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Article de méthode

Développement et validation d’une méthodologie pour l’établissement de modèles de rats obèses avec pancréas gras typique

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DOI :

10.3791/69553

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11 novembre 2025

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1Key Laboratory of Acupuncture and Medicine Research of Ministry of Education, Nanjing University of Chinese Medicine, 2Department of Acupuncture and Moxibustion, Yangzhou TCM Hospital Affiliated to Nanjing University of Chinese Medicine, 3Department of Specialty Medicine, Ohio University, 4Research Department, Swiss University of Traditional Chinese Medicine

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Cette étude propose une méthode reproductible et standardisée afin d’établir des modèles de rats obèses présentant une obésité simple, généralement caractérisée par un pancréas graisseux. Il comprend également des protocoles détaillés pour l’échantillonnage des tissus pancréatiques et l’immunohistochimie.

Résumé

L’obésité est devenue une épidémie de santé mondiale prédominante, près de la moitié de la population mondiale étant désormais classée comme en surpoids ou obèse. Une caractéristique pathologique clé chez les personnes obèses est le dépôt ectopique de lipides dans les tissus non adipeux, y compris le pancréas, une affection appelée stéatose pancréatique ou pancréas graisseux. Dans les modèles de rongeurs induits par un régime riche en graisses (HFD), la stéatose pancréatique précède systématiquement la stéatose hépatique, soulignant la susceptibilité particulière du pancréas à l’accumulation de lipides. Cette implication précoce positionne le pancréas comme un organe essentiel pour comprendre la dérégulation métabolique dans l’obésité. Bien que les rats obèses induits par l’alimentation (DIO) récapitulent les aspects fondamentaux de la progression de la maladie humaine, les modèles animaux bien caractérisés qui présentent de manière fiable ce phénotype pancréatique restent rares dans la littérature.

Une considération méthodologique importante dans la modélisation de l’obésité humaine est le moment de l’introduction de la HFD. De nombreux modèles existants initient l’HFD pendant la période de sevrage, ce qui peut introduire des effets confondants de programmation métabolique développementale qui ne reflètent pas entièrement l’obésité humaine, qui se développe principalement après le développement. En revanche, la présente étude établit un protocole standardisé dans lequel le HFD est introduit après le sevrage. Cette approche imite plus précisément la trajectoire humaine commune de l’apparition de l’obésité à l’âge adulte, évite les adaptations métaboliques au début de la vie et entraîne une progression plus pertinente sur le plan physiologique vers la stéatose pancréatique.

Cette recherche fournit un cadre détaillé et reproductible pour générer un modèle d’obésité chez le rat caractérisé par une pathologie proéminente du pancréas graisseux. La méthodologie comprend une phase d’acclimatation d’une semaine, une période d’induction de 14 semaines de HFD commençant après le sevrage et un prélèvement systématique de tissus. Deux voies de traitement tissulaire sont décrites : la congélation instantanée pour les analyses moléculaires (par exemple, le western blot) et la fixation par perfusion de paraformaldéhyde pour les évaluations morphologiques (par exemple, IHC, H&E). Ce modèle offre une plate-forme solide pour les investigations mécanistes sur le dysfonctionnement métabolique pancréatique associé à l’obésité.

Introduction

L’obésité simple est définie comme une obésité qui existe indépendamment sans autres comorbidités, principalement attribuée à un déséquilibre énergétique résultant de modes de vie malsains, tels que des habitudes alimentaires inappropriées et une activité physique insuffisante1. L’obésité contribue de manière significative à l’incidence croissante des maladies non transmissibles chez les populations plus jeunes, caractérisée par des taux de prévalence élevés, une apparition précoce et des complications multisystémiques, ce qui en fait un défi de santé publique mondial critique2. Le pancréas graisseux est une affection caractérisée par un dépôt ectopique de lipides dans cet organe non adipeux lors d’une dérégulation métabolique. Le pancréas graisseux reflète une interaction critique entre le tissu adipeux et la physiopathologie pancréatique. L’accumulation excessive de graisse pancréatique déplace les tissus acineux et les îlots pancréatiques normaux, induisant une double déficience fonctionnelle des capacités exocrines et endocriniennes 3,4. Ce processus pathologique perturbe les rapports α/β-cellules, favorise la dédifférenciation des cellules β avec perte ultérieure de la fonction sécrétoire de l’insuline5 et médie les dommages lipotoxiques directs aux cellules β6. Parallèlement, la prolifération des cellules α et la libération d’insuline déréglée exacerbent l’instabilité glycémique, accélérant la progression vers le diabète sucré de type 2 (DT2) et ses complications associées7.

L’étude de la pathogenèse du pancréas adipeux révèle de nouveaux mécanismes sous-jacents à la progression des maladies métaboliques8. Alors que des recherches antérieures sur l’obésité mettaient l’accent sur la stéatose hépatique, de nouvelles preuves identifient le dépôt de lipides pancréatiques comme un événement précoce dans la dysrégulation métabolique9. Ce changement de paradigme permet la construction d’un modèle de pathologie bi-organe pour l’obésité simple, intégrant la stéatose pancréatique et hépatique10. L’étude de leur diaphonie peut élucider des voies critiques à travers le spectre de la maladie couvrant les troubles du métabolisme des lipides, l’obésité, la résistance à l’insuline et le diabète, offrant ainsi de nouvelles perspectives sur les mécanismes de la maladie11. Dans le processus pathologique du pancréas, la manifestation initiale est un dépôt important de graisse pancréatique, accompagné d’une expansion substantielle des adipocytes pancréatiques. Ceci est principalement observé dans la face ventrale de la tête pancréatique, du cou et du corps, et est principalement situé dans les zones interstitielles entre les cellules acineuses et des îlots. Parallèlement, une inflammation chronique de bas grade du pancréas est présente, tandis que les fonctions endocriniennes et exocrines restent largement intactes à ce stade 12,13. Une infiltration graisseuse étendue altère davantage la fonction des cellules β pancréatiques par lipotoxicité et supprime l’activité de l’insuline. Au cours de cette phase, les cellules acineuses sont progressivement remplacées par des adipocytes, contribuant ainsi au développement du DT214,15. Bien que le diabète sucré ne soit pas un facteur de risque indépendant du cancer du pancréas, les patients ayant des antécédents de pancréatite aiguë et de diabète présentent un risque significativement élevé de développer un cancer du pancréas16.

Les analyses anatomiques macroscopiques quantifient la gravité de la stéatose pancréatique et les modèles d’infiltration, tandis que les évaluations IHC au niveau microscopique caractérisent la morphologie des cellules acineuses, le positionnement nucléaire, la fréquence de vacuolisation et la dynamique de la population cellulaire17. Cette approche multimodale, qui s’étend de l’observation anatomique macroscopique à l’IHC à résolution cellulaire, permet une stadification complète de la pathologie pancréatique tout au long de la progression de la maladie. La présente étude détaille un protocole standardisé englobant une acclimatation d’une semaine, une induction de l’obésité de 14 semaines chez des rats adultes et un traitement optimisé du tissu pancréatique pour l’analyse morphologique, établissant un cadre solide pour l’étude des troubles métaboliques associés à la stéatose.

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Protocole

La procédure de traitement des animaux a été approuvée par le Comité d’éthique animale de l’Université de médecine traditionnelle chinoise de Nanjing (202006A016) et est conforme aux directives ARRIVE (Recherche animale : Rapport d’expériences in vivo), aux directives éthiques, aux directives sur le fonctionnement de la loi de 1986 sur les animaux (procédures scientifiques) et aux directives associées, à la directive européenne 2010/63 pour la protection des animaux utilisés à des fins scientifiques. Tous les animaux de laboratoire ont été anesthésiés conformément aux procédures d’anesthésie approuvées pour les rongeurs avant la dissection. La procédure a été organisée en trois volets distincts.

1. Établir un modèle de rat obèse

  1. Animaux d’expérimentation et groupes
    1. Sélectionner des rats Sprague-Dawley (SD) mâles âgés de 4 semaines (80-120 g) d’une souche sensible à un régime riche en graisses (HFD).
    2. Acclimatez tous les rats à un régime d’entretien pendant une semaine, puis divisez-les au hasard en deux groupes : le groupe témoin et le groupe modèle.
    3. Remplacez le régime d’entretien par un HFD pour le groupe modèle après une semaine, tout en maintenant le groupe témoin sur le régime d’origine. Maintenez les deux groupes dans leur régime pendant 14 semaines. La composition de la HFD est détaillée dans le tableau 1, et la formulation standard de l’aliment d’entretien est dans le tableau 2.
  2. Conditions d’alimentation et paramètres expérimentaux
    1. Paramètres environnementaux : température 22 ± 2 °C, humidité 50 ± 10 %, cycle lumière/obscurité 12 h et libre accès à l’eau et à la nourriture.
  3. Indicateurs de suivi
    1. Enregistrez votre poids corporel et votre apport alimentaire chaque semaine à une heure fixe.
      REMARQUE : Le faire le soir peut minimiser le stress et s’aligner sur les schémas d’activité diurne/nocturne18.
    2. Tracez une courbe de croissance du poids corporel à l’aide des données enregistrées.
    3. Définir une modélisation réussie de l’obésité comme lorsque le poids corporel dépasse 20 % du groupe témoin du même âge.
IngrédientContenu (g/kg)Principaux nutriments apportés
Aliments ordinaires en poudre365Apport nutritionnel de base en glucides, protéines végétales, graisses, complexes vitaminiques, minéraux, etc
Saindoux310Acides gras saturés, Acides gras insaturés
Caséine250Acides aminés essentiels
Cholestérol10Cholestérol
Mélange de cellulose et de minéraux60Fibres, calcium, phosphore, sodium, etc.
DL-Méthionine Méthionine/Acides aminés Méthionine3Acides aminés essentiels
Levure1Vitamines B, β-glucane, etc
NaCl1NaCl

Tableau 1 : Formulation spéciale HFD pour l’établissement de DIO dans des modèles de rats. Le tableau détaille la composition spécifique de la HFD utilisée dans cette étude pour le groupe modèle, qui a été administré de la fin de la période d’acclimatation jusqu’au prélèvement tissulaire.

IngrédientContenuUnité
Humidité12.196%
Protéines brutes (CP %)18.272%
Énergie digestible (DE)3.186Mcal/kg
Énergie métabolisable (EM)2.939Mcal/kg
Énergie nette (NE)2.228Mcal/kg
Extrait d’éther (EE %)4.417%
Fibres brutes (CF %)3.677%
Calcium (Ca %)0.991%
Phosphore total0.681%
(Total P %)
Phosphore non phytate0.19%
Sel0.407%
Lysine1.118%
Digestible Lysine0.813%
Méthionine0.53%
Thréonine0.779%
Tryptophane0.221%
Cuivre (Cu)22.06mg/kg
Fer (Fe)173.69mg/kg
Manganèse (Mn)102.1176mg/kg
Zinc (Zn)60.3687mg/kg

Tableau 2 : Formule d’alimentation d’entretien standard chez le rat. Le tableau présente la formulation de l’aliment d’entretien standard, qui a été fourni à tous les rats pendant la phase d’acclimatation et au groupe témoin pendant toute la durée de l’étude.

2. Prélèvement de tissus

  1. Préparation préopératoire
    1. Traitement à jeun : restriction alimentaire de 12 h avant l’euthanasie pour minimiser l’interférence du contenu intestinal avec les analyses biochimiques.
    2. Anesthésie : Administrer de l’isoflurane par inhalation pour une anesthésie profonde (concentration d’induction de 4 %, concentration d’entretien de 1,5 à 2 %). L’appareil d’anesthésie était équipé d’un vaporisateur d’isoflurane, et la concentration de l’anesthésique était maintenue à 1,5-2. À titre de référence pour la préparation, la consommation physique d’isoflurane liquide était d’environ 0,5 mL à 0,8 mL par rat pour l’ensemble de la procédure.
    3. Surveillez la profondeur de l’anesthésie : suivez en permanence la fréquence respiratoire et les réflexes cornéens. Maintenez un état anesthésique soutenu tout au long de la procédure pour prévenir l’autolyse pancréatique post-mortem.
    4. Gérer une anesthésie insuffisante : Si la profondeur de l’anesthésie est insuffisante ou si la conscience réapparaît, administrez immédiatement de l’uréthane à 20 % par voie intrapéritonéale pour une anesthésie supplémentaire (50 mg/kg) et vérifiez à nouveau les signes vitaux avant de continuer. Préparez une solution d’uréthane à 20 % en dissolvant la poudre d’uréthane dans une solution saline.
      REMARQUE : L’anesthésie à l’isoflurane est la méthode conforme aux exigences éthiques du Centre des animaux expérimentaux de l’Université de médecine chinoise de Nanjing. Pour cette procédure terminale, l’injection intrapéritonéale de 20 % d’uréthane peut être utilisée comme alternative acceptable. Cependant, les preuves existantes suggèrent que l’isoflurane pourrait offrir un profil d’innocuité plus élevé que la kétamine chez les rongeurs19.
  2. Prélèvement de tissus frais
    1. Désinfection de la peau : Vaporisez rapidement de l’éthanol à 75 % sur l’ensemble du corps (1 à 2 s) pour éviter la contamination des organes abdominaux par les cheveux.
    2. Fixation de la position : Positionnez le rat en décubitus dorsal sur la table de dissection et fixez solidement les quatre membres à l’aide d’épingles à grosse tête.
    3. Saisissez la peau abdominale avec une pince dans votre main gauche et incisez la peau le long de la ligne médiane (de la xiphoïde au pubis) à l’aide de ciseaux dans votre main droite. Disséquez brutalement le fascia sous-cutané pour séparer le tissu conjonctif et coupez à travers le muscle droit de l’abdomen et le péritoine le long de la même ligne médiane.
    4. Identification du pancréas : Déplacez doucement l’intestin vers la gauche pour visualiser l’estomac, la rate et le duodénum. La rate est attachée à la queue du pancréas et l’estomac est proche du pancréas.
    5. Dissection rapide : Élevez doucement la rate à l’aide d’une pince et isolez le pancréas en coupant progressivement ses attaches à la rate, à l’estomac et au mésentère duodénal. En raison de sa texture fragile, évitez le clampage direct du parenchyme pancréatique et préservez les canaux pancréatiques/vaisseaux sanguins pour éviter la déchirure des tissus.
    6. Conservation des tissus : Rincez rapidement le pancréas disséqué avec du PBS (1× solution saline tamponnée au phosphate, PH 7,4) ou une solution saline pour éliminer le sang résiduel. Transférez immédiatement le pancréas dans un tube de congélation de 2 ml, immergez-le dans l’azote liquide dans les 30 s et stockez-le à long terme à -80 °C.
    7. Euthanasie et élimination des carcasses Après le prélèvement de tissus, euthanasier tous les rats expérimentaux par luxation cervicale. Selon la réglementation du Centre des animaux expérimentaux de l’Université de médecine chinoise de Nanjing, les carcasses d’animaux sont classées comme déchets biomédicaux pathologiques (Code des déchets : 831-003-01). Scellez toutes les carcasses d’animaux dans des sacs hermétiques conformément à la réglementation et rangez-les uniformément dans les congélateurs désignés. L’élimination centralisée et respectueuse de l’environnement sera effectuée par l’université. En aucun cas, les carcasses ne doivent être jetées arbitrairement.
      REMARQUE : Éviter l’exposition à la température ambiante pour éviter la dégradation enzymatique des biomolécules20,21.
  3. Prélèvement de tissu de perfusion (les autres étapes sont les mêmes)
    1. Exposez le cœur : Soulevez le tissu cutané du rat avec votre main gauche et ouvrez la cavité thoracique avec votre main droite pour exposer complètement le cœur.
    2. Préparez le ventricule gauche pour la perfusion : Faites une petite incision sur le ventricule gauche (taille correspondant au diamètre de l’aiguille de perfusion) et incisez le pavillon droit pour permettre l’écoulement du sang.
    3. Perfusion saline : Insérer doucement l’aiguille de perfusion dans le ventricule gauche et perfuser lentement 100 mL de solution saline à un débit de 10 mL/min jusqu’à ce que l’écoulement auriculaire droit devienne clair.
    4. Fixateur de perfusion : Passer à 200 mL de fixateur de paraformaldéhyde à 4 %, débit : 5 mL/min. Perfuser chaque rat avec 100 mL de solution saline, suivi de 200 mL de paraformaldéhyde à 4 %. Cette étude a utilisé une solution de PFA préparée commercialement. En raison de l’instabilité du PFA en solution, avec un potentiel de variabilité important en fonction de la préparation et de la fraîcheur, la solution liquide doit être protégée de la lumière et conservée à 4 °C. Utilisez rapidement une aliquote ouverte pour assurer l’efficacité. Si elle est préparée à partir de poudre, la solution doit être fraîchement préparée immédiatement avant utilisation.
      REMARQUE : Portez des gants, des lunettes de protection et une blouse de laboratoire. Effectuer dans une hotte car le paraformaldéhyde est toxique. Selon la réglementation du Centre des animaux expérimentaux de l’Université de médecine chinoise de Nanjing, les déchets de paraformaldéhyde sont classés comme déchets biomédicaux chimiques (Code des déchets : 831-004-01). Après utilisation, il doit être stocké dans un conteneur à déchets dédié étiqueté avec le symbole de danger biologique. L’élimination centralisée est effectuée par l’université. En aucun cas, il ne doit être jeté de manière inappropriée.
    5. Confirmer le succès de la perfusion : Vérifier la rigidité des membres indiquant une fixation efficace.
    6. Placez le pancréas dans un tube à centrifuger de 50 ml contenant 30 ml de solution de paraformaldéhyde à 4 %. Fixez le tissu en stockant le tube immobile dans l’obscurité pendant 2 à 4 h.
    7. Transférez le pancréas dans un nouveau tube à centrifuger de 50 ml contenant 30 ml de solution d’éthanol à 70 %. Maintenez le tube immobile et à l’abri de la lumière pendant environ 20-24 h22.
    8. Incorporation de paraffine : Incorporez les tissus dans de la cire de paraffine. Conservez les mouchoirs incrustés à 4 °C ou -20 °C.
      REMARQUE : Cette étude a utilisé des coupes en paraffine. Les sections congelées sont une alternative valable, mais les performances des anticorps doivent être vérifiées au préalable pour le type de section spécifique afin de garantir des résultats optimaux.

3. Coloration immunohistochimique (IHC) du pancréas

  1. Protocole de sectionnement et de montage
    1. Coupes de paraffine : Découper des coupes de tissu à une épaisseur de 6 μm à l’aide d’un microtome et les monter sur des lames de verre.
    2. Méthode de flottaison : Faites flotter les sections sur un bain de flottation de tissu à 40 °C pour lisser les rides.
    3. Prélèvement de tissus : Montez les sections sur des lames enduites d’adhésif (2-3 par lame) et séchez-les sur un chauffe-lames à 80 °C.
    4. Séchage sur lames : Transférez les lames avec sections montées dans un four à 60 °C pendant la nuit après le sectionnement.
  2. Protocole de déparaffinisation et de réhydratation
    1. Placer les diapositives dans un support à diapositives et les immerger séquentiellement comme suit : xylène I, 7 min ; xylène II, 7 min ; éthanol anhydre, 5 min ; 90 % éthanol, 5 min ; 85 % d’éthanol, 5 min ; 75 % d’éthanol, 5 min ; eau distillée, 5 min ; PBS, 5 min (trois fois).
      REMARQUE : Effectuez des pas au xylène dans une hotte avec des gants et des lunettes de protection. Éliminer les déchets de xylène en suivant le protocole identique spécifié pour le paraformaldéhyde à l’étape 2.3.4.
  3. Protocole de récupération d’antigènes
    1. Préparation de la solution de citrate de sodium : Préparez un tampon de citrate de sodium (pH 6,0). Nous avons utilisé une solution tampon de citrate de sodium préparée par nos soins en dissolvant un sachet de poudre dans 1 L d’eau.
    2. Micro-ondes séquentiellement : Placez les lames dans un bocal en verre rempli d’une solution tampon de citrate de sodium pour couvrir les lames, puis placez le bocal dans le micro-ondes. Les échantillons ont été soumis à un traitement par micro-ondes dans l’ordre suivant : chaleur moyenne (600 W) pendant 8 min, suivie d’un repos sans chauffage pendant 8 min, et enfin d’une chaleur basse (300 W) pendant 7 min.
    3. Refroidir naturellement à température ambiante : Laissez le récipient refroidir naturellement à température ambiante.
    4. PBS : Rincez les lames dans du PBS pendant 5 minutes deux fois.
  4. Incubation du four
    1. H2O2 : Appliquer 3 % de H2O2 sur les coupes de tissus pendant 10 min pour bloquer l’activité endogène de la peroxydase. Appliquez environ 50 à 80 μL de H2O2 sur chaque lame.
    2. PBS : Lavez les diapositives dans PBS pendant 5 minutes trois fois.
    3. Complexe strept-avidine-biotine-peroxydase (SABC) : Appliquer SABC goutte à goutte sur le tissu et colorer pendant 30 min dans un incubateur à 37 °C. Appliquez environ 50 à 80 μL de SABC sur chaque lame.
    4. PBS : Lavez les diapositives dans PBS pendant 5 minutes trois fois.
  5. Rendu des couleurs
    1. 3,3'-diaminobenzidine (DAB) : Appliquer une solution chromogène de DAB sur les coupes de tissus et surveiller jusqu’à ce qu’une coloration jaune brunâtre se développe. Teintez les sections pendant environ 1 à 5 min. Ajustez la durée de coloration en fonction de la spécificité du tissu et de la température ambiante. Pour le tissu pancréatique, un temps de coloration de 2 min à 22 °C est recommandé.
    2. Rinçage : Le rinçage glisse immédiatement sous un léger jet d’eau distillée pour arrêter la réaction.
    3. Immerger : Immerger les lames dans de l’eau distillée pendant 5 minutes pour éliminer les réactifs résiduels.
  6. Coloration à l’hématoxyline
    1. Hématoxyline : Immerger les lames dans l’hématoxyline pendant 1 min. La solution d’hématoxyline est préparée à l’aide d’eau pure à raison de 56 mg/mL.
    2. Rinçage : Rincer deux fois les lames à l’eau distillée (5 s par rinçage).
    3. Différenciation acide chlorhydrique-alcool : Différencier les lames dans la solution de différenciation acide chlorhydrique-alcool pendant 1 s.
    4. Immerger : Immerger les lames dans l’eau du robinet pendant 10 minutes pour développer une coloration nucléaire bleue stable.
  7. Déshydratation : Déshydratez les lames séquentiellement à travers les solutions suivantes : éthanol à 70 %, éthanol à 80 %, éthanol à 90 %, éthanol anhydre, xylène I et xylène II, pendant 3 minutes dans chaque solution, respectivement.
    REMARQUE : Effectuez des pas au xylène dans une hotte avec des gants et des lunettes de protection.
  8. Scellement
    1. Montez les sections avec du baume neutre : Appliquez du baume neutre sur la lame à l’aide d’un compte-gouttes à bulbe en caoutchouc. Couvrir avec une lamelle. Évitez de comprimer l’ampoule avec force pour éviter la formation de bulles. Appliquez environ 50 μL de baume neutre sur chaque lame.
    2. Séchage à l’air libre : Placez les lames dans une hotte pendant la nuit pour permettre à la résine neutre de sécher complètement.

4. Analyse par western blot (WB)

  1. Décomposition des tissus
    1. Prenez 200 mg de tissu pancréatique de rat, placez-le dans un tube de broyage de 2 ml contenant 1 ml de tampon de lyse et 3 petites billes d’acier. Le tampon de lyse est composé d’un cocktail complet d’inhibiteurs de protéase et d’un tampon de lyse RIPA. Le rapport de mélange est de 1 comprimé d’inhibiteur de protéase : 50 mL de tampon de lyse RIPA.
    2. Le broyage a été effectué à l’aide d’un broyeur à boulets avec les paramètres suivants : fréquence : 30/s ; temps : 30 s ; 10 à 15 fois. Jusqu’à ce qu’aucune particule blanche ne soit visible à l’œil nu.
    3. Transférez le surnageant protéique supérieur dans un tube de micro-centrifugeuse de 1,5 ml, sans prendre de mousse. Centrifugez-le avec 16900 x g 30min, 4 °C.
      REMARQUE : Des homogénats pour l’analyse par transfert Western ont été préparés à partir de l’ensemble du pancréas.
  2. Quantification des protéines : Quantifiez la concentration en protéines à l’aide du kit de dosage des protéines Pierce BCA selon les instructions du fabricant. Le rapport de mélange pour la solution de travail BCA est la solution A : Solution B = 50:1.
  3. Électrophorèse des protéines :
    1. Ajouter les échantillons de protéines pancréatiques préparés (un volume de 6 μL a été chargé dans chaque voie) à du dodécylsulfate de sodium-polyacrylamide gel-Young PAGE, Bis-Tirs, 10 × 8, pour l’électrophorèse.
    2. Fonctionnement à 70 V pendant 0,5 h, puis fonctionnement à 110 V pendant 1 h à l’aide du système Mini-PROTEAN Tetra. Diluez le tampon d’électrophorèse MOPS liquide 20×avec de l’eau pure à une concentration de 1×.
  4. Transfert membranaire
    1. Diluer le concentré de transfert eBlot L2 5× à 1× concentration de travail avec de l’eau pure. Ce tampon de transfert de 1× peut être réutilisé jusqu’à 3 fois. Diluer le concentré d’équilibre eBlot L2 5× à 1× concentration de travail avec de l’eau pure.
    2. Coupez une membrane PVDF (Immobilon-P Transfer Membrane) à la taille appropriée (par exemple, 7,5 cm × 5,5 cm). La taille des pores est de 0,45 um.
    3. Versez environ 30 ml de méthanol dans une boîte d’incubation de 90 × 60 × 32 mm. Plongez la membrane PVDF dans le Méthanol pendant 5 s pour l’activer.
    4. Versez environ 30 ml de la solution 1x balance préparée dans une autre boîte d’incubation propre. Retirez délicatement le gel des plaques d’électrophorèse et placez-le dans la solution d’équilibre.
    5. Transférez la membrane PVDF activée du méthanol et placez-la également dans la boîte d’incubation contenant la solution d’équilibre. Assurez-vous que la membrane est positionnée sous le gel pour un bon contact. Permettez aux deux de s’équilibrer.
    6. En suivant les instructions du fabricant de l’appareil de transfert, placez le « sandwich » de transfert dans cet ordre de haut en bas : éponge, gel, membrane PVDF, éponge. Assurez-vous qu’aucune bulle d’air n’est piégée entre les couches. Placez correctement la pile de transfert assemblée dans la chambre de l’appareil de transfert. Branchez l’alimentation électrique et exécutez le transfert en mode standard pendant 15 min.
  5. Bloquer
    1. Préparez deux boîtes d’incubation, l’une contenant environ 15 mL de TBST (solution saline tamponnée Tris-Tween20), et l’autre avec environ 15 mL de solution bloquante de BSA à 5 %.
    2. Préparation de la solution de TBST : Dissoudre un sachet de poudre saline tamponnée Tris dans 2 L d’eau pure, puis ajouter 2 mL de Tween 20.
    3. Placez la membrane PVDF dans la solution TBST, en vous assurant que le côté qui était en contact avec le gel est orienté vers le haut.
    4. Lavez la membrane PVDF sur un shaker à 40 tr/min à température ambiante pendant 3 à 5 min.
    5. Transférez la membrane PVDF dans le tampon de blocage. Bloquez-le sur un shaker à 20 tr/min, à température ambiante pendant 1 h.
  6. Incubation primaire de l’anticorps
    1. Lavez la membrane PVDF dans une boîte d’incubation contenant du TBST, lavez la membrane trois fois pendant 5 min chacune sur un shaker à 40 tr/min à température ambiante.
    2. Incuber avec l’anticorps primaire pendant la nuit (14-18 h) à 4 °C (1:40000, anticorps polyclonal Vinculin) dans une autre boîte d’incubation d’anticorps sur un agitateur à 20 tr/min.
    3. Assurez-vous que l’anticorps est dilué avec une solution bloquant la BSA à 5 %, préparée selon le rapport spécifié dans la section.
  7. Incubation secondaire d’anticorps
    1. Placez la membrane PVDF dans une boîte d’incubation contenant 15 mL de solution de TBST. Lavez la membrane trois fois pendant 5 min chacune sur un shaker à température ambiante, en agitant à 40 tr/min.
    2. Préparez l’anticorps secondaire en diluant l’anticorps anti-IgG de lapin, lié à la HRP à 1:2000 dans un tampon bloquant BSA à 5 %.
    3. Incuber 1 h à température ambiante sur un agitateur à 20 tr/min23.
    4. Lavez la membrane PVDF trois fois avec une solution TBST pendant 5 minutes chacune, en suivant la méthode décrite ci-dessus.
  8. Détection
    1. Préparez la solution de substrat de travail en mélangeant AccuWest ECL Plus, Raegent A et AccuWest ECL Plus, Raegent B à un rapport de volume de 1:1 directement dans une boîte d’incubation. Effectuez toutes les étapes suivantes à l’abri de la lumière.
    2. Incuber la membrane PVDF dans la solution pendant 5 à 10 s, puis détecter immédiatement les bandes immunoréactives à l’aide de réactifs de chimiluminescence améliorée (ECL) - Vilber Fusion FX6 MINI. Le temps d’exposition typique varie de 5 à 10 s.

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Résultats

Nous décrivons un protocole reproductible pour établir un modèle d’obésité simple qui présente de manière fiable le pancréas gras (Figure 1). L’ensemble du processus, de l’alimentation des animaux et de la collecte de tissus à la validation moléculaire ultérieure, est résumé schématiquement dans la figure 1. Les changements de poids hebdomadaires du groupe modèle (n = 5) et du groupe témoin (n = 5) ont été enregistrés, et il n’y...

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Discussion

En tant que principal moteur du syndrome métabolique, l’obésité non compliquée représente la manifestation initiale de la dérégulation systémique du métabolisme des lipides. En l’absence d’intervention, il peut évoluer vers un DT2 et de graves complications diabétiques, soulignant la nécessité d’une correction métabolique précoce30. La stéatose pancréatique (pancréas graisseux), un marqueur précoce du dépôt ectopique de lipides dans l’obésité, redéfinit le pancréa...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par le Projet des Héritiers et des Instructeurs pour l’Héritage de l’Expérience Académique du Septième Groupe d’Experts en Médecine Traditionnelle Chinoise de renommée Nationale ; Fondation nationale des sciences naturelles de Chine, projet du Fonds pour les jeunes scientifiques [numéro de subvention 82305376] ; Projet de soutien aux jeunes talents en sciences et technologies dans la province du Jiangsu en 2024 [numéro de subvention JSTJ-2024-380].

Les organigrammes ont été produits à l’aide de FigDraw, Biorender.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
< fort>Matériel
Tube micro-centrifuge de 1,5 mLBiosharp Bioingénierie Co. LtdBS-15-MWB
Tube de congélation de 2 mlLABSELECTCV-002-200-EXWB
Tube de meulage de 2 mlWuhan Servicebio Technology Co., LtdHT-200-MWB
3 % d’H2O2Booster Electronics Technology Co., Ltd.20A23CIHC
4 % de paraformoldéhydeBiosharp Bioingénierie Co. LtdBL539AOpération de dissection du pancréas par perfusion
Solution à 5 % de BSABiofroxx4240GR100IHC
Tube centrifugeuse de 50 mL & nbsp ;Biosharp Bioingénierie Co. LtdBS-500-MPréservation tissulaire
AccuWest ECL Plus, Raegent ANankin Gene Easy Biotechnology Co., Ltd.Q201220WB
AccuWest ECL Plus, Raegent BNankin Gene Easy Biotechnology Co., Ltd.Q201220WB
Éthanol anhydreShanghai SCR-Biotech Co., Ltd.10009257IHC
Anti-IgG du lapin, anticorps lié à HRPTechnologie de signalisation cellulaire.Inc,7074WB
Cocktail inhibiteur de protéase cOmpleteHoffmann-La Roche Ltd  ;82256300WB
CouvertureCITOTEST LABWARE MANUFACTURING Co., LTD10212450CIHC
Solution chromogénique DABBooster Electronics Technology Co., Ltd.AR2017-1IHC
PincesShenzhen RWD Life Science Co., Ltd.SP0007-Mdissection du rat SD
diapositives en verre & nbsp ;CITOTEST LABWARE MANUFACTURING Co., LTD188105IHC
Bocal de teinture en verreShanghai Beyotime Biotechnology Co., Ltd.FG010IHC
HématoxylineShanghai Beyotime Biotechnology Co., Ltd.ST2067-20gIHC
Régime riche en graissesSuzhou Shuangshi Laboratoire Animal Feed Technology Co., Ltd.Tableau1se nourrir d’animaux expérimentaux
Alcool à l’acide chlorhydriqueShanghai Beyotime Biotechnology Co., Ltd.C0163MIHC
isofluraneShenzhen RWD Life Science Co., Ltd.R510-22-10Rats anesthésiés
méthanol   ;Biofroxx67-56-1WB
MOPS Faisant tourner le liquide tampon 20 fois et plus ;Nanjing Genscript Biotechnology Co., Ltd.  ;C36842504WB
Balsam neutreBeijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.G8590IHC
Résine neutreShanghai SCR-Biotech Co., Ltd.G8590IHC
Solution PBSJiangsu Keygen Biotech Corp., LtdKGL2206-500Préservation tissulaire
Kit de test protéique Pierce BCA   ;Thermo Fisher Scientific Inc, Waltham, États-Unis.ZB382867
Kit de test protéique Pierce BCA   ;hermo Fisher Scientific Inc, Waltham, États-UnisZB382867WB
Cocktail inhibiteur de protéaseHoffmann-La Roche Ltd  ;82256300
Membrane PVDF (Membrane de transfert Immobilon-P, Millipore, 0000380346) et nbsp ;Merck Millipore0000380346WB
Tampon de lyse RIPABiosharp Bioingénierie Co. LtdBL504A, 70096436WB
SABCBooster Electronics Technology Co., Ltd.20C03AIHC
SalinSHANXI SHENGAO ANIMAL PHARMACEUTICAL CO., LTD. & nbsp ;270071460Préservation tissulaire
Mâles rats SDJiangsu GemPharmatech Co., Ltd.  ;D000017rats
Citrate de sodiumMerck Life ScienceS1804IHC
Alimentation de maintenance standardSuzhou Shuangshi Laboratoire Animal Feed Technology Co., Ltd.Tableau2se nourrir d’animaux expérimentaux
le reste concentre eBlot L2 5 fois ;Nanjing Genscript Biotechnology Co., Ltd.  ;C97212410  ;WB
le transfert concentré eBlot L2 5 fois ;Nanjing Genscript Biotechnology Co., Ltd.  ;C97211504WB
Tris Sérum Tamponné, Poudre & nbsp ;Biosharp Bioingénierie Co. LtdBL602AWB
Préadolescent 20BiofroxxEZ681A3EA8WB
UréthaneSigma-Aldrich Co., Ltd.U2500-100GRats anesthésiés
Anticorps polyclonal de vinculineProteintech Group, Inc,26520-1-APWB
XylèneNankin Reagent CorporationC0430530223IHC
Young PAGE, Bis-Tirs, 10 et fois ; 8Nanjing Genscript Biotechnology Co., Ltd.  ;C33152505WB
Équipement
Machine d’anesthésieShenzhen RWD Life Science Co., Ltd.Modèle R5805Rats anesthésiés
Moulin à balles  ;Retsch Technology GmbH - MicrotracMM400WB
CentrifugeusesEppendorf SE5418RWB
Sécheur de tissus biologiques informatiséZhejiang Jinhua Kedi Instrument Co.SC2013-G-KITIHC
réactifs à chimiluminescence améliorée (ECL)   ;VILBER BIO-IMAGERIE00170961WB
microtome  ;Thermo Fisher Scientific Inc, Waltham, États-Unis.HM325IHC
micro-ondesShanghai Boxun Industry Co., Ltd.  ;97000IHC
Système Mini-PROTEAN TetraBio-Rad Laboratories, Inc.1658004WB
FourShanghai Jinghong Scientific Co., Ltd.DNP-9082IHC
Eau pureSichuan UPT Ultra-Pure Technology Co., Ltd.ULUP-TEZIHC

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