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Article de recherche
Une formule d’lavement à base de plantes combinant Sanguisorba officinalis, Bletilla striata et Acacia catechu a été évaluée à l’aide d’un profilage LC-MS/MS, d’un docking S100β, d’un modèle de colite DSS et de glie entérique activée par LPS/IFN-γ. La formule a activé S100β, supprimé l’activation gliale et réduit l’expression p-NF-κB/iNOS, indiquant une amélioration via l’axe S100β-RAGE-NF-κB.
L’activation des cellules gliales entériques (EGC) contribue à la pathogenèse de la colite ulcéreuse (CU). Cette étude a examiné si le Dibai Enema Liquid (DBE) – un lavement à base de plantes combinant Sanguisorba officinalis, Bletilla striata et Acacia catechu – module l’inflammation provoquée par l’EGC. Les profils LC-MS/MS des constituants DBE et des composés priorisés ont été amarrés à S100β. L’efficacité a été évaluée dans la colite murine induite par le sulfate de sodium (DSS) de dextrane en utilisant le poids corporel, la longueur du côlon, l’histopathologie et les niveaux de cytokines (ELISA). Les marqueurs d’activation gliale ont été mesurés par immunohistochimie, localisation par immunofluorescence, PCR quantitative (qPCR) et immunoblotting. Un modèle in vitro a utilisé le CRL-2690 entérique gliale activé avec du lipopolysaccharide plus de l’interféron-γ, avec un sérum de rat contenant une DBE (15 %) comme intervention. L’amarrage suggérait une forte liaison prédite de plusieurs composants DBE à S100β. Le DSS a augmenté le TNF-α et l’IL-1β, perturbé les jonctions serrées et élevé S100β/GFAP aux niveaux d’ARNm et de protéines, ce qui correspond à une hyperactivation gliale ; La DBE a considérablement inversé ces changements. In vitro, la DBE a réduit S100β, RAGE, iNOS (NOS2) et phosphorylé NF-κB p65. Collectivement, la DBE semble atténuer la CU en inhibant l’activation de l’EGC et en régulant à la baisse l’axe S100β/RAGE/NF-κB/iNOS, préservant ainsi l’intégrité muqueuse.
La colite ulcéreuse (CU) est un sous-type majeur de maladie inflammatoire de l’intestin (MII) caractérisée par une inflammation muqueuse chronique du côlon, avec une charge mondiale croissante depuis 1990, et la CU représentant une proportion importante des cas de MIIincidentes 1,2. Les manifestations typiques incluent des douleurs abdominales et une diarrhée sanglante, entraînant une détresse physique et psychologique importante ainsi qu’un coût de traitementimportant 3. Bien que les options thérapeutiques se soient élargies, une exposition à long terme à des immunomodulateurs et des biologiques qui suppriment l’immunité systémique est associée à un risque accru de lymphome et d’infections opportunistes, et une proportion de patients reste réfractaire ouintolérante 4. La CU est largement considérée comme une affection à médiation immunitaire dans laquelle la perturbation de l’homéostasie immunitaire muqueuse est centrale à laphysiopathologie 5. Cependant, les preuves accumulées indiquent que les mécanismes immunitaires muqueuses seuls ne suffisent pas à expliquer toutes les caractéristiques de la MII ; le système nerveux entérique (SNE) contribue à l’inflammation intestinale, étendant le concept de maladie à la neuroinflammation au sein de laMII 6.
Les cellules gliales entériques (CEG), qui surpassent en nombre les neurones entériques chez les mammifères adultes, sont désormais reconnues comme des régulateurs clés de l’homéostasie intestinale et de l’inflammation 7,8. Les EGC modulent la fonction de barrière épithéliale en libérant des médiateurs tels que GDNF, TGF-β1, S100β et 15d-PGJ2, influençant ainsi la perméabilité et l’intégritémuqueuse 9. Parmi ces médiateurs, S100β peut activer des cascades en aval — y compris la voie RAGE/NF-κB — menant à des lésions de barrière et à une amplificationinflammatoire 10,11. Les EGC façonnent également les réponses immunitaires en régulant le phénotype des macrophages et la sensibilité viscérale via la connexine-43 et le M-CSF, et en exerçant des effets suppressifs sur les lymphocytes T in vitro, mettant en avant l’activation de l’EGC comme cible thérapeutique facile dans l’UC12,13.
La médecine traditionnelle chinoise (MTC) a été de plus en plus étudiée dans la CU et a montré des bénéfices prometteurs en milieu clinique etexpérimental 14,15. L’association classique de Sanguisorba officinalis (Diyu) et Bletilla striata (Baiji), ainsi qu’Acacia catechu (Ercha), est depuis longtemps documentée pour les troubles dysentériques dans les sources de matière médicale et est inscrite dans la Pharmacopée chinoise pour les indications hémostatiques, analgésiques et cicatrices des plaies. Des études contemporaines rapportent des activités antibactériennes, anti-inflammatoires, antioxydantes et anti-ulcères pour ces plantes centrales, tandis qu’A. catechu présente également des propriétés neuroprotectrices avec la catéchine comme constituant important16,17. Par rapport à l’immunosuppression systémique conventionnelle, une formulation qui engage les voies neuroimmunitaires centrées sur l’EGC pourrait offrir une efficacité complémentaire avec un mécanisme distinct et potentiellement moins de risques systémiques liés ausystème immunitaire 18,19.
Cette étude évalue si la préparation combinée de Diyu, Baiji et Ercha (DBE) atténue l’UC en supprimant l’activation de l’EGC. Une approche intégrée est utilisée : profilage LC-MS/MS non ciblé pour prioriser les constituants, amarrage moléculaire à S100β, validation dans un modèle de colite induite par sulfate de sodium de dextrane, et tests mécanistiques dans les EGC. Les travaux mettent l’accent sur un mécanisme neuro-immunitaire — S100β/RAGE/NF-κB/iNOS — exploré dans les thérapies ultérieures antérieures, et expose des implications pratiques pour la sélection des doses, l’optimisation des formulations et les études translationnelles ultérieures.
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Toutes les procédures animales ont été approuvées par le Comité d’éthique animale de l’Université de médecine chinoise de Pékin [BUCM-2023-0912] et ont été menées conformément aux directives institutionnelles et nationales pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire. Aucun sujet humain n’a été impliqué.
Les réactifs et l’équipement utilisés sont listés dans le tableau des matériaux.
1. Réactifs et matériaux
Des solvants de qualité analytique et des réactifs de qualité biologie moléculaire ont été utilisés partout. Toutes les informations commerciales, y compris les fabricants, les numéros de catalogue et les détails des licences logicielles, sont fournies dans le Tableau des matériaux (xlsx). L’eau pour toutes les préparations était déionisée et filtrée. Tous les tampons étaient préparés frais ou entreposés dans les conditions spécifiées ci-dessous.
2. Configuration de l’équipement et des logiciels
Un système UPLC-MS/MS couplé à un spectromètre de masse quadrupôle à temps de vol ; une centrifugeuse réfrigérée avec rotor à seau pivotant ; un incubateur de CO₂ maintenu à 37 °C, 5 % de CO₂ et une humidité relative de ≥95 % ; un lecteur de microplaques (450 nm) ; un thermocycleur PCR en temps réel ; l’électrophorèse et l’appareil de buvard ; et un microscope à fluorescence avec des filtres fixes d’excitation/émission ont été utilisés. Le contrôle des instruments et l’analyse des données étaient réalisés dans MassLynx v4.2 pour les données chromatographiques et spectrométriques de masse, ainsi que dans AutoDock 4.2 avec AutoDockTools 1.5.7 pour l’amarrage. L’analyse d’image a été réalisée dans ImageJ/Fiji v1.53.
3. Préparation du liquide de lavement Dibai (DBE)
Le mélange à base de plantes composé de Diyu (50 g), Baiji (50 g) et Ercha (20 g) a été grossièrement écrasé et trempé dans 1 200 mL d’eau déionisée à température ambiante pendant 30 minutes pour assurer une hydratation complète. Le mélange trempé a été décocté à ébullition vigoureuse pendant 30 minutes, avec quelques brassages occasionnels pour éviter l’adhérence. La décoction chaude était filtrée à travers une gaze médicale stérile multicouche dans des verrières stériles afin d’éliminer le matériau insoluble. Le filtrat a été concentré sous vide dans un bain-marie ne dépassant pas 45 °C jusqu’à obtenir un concentré correspondant à une concentration finale de 1,98 g/mL (stock à haute dose). Des solutions de travail à dose moyenne et faible à 0,99 g/mL et 0,50 g/mL ont été préparées par dilution avec de l’eau déionisée stérile à des volumes finaux de 100 mL chacune. Chaque solution était passée à travers une membrane de 0,22 μm en conditions stériles, distribuée dans des contenants stériles marqués, puis stockée à 4 °C pendant jusqu’à sept jours. Avant utilisation, les solutions étaient délicatement mélangées ; une apparence acceptable était claire à légèrement opalescente, sans particules visibles.
4. UPLC - Analyse MS/MS de la DBE
La poudre de chaque composant médicinal a été pesée avec précision à 50 mg et extraite avec 1,0 mL de méthanol à 80 % (v/v) par agitation ultrasonique pendant 30 minutes à température ambiante. Les extraits étaient ramenés à température ambiante après la sonication, centrifugés à 15 000 × g pendant 10 minutes à 4 °C, et les surnadants étaient filtrés à travers des membranes de 0,22 μm dans des fioles d’autoéchantillonneur. La séparation chromatographique a été réalisée sur une colonne à phase inversée (2,1 × 100 mm, 1,8 μm ; type C18 à extrémité polaire) maintenue à 35 °C ; marque/modèle et numéro de catalogue sont fournis dans le tableau des matériaux. Phase mobile A : 0,1 % d’acide formique dans l’eau ; phase mobile B : acétonitrile. Débit : 0,30 mL/min ; volume d’injection : 10 μL. Gradient : 5 % B pendant 0-2 minutes ; 5→95 % B de 2 à 20 minutes ; 95 % B pendant 20-23 minutes ; 95→5 % B de 23,0 à 23,1 min ; rééquilibrez à 5 % B jusqu’à 26 minutes (tableau complet du gradient est fourni dans le tableau 1).
La spectrométrie de masse utilisait l’ionisation par électropulvérisation avec commutation positive/négative et l’acquisition indépendante des données avec des scans à basse et haute énergie (MSE). Plage de masse : m/z 100-1 500 ; Tension capillaire : 2,0 kV ; cône d’échantillonnage : 20 V ; température de source : 120 °C ; température de désolvation : 360 °C ; Gaz cône : 50 L/h ; gaz de désolvation : 600 L/h. La fonction haute énergie employait une énergie de collision par paliers de 20 à 50 eV. Les données étaient traitées dans MassLynx v4.2 avec correction de masse de verrouillage et paramètres standards de détection de pics. Une liste complète de 105 composants identifiés (formules moléculaires, m/z observés, temps de rétention et scores de confiance) est fournie dans le Tableau Supplémentaire 1.
5. Amarrage moléculaire
L’amarrage a été effectué en AutoDock 4.2 selon un protocole d’ajustement induit. La structure tridimensionnelle de S100β (PDB 3HCM) a été préparée en retirant des molécules d’eau cristallographiques, en ajoutant des hydrogènes polaires et en attribuant des charges de Kollman. Des structures de ligands représentant des constituants caractéristiques de l’EBC ont été construites, protonées au pH physiologique et minimisées en énergie. Le site de liaison était défini par les coordonnées du ligand natif ; Les résidus d’acides aminés situés à moins de 6 Å autour du ligand natif ont été traités comme flexibles lors de l’amarrage. Les boîtes en grille couvraient toute la poche avec un espacement de 0,375 Å. Les paramètres de l’algorithme génétique lamarckien étaient : taille de la population 150 ; jusqu’à 2,5 × 10⁶ évaluations d’énergie ; 100 passages indépendants par ligand. Les poses finales étaient classées selon l’énergie libre de liaison prédite et regroupées par RMSD ; Les schémas d’interaction (liaisons hydrogène, contacts hydrophobes, interactions π-π) ont été visualisés pour assurer la cohérence avec les complexes S100β connus.
6. Modèle animal de colite induite par le DSS et de traitement DBE
Les souris mâles C57BL/6J (8 semaines, 20-22 g) ont été acclimatées pendant au moins 7 jours à 22 ± 2 °C, 50 % à 60 % d’humidité relative, cycle clair-obscur de 12 heures, avec nourriture et eau à volonté à libitum. Les animaux ont été répartis aléatoirement en six groupes (n = 10/groupe) : témoin, modèle dextran sulfate sodium (DSS), témoin positif à la sulfasalazine (SASP), et traitements DBE à doses faibles, moyennes et élevées. Le personnel responsable de la notation histologique et de la quantification de l’image a été aveuglé à l’allocation de groupes.
La colite expérimentale a été induite par 2,0 % (p/v) de DSS dans de l’eau potable pendant 7 jours, suivie de 1,0 % de DSS pendant 3 jours, puis de l’eau normale pendant 4 jours avant l’euthanasie. L’EBD était administrée une fois par jour par lavement à 10 mL/kg à l’aide d’un cathéter flexible inséré à 2,5 cm dans le rectum ; Les animaux étaient maintenus verticalement pendant 30 minutes pour minimiser les fuites. Les doses quotidiennes de DBE étaient de 12,35, 27,4 et 49,4 g/kg/jour pour les groupes bas, moyen et élevé respectivement ; Le SASP a été administré à 0,5 g/kg/jour en témoin positif. Le poids corporel, la consistance des selles et le sang occulte fécal étaient enregistrés quotidiennement pour calculer l’indice d’activité de la maladie. À l’extrémité, les souris ont été anesthésiées avec du pentobarbital sodique 50 mg/kg i.p. ; Le sang a été prélevé dans le sinus rétro-orbitaire à l’aide de capillaires héparinés ; Les animaux ont été euthanasiés par luxation cervicale. Le côlon a été excisé de la jonction iléocécale vers le rectum, doucement étendu, et la longueur mesurée sous une tension minimale. Les segments représentatifs étaient fixés à 4 % de paraformoldéhyde ; les tissus restants étaient congelés instantanément dans de l’azote liquide et stockés à −80 °C.
7. Préparation d’un sérum contenant des médicaments
Les rats mâles de Sprague-Dawley ont été répartis au hasard en groupes témoins et DBE (n = 6/groupe). Le groupe DBE recevait 12,34 g/kg/jour par gavage oral une fois par jour pendant 7 jours ; Les témoins ont reçu de l’eau purifiée à volume égal. Vingt-quatre heures après la dernière dose, les animaux ont été anesthésés et du sang total a été prélevé sur l’aorte abdominale. Le sérum a été séparé après une coagulation de 30 minutes à température ambiante, suivie d’une centrifugation à 1 500 × g pendant 10 minutes à 4 °C. Les sérums étaient inactifs thermiquement à 56 °C pendant 30 minutes et filtrés à travers des membranes de 0,22 μm dans des conditions stériles avant leur stockage. Le sérum était aliquoté dans des tubes stériles et stocké à −80 °C. Les échantillons hémolysés, identifiés par une absorption élevée près de 414 nm, ont été exclus.
8. Examen histologique (H&E)
Le tissu du côlon fixé dans 4 % de paraformodéhyde pendant 24 heures a été déshydraté par des éthanols gradués, éliminé dans le xylène et intégré dans la paraffine. Les sections (5 μm) ont été coupées, déparaffinées, réhydratées et colorées à l’hématoxyline pendant 5 minutes, bleuies dans l’eau courante pendant 5 minutes, puis contre-colorées à l’éosine pendant 2 minutes. Les lames ont été montées avec de la résine et examinées pour l’architecture cryptique, la densité des cellules gobelet, la continuité épithéliale et l’infiltration inflammatoire. Les modifications représentatives seront indiquées par des flèches/pointes de flèches et définies dans les légendes des figures ; des barres d’échelle (par exemple, 200 μm) et des seuils visuels prédéfinis seront spécifiés dans les légendes.
9. Immunohistochimie (IHC)
Les sections de paraffine ont subi une extraction antigénique dans un tampon de citrate (pH 6,0) pendant 15-20 minutes à 95-98 °C, une trempe de la peroxydase endogène avec du peroxyde d’hydrogène à 3 % pendant 10 minutes, et un blocage avec un sérum normal à 5 % pendant 1 heure à température ambiante. Les anticorps primaires ont été incubés toute la nuit à 4 °C dans une chambre humidifiée. Après lavage, les coupes ont été traitées à l’aide d’un système de détection de streptavidine et de peroxydase, développé avec du DAB pendant 2 minutes (surveillance microscopique), contre-coloré à l’hématoxyline, déshydraté, puis monté. Les témoins négatifs dépourvus de l’anticorps primaire étaient inclus dans chaque lot.
10. Analyse de l’immunofluorescence (FI)
Les sections incrustées dans la paraffine ont été déparaffinisées et soumises à une récupération antigénique dans un tampon EDTA (pH 8,0). Après refroidissement, la liaison non spécifique a été bloquée avec l’albumine sérique bovine à 3 % pendant 1 h à température ambiante. Les sections ont été incubées toute la nuit à 4 °C avec des anticorps primaires contre GFAP (1:500) et S100β (1:200), suivies d’anticorps secondaires conjugués au fluorophore (1:500) pendant 1 heure à température ambiante dans l’obscurité. Les noyaux étaient contre-colorés avec du DAPI, et les lames montées dans un milieu anti-décoloration. Les images ont été capturées en utilisant des objectifs identiques, un temps d’exposition fixe de 100 ms, et un gain du détecteur de 1,0 entre les groupes. L’intensité moyenne de fluorescence a été quantifiée dans ImageJ/Fiji v1.53 après calibration de la taille des pixels, de la soustraction de fond (rayon de la boule roulante de 50 pixels) et de normalisation vers une zone DAPI-positive. Au moins cinq réplicés biologiques par groupe et trois champs non chevauchants par réplicat ont été analysés.
11. Culture cellulaire et traitements
Des cellules gliales enériques de rat (désignation CRL-2690) ont été cultivées dans du DMEM complété avec 10 % de sérum fœtal bovin et 1 % de pénicilline-streptomycine à 37 °C dans un incubateur humidifié contenant 5 % de CO₂. L’identité cellulaire a été confirmée par un profilage double en tandem court, et les cultures étaient exemptes de mycoplasme. Des expériences ont été réalisées aux passages 5 à 15. Les cellules ont été ensemées en plaques à 6 puits à 2,0 × 10⁵ cellules/puits dans un milieu de 2,0 mL/puits et laissées à s’attacher pendant 24 heures. Les groupes expérimentaux étaient : témoin non traité, contrôle par véhicule, modèle, sérum DBE et inhibiteur.
Pour l’induction modèle, les cellules ont été exposées au lipopolysaccharide (LPS, 1 μg/mL) plus IFN-γ (20 ng/mL) pendant 24 heures dans un milieu complet ; la valeur U/mL correspondante pour IFN-γ est indiquée dans le Tableau des matériaux selon la puissance spécifique au lot. Pour le traitement par sérum DBE, les cellules ont reçu un sérum de rat contenant DBE filtré à 0,22 μm (15 % v) (56 °C, 30 min) filtré à 0,22 μm en milieu complet pendant 24 h (plage de dose 5 %-20 % utilisée pour l’optimisation de la viabilité spécifiée dans la section CCK-8). Pour le traitement par inhibiteur, l’inhibiteur sélectif de S100β SBI-4211 (10-50 μM ; 45 μM pour les relevés clés) a été appliqué pendant 24 heures. Les commandes du véhicule ont fait correspondre la teneur en solvant (0,1 % de DMSO (v/v)) avec un milieu par ailleurs identique. Sauf indication contraire, les traitements étaient préparés dans un milieu pré-chauffé (37 °C), et les cellules étaient rincées 2 × avec du PBS avant le remplacement du traitement. Après traitement, les cellules ont été collectées pour l’extraction d’ARN, l’analyse des protéines et l’immunofluorescence, comme détaillé dans les sections suivantes. La réplication biologique était de n ≥ 5 cultures indépendantes par condition.
12. Essai de viabilité des cellules CCK-8
Les cellules ont été ensemencées en plaques de 96 puits à 5 × 10³ cellules/puits dans un milieu de 100 μL et laissées à adhérer toute la nuit. Le milieu a été remplacé par un sérum traité par DBE contenant un médium à 5 %, 10 %, 15 % ou 20 % (v/v) pendant 24 heures. Un réactif CCK-8 (10 μL/puits) a été ajouté, et les plaques ont été incubées pendant 1 heure à 37 °C. L’absorbance a été mesurée à 450 nm avec soustraction à blanc (milieu + réactif, sans cellules). La viabilité était exprimée en pourcentage du contrôle du véhicule. Chaque condition utilisait n ≥ 5 réplications biologiques (cultures indépendantes) avec trois répliques techniques par culture.
13. ELISA pour les cytokines tissulaires
Le tissu du côlon a été homogénéisé sur de la glace dans des inhibiteurs de protéases (1:9, p/v) contenant des protéases. Les homogénéats ont été clarifiés de 12 000 × g pendant 10 minutes à 4 °C ; des supernadants ont été analysés pour IL-1β et TNF-α selon les protocoles du kit. Les standards et les échantillons étaient utilisés en double, et les courbes étaient équipées d’un modèle logistique à quatre paramètres (4PL) avec R² ≥ 0,99 ; des normes rétrocalculées ont été acceptées dans un délai de 85 % à 115 % du nominal. L’absorption était mesurée à 450 nm avec une référence de 620-650 nm lorsque disponible. Les concentrations de cytokines ont été normalisées au poids tissulaire (tissu pg/mg). Chaque groupe comprenait n ≥ 5 réplicés biologiques.
14. PCR quantitative en temps réel (qPCR)
L’ARN total provenant du tissu du côlon (ou des cellules, selon le cas) a été isolé avec un kit de colonne spin-membrane de silice. L’intégrité de l’ARN a été vérifiée par une inspection A₂₆₀/A₂₈₀ = 1,8-2,1 et par gel d’agarose. L’ADNc de première brin a été synthétisé à partir de 1 μg d’ARN avec un retrait d’ADN génomique. qPCR utilisait le mélange maître SYBR Green sur un thermocycleur calibré avec le programme : 95 °C 30 s ; 40 cycles de 95 °C 5 s, 60 °C 30 s ; courbe de fusion de 65 à 95 °C en pas de 0,5 °C/5 s. Le GAPDH servait de contrôle endogène. L’expression relative a été calculée par 2⁻ΔΔCt après vérification des efficacités de l’amorce (90 %-110 %, à partir des pentes de courbe standard). Les contrôles sans RT et sans gabarit étaient inclus. Les séquences d’amorces sont listées dans le tableau 2. Chaque groupe avait n ≥ 5 réplications biologiques et deux répétitions techniques par échantillon.
15. Analyse des taches occidentales
Les protéines issues du tissu (ou des cellules) du côlon ont été extraites dans un tampon RIPA avec des inhibiteurs de protéase/phosphatase et quantifiées par test BCA. Une protéine égale (30 μg/voie) a été dénaturée, résolue sur un gradient SDS-PAGE de 4-20 %, puis transférée en PVDF (0,45 μm ; 0,2 μm pour ≤ cibles de 20 kDa). Les membranes ont été bloquées dans 5 % de lait écrémé pendant 2 h à température ambiante et incubées toute la nuit à 4 °C avec des anticorps primaires contre GFAP (1:1 000), S100β (1:1 000), iNOS (1:1 000), NF-κB p65 (1:1 000), phospho-NF-κB p65 (Ser536, 1:1 000), Occludin (1:1 000), Claudin-1 (1:1 000) et GAPDH (1:5 000). Des anticorps secondaires conjugués à HRP (1:5 000) ont été appliqués pendant 1 h à température ambiante. Les signaux ont été développés avec ECL ; Les temps d’exposition étaient limités à la plage dynamique linéaire (10-90 s). Les transferts ont été vérifiés par une coloration réversible de membrane avant le blocage. Les intensités de bande ont été quantifiées dans ImageJ/Fiji v1.53 après soustraction de fond et normalisées en GAPDH. Poids moléculaires attendus : GFAP ~49 kDa, S100β ~10-12 kDa, NF-κB p65 ~65 kDa, iNOS ~130 kDa, Occludin ~65 kDa, Claudin-1 ~22 kDa, GAPDH ~36-37 kDa. Chaque analyse comprenait n ≥ 5 réplications biologiques.
16. Analyse statistique
Les données ont été analysées dans GraphPad Prism 8.0 et sont présentées en moyenne ± SEM. Pour les comparaisons multigroupes, une ANOVA unidirectionnelle suivie du test post hoc de Tukey a été utilisée ; pour les comparaisons par paires, des tests t de Student à deux queues non appariés ont été appliqués lorsque cela était approprié. Pour les conceptions à cours du temps ou à deux facteurs (par exemple, traitement × dose ou traitement × temps), une ANOVA bidirectionnelle (mesures répétées lorsque applicable) avec correction de Tukey ou Dunnett était utilisée comme spécifié dans les légendes des figures. Les tests de Shapiro-Wilk et Levene ont été utilisés pour examiner la normalité et l’homoscédasticité avant les tests paramétriques ; lorsque les hypothèses étaient violées, les données étaient transformées en logarithmique ou analysées avec des tests non paramétriques appropriés (Kruskal-Wallis avec le post hoc de Dunn ; Mann-Whitney U pour paire). Les valeurs p exactes et les mesures de taille d’effet (η² pour ANOVA, d de Cohen pour les tests t) sont indiquées dans les légendes de figures lorsque cela est applicable. Un p < à deux côtés de 0,05 était considéré comme statistiquement significatif. Les légendes de figures utilisent la notation suivante pour la signification : *p<0,05, **p<0,01, *** p<0,001 vs Contrôle ; # p<0,05, ## p<0,01, ### p<0,001 vs DSS ; NS, pas significatifs.
17. Résultats attendus et contrôle qualité
Le DSS devrait raccourcir la longueur du côlon, augmenter l’indice d’activité de la maladie et induire des dommages histologiques (distorsion architecturale cryptique, déplétion des cellules gobeletales, érosion épithéliale). Le traitement DBE devrait améliorer ces indices de façon dépendante de la dose et réduire les marqueurs d’activation entéro-gliale. Les taches occidentales devraient montrer des bandes aux poids moléculaires mentionnés ci-dessus, avec des signaux accrus dans le DSS et une atténuation avec DBE ou SBI-4211 ; Les expositions doivent rester dans la plage dynamique linéaire. L’immunofluorescence pour GFAP et S100β devrait montrer des intensités moyennes élevées dans le DSS et une réduction après le traitement DBE. Les chromatogrammes LC-MS/MS doivent afficher des temps de rétention stables (dérive ≤ 0,2 min) et des précisions de masse dans ± 5 ppm pour les ions de référence, avec des ions fragments caractéristiques pour les constituants clés. Les témoins négatifs (par exemple, l’omission d’anticorps primaires) ne doivent fournir aucun signal spécifique. Les paramètres d’acquisition d’imagerie (objectif, exposition, gain, gamma) doivent rester fixes entre les groupes afin de permettre des comparaisons quantitatives valides.
18. Notes de dépannage
La turbidité ou les particules dans les solutions DBE indiquent une filtration ou une précipitation insuffisante ; répéter la filtration à 0,22 μm et confirmer le pH 6,5-7,5. Une mortalité excessive ou une perte de poids sévère lors de l’exposition au DSS suggèrent une sur-induction ; réduire la concentration de DSS, vérifier la masse moléculaire des lots et remplacer quotidiennement les solutions DSS. Une quantification immunofluorescence incohérente reflète généralement une exposition variable ; fixez le temps d’exposition et le gain, et incluez une glissière de référence pour la calibration en lot. Des bandes western-blot faibles peuvent refléter une sous-charge ou une inefficacité de transfert ; Vérifiez la quantification des protéines, sélectionnez le pourcentage ou gradient de gel approprié, et confirmez le transfert par coloration membranaire réversible. Un mauvais ajustement ELISA (R² < 0,99 ou un calcul inverse standard en dehors de 85-115 %) justifie de répéter la courbe standard et de réévaluer les échantillons dilués. Pour les opérations qPCR avec une efficacité d’amorce supérieure à 90-110 %, réoptimisez la température de recuit ou la concentration de l’amorce avant analyse.
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Identification des composants DBE et du sérum contenant des médicaments
LC-MS/MS a identifié 105 constituants chimiques uniques dans la DBE, avec une erreur massive < 10 ppm. L’identification a été confirmée par formule moléculaire, motif isotopique et correspondance de fragments. Les principales classes comprenaient les triterpènes, les flavonoïdes, les biphénanthrènes et les acides organiques. Le sérum cont...
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La colite ulcéreuse (CU) est une maladie inflammatoire chronique de l’intestin avec une pathogenèse multifactorielle. En plus des réponses immunitaires dérégulées, le dysfonctionnement de la barrière épithéliale intestinale et la dysbiose du microbiote intestinal sont des facteurs bien reconnus, tandis que les anomalies du système nerveux entérique (SNE) sont de plus en plus identifiées comme un facteur clé dans la progression de laCU 23. Plus précisément, la dysr...
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Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Cette recherche a été soutenue par le projet de construction des disciplines médicales clés de haut niveau de l’Administration nationale de la médecine traditionnelle chinoise (ZYYSZX-2023256).
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| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| AutoDock 4.2 | Logiciel d’amarrage moléculaire | - | L’Institut de recherche Scripps |
| Sulfate de Dextrane Sodium (DSS) | Produit chimique pour induire la colite chez la souris | 9011-18-1 | Sigma-Aldrich |
| Liquide d’Lavement Dibai (DBE) | Mélange à base de plantes pour le traitement de la colite ulcéreuse | - | Université de médecine chinoise de Pékin |
| DMEM (Eagle Medium modifié de Dulbecco) | Milieu de culture cellulaire | 11965-092 | Thermo Fisher |
| Sérum fœtal bovin (FBS) | Supplément pour la culture cellulaire | 16000-044 | Thermo Fisher |
| Fluorescence Microscope | Instrument d’imagerie par immunofluorescence | - | Olympe |
| Système LC-MS/MS | Spectromètre de masse pour l’analyse LC-MS | - | Waters Corporation |
| Lipopolysaccharide (LPS) | Inducteur de l’inflammation en culture cellulaire | L2630 | Sigma-Aldrich |
| Cycleur thermique PCR | Équipements pour qPCR | T100 | Bio-Rad |
| Anticorps primaire (S100) | Anticorps pour la détection de la protéine S100 | ABC1234 | Abcam |
| Kit de test protéique (BCA) | Kit de quantification des protéines | 23225 | Thermo Fisher |
| Interféron recombinant (IFN) | Cytokine pour l’activation de l’EGC en culture cellulaire | - | Sigma-Aldrich |
| Anticorps secondaire (conjugué à HRP) | Anticorps secondaire pour l’immunohistochimie | XYZ5678 | Thermo Fisher |
| Sulfazalazine (SASP) | Contrôle positif de la colite ulcéreuse | - | Sigma-Aldrich |
| Équipement Western Blot | Système d’électrophorèse pour l’analyse des protéines | - | Bio-Rad |
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