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Une procédure étape par étape pour produire des chimères germinales chez le poulet via transplantation de cellules germinales primordiales

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DOI :

10.3791/69704

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5 décembre 2025

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1Department of Agricultural Biotechnology and Research Institute of Agriculture and Life Sciences, Seoul National University, 2Department of International Agricultural Technology & Institute of Green Bioscience and Technology, Seoul National University

Dans cet article

Résumé

Les chimères germinales aviaires, générées par la transplantation de cellules germinales primordiales (PGC) dans des embryons récepteurs, permettent des applications en transgenèse, édition génétique et conservation des espèces. Ce protocole détaille les procédures d’isolation des PGC, d’expansion in vitro , de microinjection et de vérification par le donneur, offrant une plateforme fiable pour la production de chimères germinales et l’avancement de la biotechnologie aviaire.

Résumé

La génération de chimères germinales chez les poulets via transplantation de cellules germinales primordiales (PGC) offre une plateforme robuste et reproductible pour la transgenèse aviaire, l’édition du génome et la conservation des espèces. Les approches traditionnelles utilisant des cellules blastodermiques issues d’embryons de stade X de l’EGK sont limitées par une faible efficacité de transmission de la lignée germinale due à la ségrégation précoce de la lignée cellulaire. En revanche, les stratégies médiées par PGC exploitent la compétence germinale intrinsèque de ces cellules unipotentes, permettant une incorporation fiable dans les gonades receveuses. Ici, nous présentons un protocole étape par étapes pour isoler les PGC à partir d’embryons de stade 26 à 28 de l’HH, les maintenir et les développer in vitro, puis les transplanter dans l’aorte dorsale des embryons receveurs de stade 14-17 de l’HH. L’engraftement à court terme est surveillé à l’aide de marqueurs fluorescents tels que PKH26, tandis que la contribution à long terme de la lignée germinale est confirmée par une analyse PCR des gonades receveuses. Cette approche assure une génération cohérente de chimères germinales tout en préservant la viabilité et la compétence fonctionnelle des PGC des donneurs. De plus, la méthode est compatible avec des outils d’édition génomique tels que CRISPR/Cas9 et des vecteurs basés sur transposons, permettant la production de modèles aviaires transgéniques et génétiquement modifiés. Au-delà de la recherche fondamentale, cette stratégie soutient les efforts de conservation par la transmission interespèces de la lignée germinale et la préservation des ressources génétiques. Dans l’ensemble, ce protocole offre un cadre complet et fiable pour manipuler la lignée germinale aviaire, offrant une plateforme polyvalente pour les études fondamentales et appliquées en biotechnologie avicole.

Introduction

La transmission médiée par la lignée germinale primordiale (PGC) est la méthode la plus efficace pour transférer l’information génétique à la génération suivante chezles oiseaux 1,2,3. Les chimères germinales, définies comme des individus porteurs à la fois de cellules germinales issues du donneur et de l’hôte, permettent la transmission du matériel génétique du donneur à la descendance, soutenant ainsi des applications en transgenèse, génomique fonctionnelle et conservation des espècesmenacées 4,5,6,7,8. Contrairement aux approches qui reposent sur des cellules blastodermiques, les stratégies médiées par PGC offrent une efficacité et une reproductibilité de transmission germinale plus élevées, ce qui les rend bien adaptées à une manipulation génétique précise.

Chez les espèces aviaires, les PGC prennent naissance dans la région pellucide centrale du blastoderme au stadeX 9 d’Eyal-Giladi et Kochav (EGK) et migrent ensuite vers le croissant germinal au stade 4-10 de Hamburger et Hamilton (HH). Entre les stades 9 et 12 de l’HH, les PGC circulent via des vaisseaux sanguins embryonnaires avant de se déposer dans la crêtegonadiale 11, 12, 13. Ces schémas migratoires distincts permettent l’isolement des PGC à plusieurs stades, notamment le croissant germinal, le sang circulant etles gonades 14. Notamment, les PGC prélevés sur des gonades de stade 26-28 de l’HH et transplantés dans des embryons de receveur de stade 14-17 de l’HH ont démontré une compétence optimale en lignée germinale et une efficacité d’engraftage, fournissant un cadre pratique pour l’application standardisée de ce protocole.

Les PGC peuvent être maintenus et étendus in vitro tout en conservant l’identité et la transmission de la lignée germinale, permettant leur utilisation pour une modification génétique stable. La production de chimères germinales médiée par PGC a été utilisée pour générer des oiseaux transgéniques exprimant des protéines recombinantes, une lignée germinale trace, manipuler les voies de détermination du sexe et conférer une résistance aux maladiesinfectieuses 6,15,16,17,18,19. De plus, la transplantation PGC facilite la transmission interespèces de la lignée germinale et la conservation du germoplasme aviaireen danger 7,8,20,21,22,23, et la cryopréservation PGC permet la préservation à long terme des ressources génétiques 24,25.

Bien que d’autres types de cellules souches, notamment les cellules souches embryonnaires (CES)26,27,28,29, les cellules souches pluripotentes induites (iPSCs)30,31,32, et les cellules souches spermatogoniales (SSCs)33,34, aient été explorés pour la modification de la lignée germinale aviaire, leur efficacité de transmission de la lignée germinale reste inférieure à celle des systèmes basés sur les PGC, qui sont actuellement considérés comme les plus Source fiable de cellules compétentes en lignée germinale.

Dans les études sur les chimères germinales, le choix de la race donneuse est crucial pour distinguer les cellules germinales dérivées du donneur des cellules dérivées de l’hôte. Le poulet ogye coréen (KOC) possède l’allèle récessif i/i responsable de la peau et des plumes noires, facilement distinguable de la lignée White Leghorn portant l’allèle dominant I/I 35,36. Cette différence visible permet une identification sans ambiguïté de la descendance issue du donneur lors de l’analyse de transmission germinale, tout en soutenant la conservation de la biodiversité grâce à la valeur génétique indigène du KOC.

Dans l’ensemble, la production de chimères germinales médiée par PGC constitue une plateforme robuste pour la biotechnologie aviaire (Figure 1). En spécifiant les stades optimaux du donneur (HH26-28) et du receveur (HH14-17) et en intégrant des étapes définies de culture et de validation, ce protocole permet une transmission efficace de la lignée germinale et fournit un cadre pratique pour la génération d’oiseaux transgéniques et modifiés par le génome, ainsi que pour la préservation de précieuses ressources génétiques aviaires.

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Protocole

Toutes les procédures impliquant des poulets ont été approuvées par l’Institut des ressources animales de laboratoire de l’Université nationale de Séoul, Corée du Sud (numéro d’approbation IACUC : SNU-250226-4). Les animaux étaient maintenus dans des conditions contrôlées et hygiéniques, avec de l’eau et de la nourriture stérilisées. De plus, tous les déchets chimiques et biologiques générés lors des procédures, y compris les solutions de trypsine/EDTA, les cellules marquées à PKH26 et les tissus embryonnaires ou gonadaux, ont été manipulés et éliminés conformément aux directives institutionnelles de biosécurité et de gestion des déchets dangereux de l’Université nationale de Séoul. Tous les réactifs et équipements utilisés dans ce protocole sont listés dans le Tableau des matériaux. Les médias et réactifs PGC utilisés pour l’échantillonnage de gonades et la culture cellulaire à partir d’embryons donneurs doivent être stériles.

1. Isolement des PGC de poulets

  1. Incubez des œufs de poule frais fécondés au stade Eyal-Giladi et Kochav (EGK) X à 37 °C pendant 5,5 jours jusqu’à ce que les embryons atteignent les stades HH 26-28.
    REMARQUE : Maintenez l’humidité entre 60 % et 65 % pour assurer un développement embryonnaire normal.
  2. Isolez soigneusement les embryons des ovules aux stades HH 26-28 à l’aide de pinces stériles.
  3. Lavez les embryons avec 1× de PBS, puis placez l’embryon sur une plaque de charbon et fixez-le avec des épingles à insectes. À l’aide d’un stéréomicroscope, disséquez soigneusement les gonades embryonnaires appariées à l’aide de pinces aiguisées.
    REMARQUE : Manipulez les tissus avec délicatesse pour éviter les dommages et assurer une isolation précise des gonades. En raison de leur proximité avec le rein mésonephrique aux stades 26-28 de l’HH, une petite quantité de tissu rénal peut être involontairement collectée ; cependant, une dissection soigneuse sous stéréomicroscope et des conditions de culture sélective garantissent que seuls les PGC prolifèrent, tout en maintenant leur pureté.
  4. Transférer les gonades appariées prélevées sur trois embryons dans un tube de 1,5 mL contenant 500 μL de trypsine/EDTA à 0,05 % et incuber à 37 °C pendant 5 minutes pour dissocier les cellules.
  5. Ajoutez 50 μL de FBS pour inactiver la trypsina.
  6. Centrifugez à 200 × g pendant 5 minutes à température ambiante (environ 20-25 °C). Retirez soigneusement le surnageant sans déranger la pellete cellulaire.
  7. Resuspendez les cellules gonadiques dissociées dans 1 mL de 1× PBS.

2. Prolifération in vitro des PGC de poulets

  1. Préparez un milieu de culture PGC (KO-DMEM complété avec 20 % de FBS, 2 % de sérum de poulet, nucléosides, GlutaMAX, acides aminés non essentiels MEM, 2-mercaptoéthanol, 10 mM pyruvate de sodium, antibiotique antimycotique, 10 ng/mL de bFGF) et réchauffez le milieu à 37 °C.
  2. Ajoutez des cellules gonades dissociées collectées sur trois embryons aux stades HH 26-28 (environ 100 à 150 PGC parembryon 37,38) à 1 mL de milieu de culture pré-chauffé par puits et placez les cellules sur une plaque de culture à 12 puits.
  3. Balancez doucement la plaque pour assurer une répartition uniforme des cellules.
  4. Maintenir les PGC à 37 °C avec 5 % de CO₂, surveiller la morphologie et la densité cellulaire quotidiennement. Les PGC restent ronds, réfractables et généralement flottants, tandis que les cellules somatiques sont adhérentes (Figure 2A).
    REMARQUE : Les conditions de culture soutiennent sélectivement la prolifération des PGC, permettant aux PGC de s’étendre tandis que les cellules somatiques sont progressivement éliminées.
  5. Les PGC cultivés dans une plaque à 12 puits sont maintenus en changeant le milieu de culture tous les 3 à 4 jours afin de soutenir une prolifération et une viabilité optimales (Figure 2B).
  6. En option, utilisez des marqueurs spécifiques aux PGC (par exemple, CVH, DAZL, NANG et POUV) pour vérifier la pureté et effectuer la détermination du sexe par PCR (Tableau 1).
    1. Préparez les échantillons de PGC pour l’extraction d’ARN à l’aide du système ARN Miniprep selon les instructions du fabricant.
    2. Effectuer la RT-PCR (par exemple, CVH, DAZL, NANOG et POUV) ou l’immunocoloration à l’aide de marqueurs spécifiques à PGC (SSEA1 et DAZL) selon les protocolesstandards 39 (Figure 2C,D).
    3. Effectuer une analyse PCR par sexage selon les protocolesstandards 40 (Figure 2E).

3. Validation de la compétence en lignée germinale des PGC cultivés en utilisant le marquage PKH26

  1. Récolter les PGC lorsqu’ils atteignent la phase de croissance en log, généralement à une densité d’environ 1 à 5 × 105 cellules par puits dans une plaque à 12 puits.
  2. Pelletez les cellules en centrifugant à 200 × g pendant 5 minutes à température ambiante (environ 20-25 °C), resuspendez en 1× PBS, puis évaluez la viabilité à l’aide du bleu de trypan.
  3. Préparez le diluent C du kit de liaison des cellules fluorescentes rouges PKH26 pour un marquage général de la membrane cellulaire et équilibrez-le à température ambiante (environ 20-25 °C).
  4. Reconstituez le colorant PKH26 et préparez une solution de travail dans le diluent C à une concentration finale d’environ 1 à 2 μM.
  5. Résuspendez le pellet PGC dans 1 mL de diluant C. Ajoutez rapidement 1 mL de solution PKH26 (ratio 1:1), mélangez doucement, puis incubez pendant 2 à 5 minutes à température ambiante (environ 20-25 °C).
  6. Ajoutez rapidement 1 mL de solution de travail PKH26 à la suspension cellulaire (ratio 1:1), mélangez doucement par pipetage, puis incubez à température ambiante (environ 20-25 °C) pendant 2 à 5 minutes.
    REMARQUE : Ne dépassez pas le temps d’incubation recommandé.
  7. Arrêtez la coloration en ajoutant 2 à 4 fois le volume de FBS ou 1 % à 5 % de BSA dans le PBS.
  8. Centrifugeuse à 200 × g, 5 min à température ambiante (environ 20-25 °C) ; laver trois fois avec un substrat de culture PGC ou 1× PBS + 0,1 % de BSA.
  9. Resuspendez les cellules dans un tampon d’injection (milieu de culture PGC ou 1× PBS + 0,1 % de BSA) à une concentration de 1-5 × 104 à 1 ×10 5 cellules/μL. Conservez-les brièvement sur la glace pour préserver leur viabilité.
  10. Vérifiez le marquage au microscope à fluorescence avant l’injection (Figure 3A).
  11. Injectez plus de 3 000 PGC marqués viables, comptés à l’aide de bleu de trypan, dans des embryons de stade HH 14-17 et incubez jusqu’au jour 6 (Figure 3B).
  12. Confirmez la colonisation des gonades réceptrices au jour 6 (Figure 3C).

4. Transplantation de PGC par donneur dans le vaisseau sanguin embryonnaire du receveur

  1. Incubez les œufs récepteurs au stade HH 14-17 (37 °C, 60-70 % d’humidité, en oscillant à 45° toutes les heures).
  2. Préparez une micropipette capillaire en verre à l’aide d’un tube en verre borosilicate (diamètre extérieur de 1,0 mm, diamètre intérieur de 0,5 à 0,75 mm). Retirez le capillaire à l’aide d’un extracteur de micropipette et polissez la pointe à un diamètre intérieur d’environ 10-20 μm.
  3. Créez une petite fenêtre (environ 0,5 cm × 0,5 cm) à l’extrémité pointue de l’œuf pour permettre l’accès à la microinjection tout en minimisant les perturbations de l’embryon.
    REMARQUE : Stérilisez la surface de la coquille d’œuf avec 70 % d’éthanol avant d’ouvrir la fenêtre pour éviter toute contamination.
  4. Injecter 2 μL d’une suspension contenant plus de 3 000 PGC dans 1× PBS ou HBSS dans l’aorte dorsale sous un stéréomicroscope.
    REMARQUE : Effectuez l’injection sous stéréomicroscope pour éviter d’endommager l’embryon ou les vaisseaux sanguins, et manipulez soigneusement l’aiguille de microinjection pour éviter les blessures.
  5. Scellez la fenêtre à œufs avec un film de paraffine ; Positionner l’œuf vers le bas et couver jusqu’à l’éclosion à 37,5 °C, 60-70 % d’humidité, en se balançant à 45 °C chaque heure.
    REMARQUE : Maintenir une température et une humidité appropriées afin d’assurer la viabilité et le développement réussi de l’embryon.

5. Validation des chimères germinales

  1. Prélever le testicule ou l’ovaire du poussin G0 après l’éclosion.
  2. Extraire l’ADN génomique des tissus gonadaux collectés pour confirmer la formation de la chimère germinale. Effectuez l’extraction d’ADN génomique à partir des tissus gonadaux collectés comme suit :
    1. Collectez des testicules ou du tissu ovarien, homogénéisez-le dans 300 μl de tampon de lyse (2 mM Tris-HCl (pH 8,0), 10 mM EDTA, 1 % SDS) contenant 1,5 μL de protéinase K, puis incubez à 60 °C pour l’h afin d’assurer une lyse complète.
    2. Ajoutez 100 μL de solution de précipitation protéique (acétate d’ammonium de 7 M), mélangez soigneusement, puis centrifugez à 12 000 × g pendant 10 minutes à 4 °C.
    3. Transférer le surnageant (phase aqueuse) dans un nouveau tube, ajouter 500 μL d’isopropanol pour précipiter l’ADN, puis centrifuger à 12 000 × g pendant 10 minutes à 4 °C.
    4. Jetez le surnageant, ajoutez 1 mL d’éthanol à 70 %, puis centrifugez à 12 000 × g pendant 10 minutes à 4 °C.
    5. Retirez l’éthanol, faites sécher la pelote d’ADN à température ambiante pendant 10 minutes.
    6. Éluez l’ADN avec 50 μL d’eau sans RNase et mesurez la concentration et la pureté de l’ADN à l’aide d’un spectrophotomètre (A260/A 280 ≈ 1,8).
    7. Ajustez l’ADN à 10-5 ng par réaction PCR.
  3. Effectuer une amplification PCR à l’aide d’amorces spécifiques à chaque espèce conçues (Tableau 1) dans les conditions suivantes : 94 °C pendant 3 minutes, suivies de 35 cycles à 94 °C pendant 30 s, 68 °C à 30 s, et 72 °C à 30 s, plus une extension finale à 72 °C pendant 5 minutes (Figure 4A).
  4. Prélever du sperme de mâles G0 sexuellement matures, extraire l’ADN de spermatozoïde selon le même protocole, puis effectuer la PCR à l’aide d’amorces spécifiques à chaque espèce (Figure 4B).

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Résultats

Prolifération in vitro et caractérisation des PGC de poulets
Des cellules gonades entières contenant du PGC ont été isolées d’embryons aux stades HH 26-28 et cultivées dans des conditions définies de culture PGC. Au fil du temps, les cellules stromales gonadales adhéraient soit à la surface de la culture, soit subissaient une dégradation, tandis que les PGC restaient en suspension et commençaient à proliférer activement (Figure 2A). Après enviro...

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Discussion

La transplantation de cellules germinales primordiales (PGC) cultivées dans des embryons receveurs offre une méthode fiable pour produire des chimères germinales chez les poulets. Ce protocole exploite le potentiel germinal intrinsèque des PGC et améliore la cohérence expérimentale par rapport aux systèmes traditionnels basés sur le blastoderme, qui sont sujets au mosaïcisme et à la variabilité du développement. Un avantage crucial de cette méthode est l’expansion sélective in vitro<...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par la subvention de la National Research Foundation of Korea (NRF) financée par le gouvernement coréen (MSIT) [RS-2024-00418297] et par le Programme de recherche coopérative pour le développement des sciences et technologies agricoles [RS-2025-02213489] de l’Administration coréenne du développement rural.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
1x PBS  ;HycloneSH30256
2-MercaptoéthanolGibco21985023
Solution antibiotique antimycotique (100X)Gibco15240062
Anticorps anti-DAZLAbcamab215718
Sérum de poulet stérileRocklandD102-00-0500
Désoxyribonucléase I issue du pancréas bovinSigma aldrich9003-98-9
Micropipets jetables Drummond Micropipets & nbsp ;Société scientifique Drummond1-000-0500
Nucléosides EmbryoMax (100X)MerckES-008-D
FBS (caractérisé par le seurm bovin fœtal, origine américaine, 500 ml)HycloneSH30919
Supplément GlutaMAXGibco35050061
KnockOut DMEMGibco10829018
Solution d’acides aminés non essentiels de MEMGibco11140050
Film de laboratoire Parafilm MAmcorPM996 & nbsp ;
Kit de liaison des cellules fluorescentes rouges PKH26 pour le marquage général des membranes cellulairesSigma aldrichPKH26GL-1KT
Anticorps anti-souris/humain de CD15 purifié (SSEA-1)Biolégende125602
Protéine recombinante humaine FGF basique/FGF2/bFGF (146 aa) & nbsp ;R& Systèmes D  ; 233-FB
Systèmes Miniprep ARN ReliaPrepPromegaZ6011
Pyruvate de sodium (100 mM)Gibco11360070
Solution bleue de trypanSigmaT8154-100ML
Trypsine-EDTA (0,5 %), pas de phénol-rougeGibco & Trade ;15400054

Références

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Cellules germinales primordialestransplantation de CGPtransgen se aviairedition du g nomeembryons de poulettransmission germinale intersp cifiqueCRISPR Cas9marqueurs fluorescentsanalyse PCR des gonades

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