Le test d’hémostase de Nimègue : mesure simultanée fluorogénique de la génération de thrombine et de plasmine dans un seul puits

Résumé

Ce protocole décrit le test d’hémostase de Nimègue, qui permet une mesure simultanée et temporelle de la génération de thrombine et de plasmine afin d’assurer une évaluation intégrée de la coagulation et de la fibrinolyse. Le test vise à améliorer la caractérisation de l’équilibre hémostatique dans les milieux de recherche et cliniques, au-delà du cadre des tests hémostatiques conventionnels.

Résumé

La thrombine et la plasmine jouent toutes deux un rôle central dans l’hémostasie, régulant respectivement la coagulation et la fibrinolyse. Les tests hémostatiques conventionnels se concentrent souvent sur des composants isolés ou des phases limitées d’hémostasie ; Par exemple, le temps de thromboplastine partielle activée et le temps de prothrombine évaluent uniquement l’initiation de la formation de fibrine, tandis que les tests d’activité factorielle évaluent la fonction des facteurs de coagulation individuels. Bien que précieux, ces tests manquent d’une vue globale du processus global d’hémostasie secondaire et de fibrinolyse, qui se déroulent dynamiquement dans le temps. Le test d’hémostase de Nimègue (NHA) répond à cette limitation en permettant une mesure simultanée et temporelle de la génération de thrombine et de plasmine dans un seul puits de microplaque. En utilisant deux substrats fluorogéniques synthétiques avec des spectres d’excitation et d’émission distincts et sans réactivité croisée, le test permet une quantification précise des deux enzymes en parallèle. L’hémostasie est initiée dans un plasma pauvre en plaquettes à l’aide d’un facteur tissulaire, d’un calcium et d’un activateur de plasminogène de type tissulaire, et la fluorescence est enregistrée tous les 30 s sur 70 minutes à 37 °C. Les courbes d’activité enzymatique sont générées à l’aide d’étalonnages, à partir desquelles des paramètres tels que le temps de latence, le potentiel de thrombine, le temps de lyse de la fibrine et la hauteur du pic de plasmine sont dérivés. Le test capture de manière fiable la génération simultanée de thrombine et de plasmine avec une bonne précision intra- et inter-dossages, et détecte la modulation de la coagulation et de la fibrinolyse par des effecteurs tels que l’héparine, la protéine C activée et l’acide epsilon-aminocaproïque. Dans des échantillons cliniques, une diminution significative de la génération de thrombine a été observée chez les patients présentant des déficiences en facteurs de coagulation, tandis que les patients atteints de troubles fibrinolytiques présentaient des profils de génération de plasmine élevés. En combinant les mesures de génération de thrombine et de plasmine, la NHA offre une vision complète de l’équilibre hémostatique, au-delà des tests conventionnels. Cette approche intégrée est prometteuse pour la recherche et les applications cliniques, telles que la caractérisation des phénotypes hémostatiques, l’évaluation du risque de saignement et de thrombotique, ainsi que le suivi des interventions thérapeutiques ciblées. Ce protocole décrit la procédure NHA visant à améliorer la compréhension et l’évaluation de l’équilibre hémostatique.

Introduction

L’hémostasie résulte d’un équilibre dynamique entre la coagulation et la fibrinolyse. La thrombine et la plasmine sont les enzymes clés qui alimentent ces processus : la thrombine convertit le fibrinogène en fibrine, tandis que la plasmine dégrade la fibrine pour dissoudre les caillots. La perturbation de cet équilibre peut entraîner des saignements ou des événements^{thrombotiques 1,2}. Cependant, les tests de laboratoire utilisés pour évaluer l’hémostasie en pratique clinique se concentrent généralement sur des étapes isolées de coagulation ou de fibrinolyse, fournissant une compréhension limitée de l’équilibre hémostatique global. Chez les patients présentant une tendance à saignement suspectée, des tests de dépistage de routine tels que le temps de prothrombine (PT) et le temps de thromboplastine partielle activée (aPTT) sont couramment utilisés pour dépister les carences en facteurs de coagulation. Cependant, ces tests mesurent le temps avant la formation initiale de la fibrine et ne capturent pas la génération de thrombine au-delà du début de la coagulation, où l’activité la plus importante sur le plan physiologique se^{produit 1,2,3}. Par conséquent, ils peuvent donner des résultats normaux chez les patients présentant des carences légères en facteurs de^coagulation 3,4,5,6,7,8. Pour identifier ces déficiences spécifiques, des tests d’activité des facteurs de coagulation sont utilisés. Bien qu’informatifs pour le diagnostic, ces tests évaluent les protéines individuelles isolément et ne reflètent pas l’équilibre hémostatique global. En conséquence, chez les patients présentant des carences légères, les niveaux de facteurs sont souvent mal corrélés au phénotype^{de saignement 9,10}. Cela complique l’évaluation des risques cliniques et l’optimisation de la prise en charge des patients, y compris le moment et la posologie du traitement, ainsi que les interventions en réponse aux événements thrombotiques ou hémorragiques sévères. Ces limites soulignent la nécessité de tests offrant une vision plus complète du processus hémostatique au fil du temps et pouvant aider à combler l’écart entre les résultats de laboratoire et la présentation clinique.

Le test d’hémostase de Nimègue (NHA) a été développé pour répondre à ces limites en permettant la mesure simultanée et temporelle de la génération de thrombine et de plasmine dans un plasma pauvre en^{plaquettes 8,9}. Il utilise deux substrats fluorogéniques synthétiques avec des spectres d’excitation et d’émission distincts pour quantifier les deux enzymes dans le même puits de microplaques sans réactivité croisée. Les courbes de génération enzymatique permettent de déduire des paramètres quantitatifs reflétant la dynamique de la coagulation secondaire et de la fibrinolyse, notamment le temps de latence, la hauteur du pic de la thrombine, le temps de lyse de la fibrine et la hauteur du pic de plasmine. Le NHA offre plusieurs avantages par rapport aux tests existants de génération de thrombine, tels que le Calibrated Automated Thrombogram (CAT), le Ceveron s100 et le ST Genesia, qui fournissent des informations précieuses sur la dynamique des thrombines mais n’évaluent pas l’activité^{fibrinolytique} 10,11,12,13. Les tests de lyse des caillots, à leur tour, capturent des aspects de la fibrinolyse mais manquent d’informations sur la génération¹⁴ de la thrombine. Cela limite leur utilité pour évaluer les interactions complexes qui déterminent l’équilibre hémostatique global. Bien que certaines approches développées en laboratoire combinent des mesures de génération de thrombine et de plasmine, celles-ci nécessitent généralement des puits séparés ou des tests parallèles, limitant l’alignement temporel et le débit¹⁵. Des tests globaux tels que la thromboélastographie (TEG) et la thromboélastométrie rotationnelle (ROTEM) fournissent des informations complémentaires en capturant l’hémostasie primaire, la coagulation secondaire et^{la fibrinolyse 16,17}. Les systèmes de chambres d’écoulement représentent une autre approche émergente mais expérimentale pour évaluer l’hémostasie totale dans des conditions de^{coulée 18}. Bien que ces tests globaux offrent un contexte physiologique plus large, ils sont généralement moins sensibles aux troubles hémorragiques^légers 19,20,21. En mesurant simultanément la génération de thrombine et de plasmine dans le même puits de réaction, le NHA combine la sensibilité des TGA conventionnels avec la vue intégrée des analyses globales, permettant une évaluation directe de l’hémostasie secondaire, de la fibrinolyse et de leurs interactions.

Les tests de génération de thrombine ont déjà montré un potentiel considérable pour des applications translationnelles, telles que le profilage individualisé des saignements et des risques thrombotiques ainsi que la surveillance^{thérapeutique} 22,23,24,25. Dans la recherche clinique, la NHA a démontré une diminution de la génération de thrombine chez des patients présentant des déficiences en hémophilie A, hémophilie B et de facteurs de coagulation rares, ainsi qu’une augmentation de la génération de plasmine dans des conditions hyperfibrinolytiques telles que la carence en α2-antiplasmine 26,27,28,29. Des différences dans les deux voies ont également été observées chez des patients atteints d’hypofibrinogenémie, un trouble associé à la fois à des saignements et à un risque accru de thrombose. Dans cette population, des niveaux plus faibles de fibrinogène étaient corrélés à une production de plasmine réduite, probablement en raison de l’absence de sites de liaison au plasminogène, tandis que les patients ayant des antécédents de thrombose présentaient une augmentation de la génération³⁰ de thrombine. De plus, le test détecte les effets des agents thérapeutiques, notamment les anticoagulants, les procoagulants et les antifibrinolytiques^. Dans une étude précédente, nous avons proposé une approche de standardisation et de normalisation pour améliorer la reproductibilité et permettre la comparaison des résultats entre les séries et les laboratoires, une étape essentielle vers la mise en œuvre^{clinique 28}. Ce protocole décrit la procédure complète et l’approche analytique de la NHA pour la mise en œuvre en recherche clinique ou en contexte translationnel.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des échantillons de plasma humain ont été réalisées conformément aux directives institutionnelles et approuvées par le comité d’éthique médicale d’Arnhem-Nimègue. Un consentement éclairé écrit a été obtenu de tous les donneurs avant la collecte de l’échantillon.

1. Préparation de tampons, de réactifs et d’échantillons de plasma

1. Préparer des solutions tampons
   1. Pèser 1,2 g de Tris (p.a.) et dissoudre dans 180 mL de 0,9 % de NaCl.
   2. Ajuste le pH à 7,4 avec HCl.
   3. Amenez le volume final à 200 mL avec 0,9 % de NaCl pour obtenir un tampon de 50 mM Tris-150 mM NaCl (TBS).
   4. Aliquotez le TBS dans deux tubes de 50 mL.
   5. Utilisez les 100 mL à cuillère à soupe restants pour préparer le tampon contenant du calcium. Dissoudre 7,34 g de CaCl_{2,2H 2}O dans 100 mL de TBS pour obtenir le tampon Tris-NaCl-CaCl₂ (TBS-Ca, pH 7,4).
   6. Alèmets le TBS-Ca dans deux tubes de 50 mL.
   7. Conservez les deux tampons à 4 °C et utilisez-les dans la semaine.
2. Préparez les substrats fluorogènes
   1. Dissoudre 53,2 mg du substrat de thrombine (Bz-bêta-Ala-Gly-Arg-AMC) dans 4 mL de tampon Tris-NaCl.
      REMARQUE : La boîte contient un dépliant avec un certificat d’analyse. Le volume de tampon à ajouter dépend de la concentration spécifiée et doit être ajusté de sorte qu'1 μL de thrombine humaine ajoutée dans un réactif de 120 μL donne une concentration finale de 76 nmol/L.
   2. Aliquotes 100 μL dans des tubes Eppendorf et stockées à −80 °C.
   3. Décongelez une aliquote de substrat fluorogénique spécifique à la thrombine pendant 10 minutes à température ambiante avant utilisation. Vortex et reste sur glace pendant l’expérience.
   4. Dissoudre le contenu d’un flacon de substrat de plasmine (CBZ-L-Phe-Arg-rhodamine) dans 1 955 μL de DMSO.
      REMARQUE : La boîte contient un dépliant avec un certificat d’analyse. Le volume de tampon à ajouter dépend de la concentration spécifiée et doit être ajusté de sorte qu'1 μL de plasmine humaine ajoutée dans un réactif de 120 μL donne une concentration finale de 200 nmol/L.
   5. Aliquote 60 μL dans des tubes Eppendorf et stockée à −80 °C.
   6. Décongelez une aliquote de substrat fluorogénique spécifique à la plasmine pendant 10 minutes à température ambiante avant utilisation. Vortex et maintenue à température ambiante pendant l’expérience.
      REMARQUE : Ce substrat est dissous dans du diméthylsulfoxyde (DMSO) et ne doit pas être refroidi pour éviter les précipitations.
3. Préparez les réactifs déclencheurs
   1. Reconstituez la céphaline lyophilisée en ajoutant 1 mL d’eau distillée. Vortex complètement jusqu’à ce qu’il soit complètement dissous.
      REMARQUE : La céphaline est reconstituée pour fournir des phospholipides, essentiels pour catalyser plusieurs réactions de coagulation permettant une coagulation physiologiquement pertinente dans le test.
   2. Aliquote 60 μL dans des tubes Eppendorf (suffisant pour 20 puits) et stocké à −20 °C.
   3. Décongelez une aliquote avant l’utilisation et gardez-la sur glace. Vortex brièvement avant de pipeter.
   4. Reconstituer le contenu d’un flacon de facteur tissulaire humain recombinant (TF) dans 4 mL d’eau distillée.
   5. Aliquote 60 μL dans des tubes Eppendorf et stockée à −80 °C.
   6. Dégeler brièvement un aliquote de TF et de vortex.
   7. Préparez une dilution 1:500 de TF par dilution séquentielle :
      1. Ajoutez 6 μL de TF à 54 μL de tampon TBS. Vortex.
      2. Prenez 6 μL de cette dilution et ajoutez à 54 μL de cuillères à soupe. Vortex.
      3. Prenez 20 μL de cette seconde dilution et ajoutez à 80 μL de cuillères à soupe pour atteindre une concentration finale de 0,28 pM. Vortex.
   8. Reconstituer le contenu d’un flacon (20 mg) d’activateur de plasminogène de type tissulaire (tPA) dans 20 mL d’eau distillée pour obtenir une concentration finale de 580 000 UI/mL (vérifier la concentration spécifique au lot).
   9. Aliquotes 50 μL dans des tubes Eppendorf et stockées à −80 °C.
   10. Dégeler brièvement une aliquote de tPA et de vortex.
   11. Préparez une dilution 1:50 de tPA en ajoutant 20 μL de tPA à 980 μL de tampon Tris-NaCl, atteignant une concentration finale de 11 600 UI/mL. Vortex.
4. Préparer des échantillons de plasma
   1. Prélever le sang veineux dans des tubes de 3 mL contenant 3,2 % de citrate, en veillant à prélever au moins 2,7 mL (90 % de remplissage).
   2. N’utilisez pas le premier tube après la ponction de vene ; Jetez-le pour éviter l’activation par facteur tissulaire.
   3. Inversez le tube au moins 10 fois immédiatement après la collecte.
   4. Centrifugez dans les 2 heures à température ambiante, d’abord à 2 500 × g pendant 5 minutes, puis 10 000 × g pendant 10 minutes.
   5. Utilisez une pipette jetable pour collecter le plasma juste au-dessus de la couche cellulaire.
   6. Le plasma aliquote dans des cryoviaux marqués, le congele instantanément dans de l’azote liquide, puis le stocke à −80 °C.
      REMARQUE : Assurez-vous que l’échantillon est exempt de caillots. Utilisez uniquement du plasma frais ou décongelé une fois. Un tube CTAD suffit pour l’analyse en double.

2. Préparation des instruments et configuration logicielle

1. Préparez le lecteur de plaques à fluorescence
   1. Allumez le lecteur de plaques et laissez-le s’équilibrer à 37 °C.
   2. Définissez les paramètres de base suivants :
      1. Greiner 96-well, fond plat, noir.
      2. Paramètres généraux : Délai de positionnement : 0,1 s ; Nombre de fenêtres cinétiques : 1.
      3. Fenêtre cinétique : nombre de cycles : 140 ; Temps de début de la mesure : 0,0 s ; Nombre d’éclairs par puits et par cycle : 10 ; Temps de cycle : 30 s.
      4. Optique : Optique supérieure
      5. Réglages du filtre : Nombre de monochromes : 2. Filtre d’excitation : 355 nm pour la thrombine ; 485 nm pour la plasmine. Filtre d’émission : 460 nm pour la thrombine, 520 nm pour la plasmine. Gain : 600.
   3. Définissez la disposition avec un maximum de 20 puits par plaque.
   4. Naviguez dans Concentrations/Volumes/Secouements et confirmez les réglages suivants. Pompe 1 = 20 μL ; Pompe 2 = 0 μL ; Vitesse = 420 μL/s.
2. Préparez le système d’injection
   1. Retirez et rincez les aiguilles d’injection dans un récipient avec tampon.
   2. Réglez le volume de rinçage à 2 500 μL et rincez les pompes avec un tampon Tris/NaCl à 37 °C.
   3. Réinitialisez le volume de rinçage à 500 μL.

3. Installation du test au format microplaque

1. Installation de vibrateurs à microplaques
   1. Réglez le vibrateur à microplaques à 37 °C et vérifiez la température avant utilisation.
   2. Réglez l’intensité de secousse à 1100 tr/min.
   3. Utilisez ce shaker pour toutes les étapes de mélange du test afin d’assurer une distribution homogène des réactifs et une activité enzymatique constante.
2. Ajoutez des réactifs aux puits
   1. Décongeler le plasma du patient et le plasma normal en réserve (NPP) dans un bain-marie à 37 °C pendant jusqu’à 10 minutes.
   2. Mélangez soigneusement et vérifiez la décongélation complète (pas de cryoprécipitée).
   3. Ajoutez 80 μL de plasma patient ou NPP aux puits présélectionnés. Utilisez une pointe de pipette fraîche pour chaque échantillon.
      REMARQUE : Inclure un échantillon de NPP à chaque essai pour tenir compte de la variabilité entre les essais (voir plus loin à l’étape 5.6).
   4. Ajoutez 2 μL de céphaline.
   5. Ajoutez 2 μL de facteur tissulaire (dilution 1:500). Mélangez brièvement avec un shaker à assiettes.
   6. Ajoutez 10 μL de tampon Tris-NaCl. Mélangez brièvement avec un shaker à assiettes.
   7. Ajoutez 4 μL de substrat de thrombine.
   8. Ajoutez 2 μL de substrat plasminique. Mélangez brièvement avec un shaker à assiettes.
3. Pré-incubation
   1. Insérez la microplaque dans le lecteur de plaques.
   2. Laissez la plaque s’équilibrer à 37 °C pendant plusieurs minutes.

4. Préparation et injection du réactif de départ

1. Préparez le réactif pour la Pompe 1
   1. Combinez 672 μL de tampon Tris/NaCl, 192 μL de tampon Tris/NaCl/CaCl₂, et 96 μL de tPA (à partir de l’étape 1.2.5). Vortex complètement.
   2. Percez deux trous dans le bouchon du tube réactif.
   3. Insérez le tube de la pompe par un trou jusqu’au fond du tube.
2. Amorce et commence le test
   1. Utilisez le logiciel pour amorcer la pompe avec 500 μL de réactif.
   2. Réinsérez les aiguilles d’injection à leur position désignée.
   3. Commencez immédiatement la mesure de fluorescence.
3. Initiation manuelle de l’essai
   REMARQUE : Cette procédure d’initiation manuelle offre une alternative au flux de travail d’injection automatisé décrit aux étapes 2.2, 4.1 et 4.2.
   1. Préparez le réactif de départ comme décrit dans la version 4.1.1 juste avant utilisation.
   2. Retirez la microplaque du lecteur de plaques et ajoutez rapidement 20 μL du réactif de démarrage manuellement dans chaque puits à l’aide d’une pipette calibrée ou multicanal pour une manipulation plus rapide.
   3. Remettez immédiatement la plaque dans le lecteur et commencez la mesure de fluorescence sans délai.
      REMARQUE : Minimisez le temps entre l’ajout du réactif et le début de la mesure (<10 s par rangée) afin de réduire la variabilité.
4. Affichage cinétique
   1. Enregistrez la fluorescence tous les 30 secondes pendant 70 minutes.
   2. Maintenez la plaque à 37 °C pendant la mesure.

5. Analyse des données

1. Préparer les données pour l’analyse
   1. Exportez les données de fluorescence cinétique depuis le lecteur de plaques sous forme de tableau avec les points temporels et les valeurs de fluorescence par puits.
   2. Convertissez les données brutes de fluorescence en courbes de génération enzymatique en calculant la première dérivée à l’aide d’Excel ou d’un autre programme.
   3. Tracez les courbes de génération enzymatique pour chaque puits afin de visualiser la réaction enzymatique.
      REMARQUE : Ces courbes représentent le taux de génération de thrombine ou de plasmine au fil du temps et correspondent à la sortie graphique présentée dans les figures.
2. Analyser les courbes de génération de thrombine
   1. Identifiez les paramètres suivants de la courbe de génération de la thrombine (voir Figure 1) :
      1. Temps de décalage : Le moment où la courbe de génération de la thrombine augmente régulièrement et atteint 8 % de la hauteur maximale de la thrombine.
      2. Hauteur maximale de la thrombine : La valeur maximale du signal sur l’axe y (c’est-à-dire le taux maximal de génération de la thrombine).
      3. Période de pic de la thrombine : Le temps entre le début du test et la hauteur maximale de la thrombine.
      4. Potentiel de thrombine (aire sous la courbe de génération de la thrombine) : La zone sous la courbe du délai jusqu’au retour du signal de la thrombine à la base.
         REMARQUE : Le potentiel de thrombine reflète la capacité totale de génération de thrombine de l’échantillon en conditions de test.
3. Analyser les courbes de génération de plasmines
   1. Identifiez les paramètres suivants à partir de la courbe de génération de plasmine (voir Figure 2) :
      1. Temps de lyse de la fibrine : Le temps entre le début de la génération de la plasmine (c’est-à-dire le moment où la courbe de génération de la plasmine augmente régulièrement et atteint 8 % de la hauteur maximale de la plasmine) jusqu’au moment où le pic de la plasmine est atteint.
      2. Hauteur de pic de plasmine : Le premier maximum distinct de la courbe, correspondant à l’explosion initiale de la génération de plasmine, est déterminé au point où la dérivée seconde de la courbe de génération de plasmine (basée sur une moyenne mobile de trois minutes) atteint zéro après le début de la génération de plasmine.
      3. Potentiel de plasmine (aire sous la courbe de génération de la plasmine) : La surface sous la courbe depuis le début de la génération de plasmine jusqu’au pic de la plasmine.
         REMARQUE : Les fluctuations du signal surviennent après le pic initial de plasmine et ne sont pas incluses dans l’analyse des paramètres de génération de plasmine.
4. Extraire les paramètres manuellement ou à l’aide d’un logiciel personnalisé
   1. Utilisez Microsoft Excel, GraphPad Prism ou un script personnalisé (par exemple, en Python ou R) pour extraire les paramètres cinétiques.
   2. Sauvegardez les données brutes, tracez les courbes et les paramètres calculés dans un format structuré pour archiver et référencer à l’avenir.
      REMARQUE : Si vous utilisez des macros, vérifiez visuellement et manuellement la correction de tous les paramètres avant de vous fier à la sortie automatisée. Notre macro pour la conversion de données est disponible sur demande.
5. Normalisation et normalisation
   1. Établir une référence physiologique en mesurant 40 échantillons individuels de donneurs sains en parallèle avec l’échantillon NPP utilisé pour la normalisation. Effectuez cette étape une fois par lot de NPP.
   2. Calculez les valeurs moyennes des paramètres de génération de thrombine et de plasmine des donneurs sains, et déterminez leur rapport aux valeurs NPP correspondantes obtenues lors d’une même exécution.
   3. Pour chaque échantillon patient lors d’une séquence donnée, il faut d’abord normaliser le paramètre de génération de thrombine ou de plasmine à la valeur de NPP mesurée lors de cette même séance.
   4. Divisez ce résultat par le ratio donneur sain par rapport aux NPP établi précédemment pour le même lot de NPP (voir étape 5.6.2). Cela donne une valeur relative normalisée à l’individu en bonne santé moyen, avec une standardisation pour la variation entre les cycles à l’aide de la NPP.
   5. Exprimez les valeurs des paramètres en pourcentages par rapport à la valeur moyenne des individus en bonne santé (définie comme 100 %). Présenter les résultats de l’échantillon patient en conséquence.
      REMARQUE : Les valeurs relatives des paramètres pour chaque échantillon individuel de patient sont calculées à l’aide de la formule suivante, où la série a fait référence à la série de mesure de l’échantillon patient, et la série b désigne la série de référence dans laquelle des échantillons de donneurs sains ont été mesurés en parallèle avec le même lot de NPP. Notre fichier Excel contenant les calculs pour la normalisation des données est disponible sur demande.
      

6. Génération de courbes d’étalonnage

1. Préparez la courbe d’étalonnage de la thrombine
   1. Reconstituez la α-thrombine humaine lyophilisée comme indiqué dans la fiche technique du fabricant.
      REMARQUE : Par exemple, si la fiche technique précise une reconstitution à 100 μL d’eau pour obtenir 3,34 mg/mL, cela correspond à 0,334 mg en 100 μL.
   2. Diluez la thrombine reconstituée 1:10 dans un tampon Tris/NaCl.
      REMARQUE : Cela donne une concentration de stock d’environ 9,1 nmol/mL (0,0091 nmol/μL), basée sur une masse moléculaire de 36 700 g/mol.
   3. Préparez une série de dilution dans le tampon Tris/NaCl pour obtenir des concentrations finales de thrombine dans le dossage allant de 0 à 152 nmol/L.
   4. Pipette la thrombine dans des puits sélectionnés déjà contenant du tampon pour atteindre un volume total de 100 μL par puits.
   5. Préparez la solution substrat pour la Pompe 1 en mélangeant 300 μL de tampon Tris/NaCl avec 200 μL de substrat de thrombine de l’étape 1.2.2.
   6. Diluez davantage cette solution en combinant 400 μL du mélange avec 360 μL de tampon Tris/NaCl.
   7. Ajoutez 20 μL de ce mélange de substrat à chaque puits d’étalonnage, portant le volume total du test à 120 μL.
   8. Mélangez doucement la plaque et insérez-la dans le lecteur de plaques. Effectuez le test cinétique pendant 25 cycles, en utilisant les mêmes réglages de fluorescence décrits dans la section 2.
   9. Exportez les données brutes de fluorescence et déterminez la pente initiale (taux d’augmentation de fluorescence par cycle) pour chaque concentration de thrombine à l’aide de GraphPad Prism ou d’un logiciel équivalent.
   10. Générez une courbe standard en traçant la pente initiale par rapport à la concentration de thrombine.
       REMARQUE : Assurez-vous que tous les tampons sont préchauffés à 37 °C et manipulez les enzymes sur glace. Préparez toujours des dilutions fraîches et mélangez soigneusement. La courbe standard résultante est utilisée pour calculer l’activité relative de la thrombine dans des échantillons inconnus en utilisant le macro décrit à la section 5.
2. Préparation de la courbe de calibration de la plasmine
   1. Reconstituez la plasmine lyophilisée dans de l’eau distillée (par exemple, 0,543 mL) selon les instructions du fabricant.
      REMARQUE : La plasmine a un poids moléculaire de 75 400 g/mol. La concentration d’origine est d’environ 24,3 nmol/mL (0,024 nmol/μL), en supposant 1 mg dans 0,543 mL.
   2. Préparez une série de dilution dans le tampon Tris/NaCl pour obtenir des concentrations finales de plasmine dans le dosage allant de 66 à 532 nmol/L.
   3. Pipeter la plasmine dans des puits contenant un tampon Tris/NaCl pour atteindre un volume final de 100 μL par puits.
   4. Préparez la solution de substrat pour la Pompe 1 en mélangeant 680 μL de tampon Tris/NaCl avec 80 μL de substrat plasmine/rhodamine (prédilué 1:1 si nécessaire) de l’étape 1.2.5.
   5. Ajoutez 20 μL de cette solution substrat à chaque puits d’étalonnage, portant le volume total à 120 μL.
   6. Mélangez doucement la plaque et insérez-la dans le lecteur de plaques. Effectuez le test cinétique pendant 25 cycles en utilisant les mêmes réglages de fluorescence décrits dans la Section 2.
   7. Exportez les données brutes de fluorescence et déterminez la pente initiale de l’augmentation de fluorescence pour chaque concentration de plasmine en appliquant une régression linéaire à la phase linéaire de la courbe cinétique en utilisant GraphPad Prism ou un logiciel équivalent.
   8. Générez une courbe standard en traçant la pente initiale par rapport à la concentration de plasmine.
      REMARQUE : En raison de la variation de l’activité plasminale d’un lot à l’autre, l’étalonnage doit être répété à chaque nouveau lot. Si une activité exceptionnellement élevée est observée, une dilution 1:2 du stock est recommandée avant de préparer la série d’étalonnage.
3. Utilisez la courbe d’étalonnage pour la quantification
   1. Utilisez les courbes d’étalonnage générées dans la Section 6 pour convertir les valeurs de pente de fluorescence en activité enzymatique relative.
   2. Utilisez uniquement la portion linéaire de la courbe d’étalonnage pour interpoler des échantillons inconnus.

Résultats

Les courbes de génération représentatives de thrombine et de plasmine obtenues avec le test d’hémostase de Nimègue (NHA) sont illustrées à la Figure 3. L’intensité du signal de chaque courbe est exprimée en pourcentage par rapport à l’échantillon de plasma normal regroupé (NPP) mesuré simultanément. Un échantillon avec NPP est inclus à chaque exécution comme contrôle interne pour vérifier la validité du test et garantir la comparabilité entre les exécutions....

Discussion

Le test d’hémostase de Nimègue (NHA) est un dosage fluorogénique à double enzyme qui permet la mesure simultanée et résolue dans le temps de la génération de thrombine et de plasmine dans un plasma pauvre en plaquettes. En capturant les deux processus dans un seul puits, la méthode facilite une analyse cinétique à haute résolution de l’hémostasie secondaire et de la fibrinolyse. Cette double lecture offre des avantages méthodologiques distincts par rapport aux tests conventionnels et a é...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Matériaux
Chloridédihydre de calcium (CaCl2.2H2O)	Merck	1.02382
Céphaline (kit de réactifs C.K. Prest 5 APTT)	Stago	00847	Stable pendant 6 mois à -20 &°C.   ;
Eau distillée			Notez la date d’ouverture. À utiliser dans le délai d’un jour après la première ouverture.
Diméthylsulfoxyde (DMSO)	Merck	1.02950.0500
Alpha-thrombine humaine	Laboratoires de recherche enzymatique	HT 1002a	La boîte contient un dépliant avec un certificat d’analyse. Le volume de tampon à ajouter dépend de la concentration spécifiée et doit être ajusté de façon à ce que 1 & micro ; L de thrombine humaine ajoutée à 120 & micro ; Le réactif L donne une concentration finale de 76 nmol/L.
Plasmine humaine	Laboratoires de recherche enzymatique	HPlas	La boîte contient un dépliant avec un certificat d’analyse. Le volume de tampon à ajouter dépend de la concentration spécifiée et doit être ajusté de façon à ce que 1 & micro ; L de plasmine humaine ajoutée dans 120 & micro ; Le réactif L donne une concentration finale de 200 nmol/L.
Plasma normal en pool	Préparation interne	Non applicable	Stable pendant 3 heures après décongélation si on le garde sur la glace.
Plasma patient	Non applicable	Non applicable
Substrat plasmique (CBZ-L-phénylalanyl-L-amide d’arginine) - rhodamine-morpholino urée	Symeres		Stable pendant 6 mois à -80 °C.   ;
Facteur tissulaire humain recombinant (TF) : Innovin	Dade Behring	B4212	Stable pendant 6 mois à -80 °C.   ;
Activateur de plasminogène de type tissulaire recombinant (tPA) : Alteplase/Actilyse	Boehringer Ingelheim		Stable depuis 12 mois à -80 ° ;C.  ;
Tris(hydroxylméthyl)aminométhane (H2NC(CH2OH)3)	Merck	1.08382.2500
Tampon Tris-NaCl, pH 7,4 (TBS)	Préparation interne	Non applicable
Tampon Tris-NaCl-CaCl2, pH 7,4 (TBS-Ca)	Préparation interne	Non applicable
Substrat de thrombine Bz-bêta-Ala-Gly-Arg-7-amine-4-méthylcoumarine	Symeres		Stable pendant 6 mois à -80 °C.   ;
Équipement
Fluorimètre / lecteur de microplaques Fluostar Optima avec contrôle de température et injecteurs à réactifs	BMG Labtech
Plaque micro-titrée à 96 puits, polystyrène, fond plat, noir, surface de liaison moyenne (équivalent Microlon)	Greiner BIO-ONE	655076
Bilan analytique (bilan à charge supérieure)
Pointes de pipette bleues (pour 100-1000 & micro ; L)
Tubes de prélèvement sanguin de citrate 3 mL (3,2 % de citrate)	BD Vacutainer
Seau à glace
Machine à glace
Incubateur / vibrateur à microplaques
Agitateur magnétique
Rack de tubes pour microcentrifugeuses
Tubes microcentrifuge, fermables
Compteur de pH
Pointes de pipette 0,1-10 & micro ; L, non stérile
Pipettes (2, 10, 20, 100 et 1000 & micro ; L)
Tournevis (utilisé comme sonde)
Mélangeur à lampes
Bain marie
Pointes de pipette jaunes (pour 20-200 & micro ; L)