde 1 dans de l’eau déionisée filtrée stérile (dH₂O) et la sonde 2 dans de l’héparine sodique à 1 %, en veillant à ce que les extrémités de la sonde restent continuellement humides.
  4. Établissez deux paires de voies (Voies 1 et 2) pour « entrée » et « sortie ». Reliez deux segments de tubulure FEP de 1 m à l’aide d’un tube PE50, minimisant ainsi l’espace mort. Fixez chaque tube d’entrée à une seringue Exmire de 1 mL : remplissez la seringue 1 avec du dH₂O et la seringue 2 avec de l’héparine sodique à 1 %. Connectez les microseringues aux sondes et préparez la perfusion d’une ECF après avoir placé les sondes dans la veine jugulaire.
  5. Activez la pompe mD et réglez le débit à 1,5 μL/min jusqu’à ce que le fluide sorte du tube d’évacuation. Connectez le tube d’évacuation à la conduite de collecte des échantillons.
  6. Remplir deux micro-seringues avec un ECF filtré et commencer le pompage à 1 μL/min.

2. Préparation animale

  1. Certains rats adultes de Sprague-Dawley pesant 280 ± 20 g (n = 6).
  2. Induire l’anesthésie avec de l’isoflurane à 3 % et la maintenir avec 1,8 % à 2,2 % d’isoflurane dans un mélange air/oxygène tout en surveillant l’activité cardiaque (selon les protocoles approuvés par l’institution). Confirmez l’anesthésie profonde en évaluant l’absence de réponse à la douleur et en notant une baisse du rythme cardiaque (340-390 bpm). Placez le rat sur une couverture thermostatique et immobilisez les membres.
  3. Appliquez une crème dépilatoire sur le cou et le membre postérieur gauche, en s’étendant jusqu’au bas de l’abdomen gauche. Désinfectez les zones dépilées deux fois avec de l’iodophore et éliminez l’iode résiduel à l’aide d’alcool médical à 75 %.

3. Pose de la sonde à double site (adventitie fémorale et veine jugulaire)

  1. Utilisez une sonde avec une fenêtre de dialyse active de 10 mm (CMA-20, coupure de 20 kDa, diamètre d’arbre de 0,5 mm) comme illustré à la Figure 2A.
  2. Préparez l’aiguille guide et le tube de détachement (Figure 2B).
  3. Prolongez le membre postérieur du rat de sorte que la ligne reliant l’articulation du genou au point médian du pli inguinal soit perpendiculaire à l’axe longitudinal du corps. Mesurez un segment de 2 cm le long de la peau de la région inguinale dans la direction du membre postérieur pour définir la zone chirurgicale (Figure 2C). Identifiez le point médian de cette région inguinale comme le point de positionnement des microfenêtres. Marquez le site de la ponction de 2 cm latéralement à ce point de positionnement (Figure 2D).
  4. Placez l’animal sous un stéréomicroscope.
  5. Réalisez une incision de 0,5 à 0,8 cm au milieu du pli inguinal pour faciliter la visualisation et garantir un placement précis de la sonde dans la membrane périvasculaire. Disséquez sans détour le tissu sous-cutané pour exposer l’artère et la veine fémorales, la veine saphène et la veine superficielle de la paroi abdominale (Figure 2E).
  6. Enfermez la couche extérieure de l’aiguille de perforation dans un tube déchirable pour créer une aiguille guide.
  7. Vérifiez qu’aucun vaisseau sanguin n’est présent sous la peau au point de la ponction. Insérez l’aiguille verticalement à travers la peau, puis ajustez l’angle à 45° pour pénétrer dans l’espace tissulaire entourant la veine saphène.
  8. Avancez l’aiguille dans la direction du flux sanguin dans la grande veine saphène, en maintenant un contact étroit avec la paroi du vaisseau tout au long de l’intervention. Utilisez un stéréomicroscope pour surveiller la position de l’aiguille en temps réel et prévenir les lésions vasculaires ou la contamination sanguine. Ensuite, guidez l’aiguille dans l’adventite de la veine fémorale (Figure 2F).
  9. Retirez l’aiguille de perforation en laissant le tube déchirable en place dans le tissu (Figure 2G).
  10. Insérez la sonde de liquide tissulaire dans le cathéter déchirable, ouvrez soigneusement le cathéter pour exposer le site de prélèvement et récupérer l’échantillon de tissu (Figure 2H). Assurez-vous que la sonde est précisément positionnée dans l’adventite de l’artère et de la veine fémorales (Figure 2I). Fixez la sonde à la peau avant de suturer (Figure 2J). Effectuer toutes les interventions dans des conditions strictement aseptiques, en veillant à éviter les perturbations de l’adventite vasculaire et à prévenir l’inflammation des tissus ou les réactions des corps étrangers qui pourraient compromettre la collecte de liquide tissulaire.
  11. Vérifiez la position de la sonde en photographiant une règle chirurgicale avec la sonde fixe pour documenter la longueur exposée, et présentez cette image comme illustrée à la Figure 2I.
  12. Réaliser une incision cutanée de 2 cm d’environ 0,5 cm latérale à la ligne médiane du cou, en commençant 1 cm au-dessus de l’encoche sternale.
  13. On dissèque de manière directe le muscle sternocléidomastoïdien pour exposer la veine jugulaire, qui se trouve latéralement par rapport à l’artère carotide et se distingue par sa coloration bleu foncé. Utilisez un coton-tige humidifié pour séparer doucement le fascia, en veillant à éviter le contact avec le nerf vague.
  14. À l’aide de pinces microscopiques, surmontez doucement la membrane externe de la veine jugulaire et retirez soigneusement le tissu conjonctif environnant afin d’obtenir au moins 1 cm de longueur de vaisseau libre. Placez une suture de soie 4-0 proximalement pour servir de ligature de secours (Figure 2K).
  15. Pour la ponction veineuse, réalisez une incision oblique à un angle de 45°, soit environ un tiers du diamètre du vaisseau. Utilisez une microforceps pour ouvrir doucement l’incision et créer une entrée pour l’insertion de la sonde.
  16. Insérez soigneusement la pointe de la sonde dans la veine et avancez-la lentement jusqu’à une profondeur de 3,5 à 4,0 cm, en veillant à ce que la pointe atteigne l’entrée de l’oreillette droite (Figure 2L).
  17. Fixez la sonde en serrant la ligature de soie proximale avec un double nœud. Fermez la couche musculaire avec des points de suture 4-0 Vicryl, puis suturez la peau avec des points interrompus. Fixez la partie externe de la sonde à la surface de la peau pour éviter le déplacement.

4. Collecte d’échantillons et récupération de la sonde

  1. Prélèvement de l’échantillon : Évaluer la relation entre la dialyse tissulaire et le transfert de l’échantillon dans le tube de prélèvement. Maintenir un volume total de 20 μL entre la sonde et le collecteur.
    1. Laissez une période de 20 minutes à l’échantillon pour traverser la sonde et le tuyau, puis atteindre l’extrémité du tuyau pour la collecte à un débit de 1 μL/min. Prélever un volume adéquat pour atteindre la concentration requise pour l’analyse. Prélever 30 μL de dialysat par tube de prélèvement.
  2. Stockage de l’échantillon : pré-refroidissez des tubes de collecte en polypropylène de 0,5 mL à 4 °C. Immédiatement après la collecte, bouchez les tubes, congelez-les instantanément dans de l’azote liquide pendant 30 secondes, puis transférez-les dans un congélateur à -80 °C en moins de 2 minutes.
  3. Échantillon de référence : Équilibrer complètement l’échantillon avant d’initier la collecte. Prélever trois échantillons par rat sous anesthésie afin d’établir une base de mesure stable.
  4. Retrait de la sonde : Retirez la sonde de la tête de l’animal à la fin du prélèvement et placez-la dans un flacon contenant 1 % d’héparine en sodium. Euthanasiez l’animal par inhalation d’un excès d’isoflurane.
  5. Conservation de la sonde : Rincez soigneusement la sonde avec du sérum physiologique et conservez-la dans un flacon contenant une solution saline. Rincez les tubes avec du sérum physiologique à l’aide d’une seringue pour prévenir la croissance microbienne. Réutiliser la sonde seulement si elle maintient un écoulement suffisant et que la membrane reste intacte.

5. Analyse des données

  1. Effectuer l’analyse des composantes principales (PCA), l’analyse discriminante des moindres carrés partiels orthogonaux (OPLS-DA) et des analyses statistiques supplémentaires à l’aide de MetaboAnalyst 6.0. Utilisez OPLS-DA spécifiquement pour déterminer l’importance variable en projection (VIP).
  2. Appliquer des tests non paramétriques, y compris les évaluations de la valeur P et l’analyse des changements de plis, pour examiner les métabolites différentiels. Fixez des seuils critiques pour le dépistage des métabolites différentiels : VIP > 1, FC ≥ 2, ou FC ≤ 0,5, et P < 0,05.
  3. Annoter les métabolites identifiés à l’aide de la base de données des composés KEGG.

6. HPLC - MS/MS

  1. Effectuer la quantification des métabolites à l’aide d’un spectromètre de masse quadrupolaire triple AB Sciex 6500+ équipé d’une source d’ionisation par électropulvérisation (ESI) fonctionnant en mode ion positif.
  2. Régler les paramètres de l’instrument comme suit : gaz rideau, 40 psi ; gaz de collision, 10 psi ; gaz source d’ions 1 (GS1), 50 psi ; gaz source d’ions 2 (GS2), 55 psi ; tension de pulvérisation ionique, 4500 V ; et la température de la source, 550 °C.
  3. Faites fonctionner le système en mode surveillance des réactions multiples (MRM). Optimisez individuellement les transitions MRM, les potentiels de dégroupement et les énergies de collision pour chaque métabolite. Effectuer l’acquisition de données avec le logiciel Analyst 1.7.1 et l’analyse quantitative via MultiQuant 3.0.3.
  4. Pour la séparation chromatographique, utilisez une colonne C18 (2,1 × 100 mm, 1,7 μm) maintenue à 45 °C. Préparez les phases mobiles sous forme de (A) 0,1 % d’acide formique dans l’eau et (B) 0,1 % d’acide formique dans l’acétonitrale. Réglez le débit à 0,35 mL/min et le volume d’injection à 6 μL. Maintenez la température de l’autoéchantillonneur à 4 °C avant analyse.
    REMARQUE : Pour cette étude, chaque course a duré environ 25 minutes au total.

Résultats

Le jeu de données a été normalisé par l’application de transformations de sommation et logarithmiques, puis a procédé à un ensemble complet d’analyses statistiques. Une analyse des composantes principales (ACP) a été réalisée (Figure 3A), qui a révélé des séparations distinctes et mis en lumière des différences métaboliques. Par la suite, un modèle d’analyse discriminante des moindres carrés partiels orthogonals (OPLS-DA) a été développé, les scores résultants étant représentés à la Figure 3B, démontrant l’efficacité discriminatoire du modèle. Lors de l’évaluation de 618 métabolites, des graphiques volcaniques comparant l’AISF et les échantillons sanguins ont identifié 146 métabolites différentiels, le liquide tissulaire présentant à la fois des métabolites régulés à la baisse et à la hausse (Figure 3C). De plus, une carte thermique a été créée pour fournir un aperçu comparatif des 50 principaux métabolites différentiels (Figure 3D).

Pour évaluer la fiabilité de la méthode d’échantillonnage, la sérotonine et l’acide lactique ont été utilisés comme témoins positifs représentant respectivement les composants du liquide tissulaire et le sang. Les résultats correspondaient aux schémas de distribution établis de ces composants à travers divers fluides corporels, comme illustré à la Figure 4. La Figure supplémentaire 1 montre la stabilité du lactate et de la sérotonine dans les aliquotes microdialysées stockées à -80 °C.

Les 146 métabolites différentiels ont été systématiquement classés en plusieurs catégories : nucléosides, nucléotides et leurs analogues ; acides gras et leurs dérivés ; acides aminés, peptides et leurs analogues ; glucides et conjugués de glucides ; acides organiques et leurs dérivés ; des amines biogéniques ; purines et pyrimidines ; vitamines et stéroïdes ; ainsi que d’autres composés (Figure 5A). Le tableau supplémentaire 1 montre les métabolites différentiels détectés dans le sang. Les analyses de cartes thermiques élucident davantage les schémas d’enrichissement des amines biogéniques et des acides aminés, des peptides et de leurs analogues dans divers fluides corporels (Figure 5B,C). L’analyse d’enrichissement différentiel des métabolites est présentée à la Figure 6. Le tableau complémentaire 2 présente le coefficient de variation (CV) pour quinze métabolites sélectionnés au hasard dans trois échantillons consécutifs de tissul-liquide périvasculaire.

Figure 1
Figure 1 : Images de l’appareil expérimental. (A) Collecteur de fractions réfrigéré. (B) Pompe à seringue. (C) Microseringues. (D) Instruments chirurgicaux, y compris ciseaux vasculaires et pinces, etc. (E) Machine d’anesthésie. (F) Sondes de microdialyse. (G) Sondes de microdialyse, aiguille de guidage tissulaire et un tube déchirable. (H) Assemblages aiguilles guides de tissu. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 2
Figure 2 : Les étapes clés de l’étude. (A) Une représentation schématique représentant un diagramme illustrant la position du site chirurgical et l’orientation de la sonde. (B) Identification des jonctions vasculaires critiques afin d’assurer une observation précise des sites de placement de la sonde. (C) Insertion de l’aiguille guide qui pénètre la peau et avance dans l’espace tissulaire. (D) La rétraction des aiguilles guides est retirée, laissant le tube déchirable à l’intérieur du tissu. (E) La sonde de microdialyse est introduite dans le tissu via le canal établi. (F) Rétraction douce du tube déchirable. Le tube déchirable est doucement rétracté après avoir fixé la sonde en place. (G) Visualisation des sondes positionnées dans l’épithélium des vaisseaux artériels et veineux du fémur. (H) Séparation des tissus de la veine jugulaire. (I) Placement de la sonde dans la veine jugulaire. (J) La sonde de microdialyse est fixée à la surface de la peau. (K) isolement de la veine jugulaire. (L) Insertion de la sonde dans la veine jugulaire. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 3
Figure 3 : Analyse statistique multivariée du liquide interstitiel (ISF) et du sang. (A) Les données ont été réduites pour mettre en avant des séparations significatives, montrant des différences distinctes entre ISF et les composants sanguins. (B) Les scores du modèle d’analyse discriminante partielle orthogonale des moindres carrés (OPLS-DA) indiquent des valeurs R2Y et Q2 de 0,925 et 0,811, respectivement. (C) Le graphique volcanique représente 146 métabolites différentiels, dont 85 métabolites régulés à la baisse et 61 régulés à la hausse dans l’ISF. (D) De manière correspondante, des cartes thermiques contrastant les 30 principaux métabolites de l’ISF et du sang révèlent une distinction claire entre les deux ensembles de composantes. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 4
Figure 4 : La présentation d’une série de boîtes a permis d’élucider les niveaux d’enrichissement de lactate et de sérotonine dans l’ISF et le sang. Tous les points de données représentent la moyenne ± SEM ; Les barres d’erreur sont affichées pour tous les panels quantitatifs. Le panel (A) illustre que les échantillons ISF présentent un enrichissement nettement plus important du lactate que les échantillons sanguins. En revanche, le panel (B) montre que la sérotonine est plus enrichie dans les échantillons sanguins, qui présentent simultanément des niveaux de lactate plus faibles. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 5
Figure 5 : Le tableau des anneaux de classification des métabolites différentiels et la carte thermique des acides aminés, peptides et analogues, ainsi que des amines biogéniques, sont représentés. (A) Chaque bloc de couleur correspond à une classe distincte de métabolites. Les acides aminés, peptides et analogues représentent la plus grande catégorie, représentant 19,29 % du total, suivis des nucléosides, nucléotides et analogues (15 %), acides gras et dérivés (12,86 %), glucides et conjugués de glucides (7,86 %), acides organiques et dérivés (10 %), amines biogéniques (7,14 %), purines/pyrimidines (5,71 %), vitamines et stéroïdes (8,57 %), ainsi que d’autres composés, dont les indoles, azépines, pyridines et benzènes, avec 13,57 %. (B) Dans le liquide interstitiel (ISF), les niveaux d’enrichissement de composés tels que la désoxycarnitine et la spermidine dans la catégorie des amines biogéniques sont significativement élevés par rapport à ceux du sang, tandis que les niveaux de sérotonine (D4), sérotonine, tryptamine et composés apparentés sont significativement réduits. (C) Dans l’ISF, la majorité des métabolites associés aux acides aminés, peptides et analogues sont nettement inférieurs à ceux observés dans le sang. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 6
Figure 6 : L’analyse d’enrichissement des ensembles de métabolites (MSEA) du liquide interstitiel normal a révélé que l’activité métabolique est principalement répartie sur des voies liées à la production d’énergie, à l’homéostasie redox et au renouvellement des acides aminés. Les voies les plus enrichies incluent le métabolisme du butanoate, le métabolisme des purines et le métabolisme du glutathion, reflétant le maintien de l’apport énergétique mitochondrial et la capacité antioxydante dans des conditions physiologiques. De plus, plusieurs voies liées aux acides aminés, telles que le métabolisme de l’arginine et de la proline, le métabolisme du tryptophane, ainsi que le métabolisme de la cystéine et de la méthionine, sont représentées, indiquant une interconversion active des acides aminés et une régulation de l’équilibre azotique dans le microenvironnement extracellulaire. Ces résultats suggèrent que le métabolome interstitiel normal maintient un équilibre dynamique entre les processus bioénergétiques, la défense oxydative et le métabolisme des acides aminés, soutenant l’homéostasie tissulaire et la stabilité microcirculatoire. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure supplémentaire 1 : Stabilité du lactate et de la sérotonine dans les aliquotes de microdialyse stockées à -80 °C. Les données sont en moyenne ± SEM (n = 6 réplications par moment donné). Aucun analyte n’a dévié de >5 % de la référence sur 72 heures. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Tableau complémentaire 1 : Métabolites différentiels détectés dans le sang et le microdialysat de liquide interstitiel advential. Cela inclut le nom du métabolite, le changement de pli (FC), la valeur P du test t de Student, et le VIP (OPLS-DA). Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Tableau complémentaire 2 : Coefficient de variation (CV) pour quinze métabolites sélectionnés au hasard dans trois échantillons consécutifs de tissu périvasculaire et de liquide. Tous les CV sont < 20 %. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

Le liquide interstitiel (ISF) est le microenvironnement aqueux qui enveloppe chaque cellule tissulaire et constitue environ 75 % du compartiment extracellulairedu liquide 8,9. Générée par filtration capillaire du plasma, l’ISF ne possède pas la teneur en protéines et cellulaire élevée du sang mais conserve des électrolytes, de petits solutés et del’eau 9. Cette composition place l’ISF comme l’interface pivot entre les mondes vasculaire et cellulaire. Sur le plan fonctionnel, l’ISF est un moyen de transport dynamique. Il transporte l’oxygène, le glucose, les acides aminés et les micronutriments du sang vers les cellules tout en collectant simultanément le dioxyde de carbone, l’urée et d’autres déchets métaboliques pour les ramener à la circulation10. Le fluide sert également de lubrifiant et de tampon, stabilisant la pression osmotique interstitielle, le pH et l’équilibreionique 11. Au-delà du métabolisme, l’ISF soutient la surveillance immunitaire en transportant les leucocytes, anticorps et cytokines à travers les espaces tissulaires et agit comme une autoroute de communication pour les hormones et les signauxparacrines 12,13. Comparé au sang, l’ISF est essentiellement un filtrat14 sans cellules et pauvre en protéines. Le sang, confiné à l’arbre vasculaire, contient des globules rouges et blancs, des plaquettes, ainsi que de fortes concentrations d’albumine et de facteurs de coagulation. Les niveaux d’oxygène et de nutriments sont les plus élevés dans le sang et progressivement plus bas dans l’ISF en raison de l’absorption cellulaire, tandis que les déchets s’accumulent dans l’ISF avant d’entrer dans le retour lymphatiqueou veineux 10. L’absence de grandes protéines et de cellules dans les ISF normales minimise la pression oncotique et permet une diffusion rapide, mais les états inflammatoires peuvent modifier temporairement ceprofil 15.

Cependant, l’étude de l’ISF reste limitée en raison de l’absence de méthodologies d’échantillonnage simples, rapides et fiables. Les méthodes actuelles incluent les patchs à microaiguilles (MN), les ampoules d’aspiration, l’iontophorèse inverse, l’ablation thermique et la microdialyse. Les patchs MN créent des microcanaux pour l’extraction de l’ISF à travers la peau, avec des variantes à coque centrale qui extraient l’ISF en moins de 30 s et des MN hydrogel osmotiques en environ 3 minutes. Ces derniers peuvent être combinés avec des capteurs pour une analyse sur le patch, mais sont limités par le volume et nécessitent un équilibre entre la force et le gonflement. Les ampoules d’aspiration fournissent une ISF pure avec une contamination sanguine minimale mais sont invasives, douloureuses etlentes 16, 17, 18. L’iontophorèse inversée (RI) utilise de faibles courants électriques pour transporter des analytes chargés, tels que le glucose et les ions lithium, vers la surface cutanée pour une surveillance non invasive. Cependant, il rencontre des défis tels que un faible débit, une variabilité entre les individus et une irritation cutanéepotentielle 19,20. L’administration transdermique (TA) perturbe la strate cornée par un chauffage localisé afin de permettre aux ISF d’entrer passivement dans les microcanaux hydrophiles. Bien que plus simple dans sa conception de dispositifs, il collecte moins de 5 μL de fluide, nécessitant une détection très sensible et une gestion thermique attentive pour éviter lesbrûlures 21,22. En revanche, la microdialyse (DM), qui repose sur la diffusion à travers des sondes semi-perméables implantées, offre une sélectivité moléculaire unique grâce à des membranes de coupure du poids moléculaire ajustable (MWCO), telles que 10 kDa pour le glucose et 100 kDa pour les protéines et cytokines23,24. Cette technique permet un échantillonnage continu et peu invasif. Cependant, la DM est opérationnellement complexe, nécessite un calibrage in vivo et présente des taux de récupération variables pour les espèces hydrophobes. Notamment, la MD est la seule technique capable d’isoler sélectivement la taille de grandesbiomolécules 25. Des études comparatives sur le dialysat collecté à proximité de l’adventite vasculaire par rapport à l’hémorragie révèlent des profils distincts de lactate et de sérotonine, validant ainsi la stabilité et la spécificité de l’approche MD.

Des études animales ont montré que, régulé synergiquement par le cœur et les poumons, l’ISF peut circuler dans les adventites associées aux grandes artères, veines et nerfspériphériques 5,9. Habituellement, l’ISF contient des métabolites dérivés directement du plasma ainsi que synthétisés localement dans lestissus 26,27,28. Il est donc plausible que les chevauchements et différences identifiés entre les métabolites dans l’AISF et le plasma représentent l’implication du système circulatoire de l’ISF dans le transport et l’élimination des nutriments et métabolites dans les tissus le long du vascularit. La technique basée sur la microdialyse introduite ici pour l’échantillonnage de l’AISF améliorera significativement les études de la circulation systémique de l’ISF dans la régulation du métabolisme dans plusieurs organes et tissus à travers le corps.

La membrane de coupure de poids moléculaire (MWCO) de 20 kDa utilisée dans cette étude est idéalement conçue pour la récupération quantitative de petits métabolites, dont le glucose, le lactate, le pyruvate et les acides aminés. Cependant, elle sous-échantillonne systématiquement ou exclut totalement de nombreuses macromolécules biologiquement significatives, telles que les cytokines, les chimimokines, les facteurs de croissance et les enzymes extracellulaires. Des revues cliniques et méthodologiques ont souligné que les cathéters standards de 20 kDa sont efficaces pour collecter de petits métabolites hydrophiles, mais ils présentent de faibles taux de récupération pour les protéines et les médiateursinflammatoires 29. Par conséquent, des membranes avec des MWCO plus élevés (par exemple, 100 kDa) ou des stratégies d’échantillonnage alternatives sont nécessaires pour une quantification précise descytokines 30,31. Par conséquent, les recherches futures menées par notre groupe utiliseront des membranes avec des MWCO plus grands pour caractériser la composition macromoléculaire du fluide interstitiel périphérique. Dans cette étude, des dialysats ont été prélevés sous anesthésie générale. La microdialyse a déjà été validée chez des animaux éveillés et en mouvement libre, et plusieurs techniques de micro-perfusion « à flux ouvert » ont été adaptées pour une utilisation dans les modèlesconscients 32. Cependant, adapter notre conception de la sonde et notre protocole d’implantation pour une utilisation chez les animaux éveillés nécessitera de relever les défis liés à l’attachement, au stress animal, à la stabilité de la sonde, aux artefacts de mouvement et à la permanence à long terme. Nous sommes actuellement en train de développer un système léger de câble pivotant et prévoyons de réaliser un échantillonnage conscient lors de notre prochaine étude.

Déclarations de divulgation

Il n’y a pas de conflits d’intérêts financiers à divulguer.

Remerciements

Ce travail a été financé par le Programme national clé de recherche et développement de Chine (2025YFC3507601) et les Fonds de recherche fondamentale des instituts centraux de recherche en bien-être public (n° ZZ-YC2023007).

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Système de surveillance ECGAD Instruments, AustraliePowerLabÉquipement
PincesF.S.T. (Fine Science Tools) Allemagne11252-00Instruments chirurgicaux
Héparine sodiqueSigma-Aldrich, États-Unis9041-08-1Matériel
Spectromètre de masse en tandem à haute performance chromatographie liquide (HPLC-MS/MS)SCIEX, États-UnisExionLC-20ACÉquipement
Ciseaux standards IRISF.S.T. (Fine Science Tools) Allemagne14060-09Instruments chirurgicaux
IsofluraneSciences de la vie à la propulsion arrière, RPCR510-22-10Matériel
Système d’anesthésie à faible débitKent Scientific, États-UnisSomnoSuiteÉquipement
Fluide de perfusion de microdialyse T1Microdialyse CMA, SuèdeP000034Matériel
Sonde de microdialyse, 20 EliteMicrodialyse CMA, Suède8010436Matériel
Seringues de microdialyse 1 mL GastightMicrodialyse CMA, Suède8309020Matériel
Collecteur de fractions réfrigéréMicrodialyse CMA, Suède470Équipement
Tubulure fendue pour les sondes CMA 20Microdialyse CMA, Suède8309019Matériel
Microscope stéréoscopiqueOlympus, JaponSZ61Équipement
Pompe à seringueCMA MD AB, Suède800310Équipement

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