Isolement des péricytes à partir de tissu cortical de souris à l’aide de FACS pour le séquençage unicellulaire

Résumé

Pour obtenir des péricytes corticaux cérébraux de souris répondant aux besoins du scRNA-seq, nous présentons un protocole FACS critique basé sur la sélection CD13⁺/CD31⁻. Nos principaux raffinements améliorent considérablement la viabilité cellulaire et l’intégrité de l’ARN, permettant un profilage transcriptomique fiable.

Résumé

Les péricytes, en tant que composant central de l’unité neurovasculaire, jouent un rôle essentiel dans le maintien de l’intégrité de la barrière hémato-encéphalique et la régulation de l’homéostasie hémodynamique cérébrale grâce à la modulation du tonus microvasculaire. Le dysfonctionnement des péricytes a été impliqué dans divers troubles neurologiques. Pour étudier l’hétérogénéité des péricytes et élucider leurs mécanismes dans les maladies neurovasculaires à résolution unicellulaire, nous avons mis en place un protocole optimisé et reproductible pour isoler les péricytes cérébraux de souris adaptés au séquençage de l’ARN unicellulaire (scRNA-seq). Cette méthode s’appuie sur la stratégie établie ^{de tri} CD13⁺/CD31, mais intègre des améliorations clés spécifiquement adaptées aux applications scRNA-seq. En résumé, des cerveaux ont été prélevés sur trois souris adultes C57BL/6. Les tissus cérébraux ont été dissociés mécaniquement et soumis à une digestion enzymatique pour obtenir des suspensions unicellulaires. Après centrifugation séquentielle, la pastille cellulaire finale a été resuspendue dans une solution d’albumine sérique bovine (BSA) à 20 %, une étape clé que nous avons introduite pour minimiser le stress et l’agrégation, maximisant ainsi la viabilité et la qualité de l’ARN pour le séquençage. Cette approche optimisée basée sur le FACS permet ainsi l’isolation robuste de péricytes cérébrales de souris viables répondant aux exigences strictes du scRNA-seq, offrant un outil puissant pour disséquer l’hétérogénéité des péricytes et leurs rôles pathologiques dans les maladies neurovasculaires.

Introduction

Les péricytes sont un type important de cellule située le long des microvaisseaux, généralement intégrés dans la membrane basale capillaire et enveloppant les cellules^{endothéliales 1}. Dans le cerveau, les péricytes, ainsi que les cellules endothéliales, les astrocytes et d’autres types cellulaires, forment l’unité neurovasculaire et sont essentiels à la structure et au fonctionnement de la barrière hémato-encéphalique (BBB). Les péricytes jouent un rôle essentiel dans la régulation du flux sanguin cérébral, le remodelage vasculaire et le maintien de l’homéostasie vasculaire. Ils maintiennent l’intégrité du BBB grâce à des interactions physiques étroites et à la signalisation paracrine avec les cellules^{voisines 2} ; régulent dynamiquement le transport transendothélial via l’endocytose et l’expression de protéines transporteuses spécifiques ; et contribuent à la stabilité hémodynamique cérébrale par leurs activités contractiles et^{relaxantes 3}. Le dysfonctionnement des péricytes, ainsi que des modifications de leur couverture ou de leur densité, peuvent entraîner une dysrégulation vasculaire et des déficits neurologiques, aboutissant finalement à des modifications pathologiques associées à divers troubles^{neurologiques 4}. Cependant, l’hétérogénéité inhérente des péricytes pose des défis importants pour d’autres études mécanistiques.

Avec l’avancement de la technologie de séquençage de l’ARN unicellulaire (scRNA-seq), un nombre croissant d’études ont utilisé le scRNA-seq pour explorer l’hétérogénéité cellulaire et identifier des cibles clés dans la pathogenèse et la progression des maladies. Les marqueurs péricytaires couramment utilisés incluent le récepteur bêta du facteur de croissance dérivé des plaquettes (PDGFR-β)⁵, l’antigène glial neuronal 2 (NG2) et l’actine du muscle lisse alpha (α-SMA). Cependant, ces marqueurs présentent une spécificité⁶ relativement faible, car ils peuvent simultanément marquer d’autres cellules vasculaires, telles que les cellules musculaires lisses, et les cellules précurseurs neuronales comme les cellules progénitrices de l’oligodendrocyte, ce qui rend difficile la distinction des péricytes des autres cellules cérébrales. À la recherche d’une alternative plus robuste, nous nous sommes tournés vers CD13 (Aminopeptidase N, APN), un marqueur largement reconnu pour son expression forte et constante dans les péricytes cérébrovasculaires lors d’études^antérieures 7,8,9,10. Dans notre étude, nous avons réalisé une coloration par immunofluorescence sur des sections de tissu cérébral, et les résultats ont confirmé l’expression de CD13 dans les péricytes, démontrant son efficacité pour distinguer péricytes des cellules endothéliales, car le signal CD13 était exclusivement associé aux cellules périvasculaires et absent des cellules endothéliales CD31⁺. (Figure 1A). Cependant, il est important de noter que l’expression de CD13 n’est pas entièrement exclusive aux péricytes ; Des niveaux détectables sont également observés dans les cellules musculaires lisses des artérioles et des vénuelles (Figure 1B,C).

Figure 1 : La coloration par immunofluorescence montre l’expression de CD13 dans les péricytes vasculaires cérébraux et les cellules musculaires lisses, sans signal détectable dans les cellules endothéliales. (A) Imagerie immunofluorescence représentative de la zone de transition artériole-capillaire dans la microvasculature cérébrale. L’image fusionnée montre un péricyte CD13⁺ (vert) enveloppant les cellules endothéliales CD31⁺ (rouge). Les cellules musculaires lisses ^α-SMA+ (cyan) sont localisées dans la région artériolaire et sont absentes des capillaires. (B) Coupe transversale d’une artériole. Les images montrent une co-localisation claire du péricyte CD13⁺ (vert) et des cellules musculaires lisses ^α-SMA+ (cyan) dans la couche lisseuse environnante, confirmant l’expression du CD13 dans les cellules musculaires lisses artériolaires. (C) Coupe transversale d’une venule. De même, CD13 (vert) est détectable dans les cellules musculaires lisses α-SMA (pointes de flèches) de la paroi venulaire. Barre-écaille : 20 μm (A-C). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Pour obtenir des péricytes vasculaires corticaux de souris répondant aux exigences du scRNA-seq, nous avons effectué un tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) en utilisant le marquage des anticorps CD13⁺/CD31⁻ pour l’isolation des^{péricytes 11}. Initialement, les marqueurs CD45 et CD41 ont été utilisés pour exclure les cellules hématopoïétiques des suspensions^{cérébrales 12}. Par la suite, les péricytes ont été enrichis en sélectionnant les cellules CD13⁺ , et les cellules endothéliales ont été en outre exclues par la gating ^{pour les populations} CD31, isolant ainsi la population cible de péricytes¹³.

Nous reconnaissons que l’étape de sélection positive au CD13 capture simultanément les cellules musculaires lisses exprimant le CD13 à partir des artérioles et des venules. Pour satisfaire aux exigences critiques du scRNA-seq et maximiser la rétention des péricytes, nous avons stratégiquement sélectionné cette combinaison de marqueurs pour prioriser le rendement des péricytes lors de la phase de tri. Bien que cette approche conduise à la co-isolation d’une population mineure de cellules musculaires lisses, elle maximise efficacement la récupération de tous les péricytes potentiels durant la phase préliminaire d’enrichissement. Cette stratégie de gating progressive minimise considérablement la perte cellulaire initiale. De plus, pour maximiser la viabilité et le rendement des péricytes, nous avons également utilisé une solution BSA à 20 % pour la resuspension et la filtration cellulaires post-dissociation, éliminant efficacement les débris tout en préservant la viabilité et la pureté cellulaires^{triées 14}.

Grâce à cette méthode, nous avons réussi à distinguer les péricytes vasculaires cérébraux des autres types cellulaires, obtenant des préparations de péricytes de haute pureté et de viabilité qui répondent aux exigences strictes pour le scRNA-seq. Cette technique fournit une base solide pour des recherches approfondies ultérieures sur le rôle des péricytes dans divers contextes de maladies.

Protocole

Dans cette étude, nous avons utilisé trois souris adultes C57BL/6J (3 mois, 20-25 g). Toutes les souris étaient hébergées sous un cycle clair/obscur de 12 heures avec une température et une humidité strictement contrôlées, avec un accès libre à la nourriture et à l’eau avant les expériences. Toutes les procédures expérimentales impliquant des animaux de laboratoire ont été approuvées par le Comité de soins et d’éthique des animaux de laboratoire de l’Institut de Microcirculation, de l’Académie chinoise des sciences médicales et du Collège médical de l’Union de Pékin, et ont été menées en stricte conformité avec les directives pertinentes sur le bien-être animal.

1. Préparation des réactifs

1. Solution de glucose à 30 % (en poid/vol) : dissoudre 15 g de glucose dans 50 mL de_{dH 2}O sans DNase Ultrapure/RNase. Pour garantir une dissolution complète, ajoutez d’abord du glucose à 20 mL de_{dH 2}O sans DNase/RNase UltraPure et mélangez soigneusement. Ajoutez ensuite du_{dH 2}O sans DNase/RNase UltraPure à un volume final de 50 mL. Filtrez la solution et conservez à 4 °C pendant jusqu’à 6 mois.
2. DNase I (10 mg/mL) : Dissouds 50 mg de DNase I dans 5 mL de ddH_2Ostérile. La solution d’origine peut être conservée à -20 °C pendant jusqu’à 2 mois.
   REMARQUE : Les cycles répétés de gel-dégel doivent être strictement évités afin d’éviter la perte d’activité enzymatique. Pour minimiser les effets de congélation-dégel, on applique 150 μL de la solution dans des tubes de microcentrifuge stériles avant la congélation initiale, et on dégèle des aliquotes individuelles selon les besoins pour les expériences.
3. 2 % (vol/vol) de sérum bovin fœtal (FBS) dans une solution séline tamponnée phosphate (PBS) : Préparez 1× PBS en mélangeant 5 mL de 10× PBS avec 45 mL de_{dH 2}O UltraPure DNase/RNase sans RNASE. Ajoutez 1 mL de FBS à 49 mL de 1× PBS et mélangez soigneusement.
   REMARQUE : Préparez cette solution à neuf lors de l’étape 2.1.2. Allouez 15 mL par échantillon de tissu.
4. Solution stock de collagénase et d’enzymes dispase (CD) : dissoudre séparément 100 mg de dispase et 100 mg de collagénase dans 1 mL de_{dH 2}O sans RNASE UltraPure. Combinez les solutions pour obtenir un volume final de 2 mL (concentration enzymatique de 100 mg/mL).
   REMARQUE : Aliquot 500 μL dans des tubes microcentrifuges stériles et conservés à -20 °C. Vortex avant utilisation pour éviter la perte d’activité due aux cycles de gel-dégel. Il est important de noter que la forme en poudre peut provoquer une irritation sévère de la peau ou des yeux ainsi que des troubles respiratoires. Manipulez-la toujours dans une hotte chimique en portant des gants en nitrile et un masque N95. En cas d’exposition, irriguez immédiatement la zone affectée avec beaucoup d’eau et consultez un médecin.
5. Solution de travail enzymatique CD : Mélangez 1,5 mL de solution stock enzymatique CD avec 43,5 mL de FBS à 2 % (vol/vol) dans PBS (à partir de l’étape 1.3) par inversion douce.
   REMARQUE : Préparez-vous immédiatement avant la dissociation tissulaire (Étape 2.3.4). Ce volume est optimisé pour trois souris ; Ajustez proportionnellement selon les besoins.
6. Solution Percoll à 22 % (vol/vol) : Combinez 11 mL de Percoll, 5 mL de 10× PBS et 34 mL de dH₂O sans RNase UltraPure DNase/RNase pour préparer une solution de 50 mL.
   REMARQUE : Filtrez-stérilisez à travers une membrane PES de 0,22 μm. Il peut être stocké à 4 °C pendant un mois sans perte significative de stabilité.
7. Tampon de dissociation mécanique : Ajoutez 1 mL de DNase I (10 mg/mL) à 10 mL de FBS à 2 % (vol/vol) dans PBS (à partir de l’étape 1.3). Mélangez en pipotette.
8. Solutions BSA : Préparez séparément des solutions BSA à 1 %, 20 % et 35 % (en poids/vol) comme suit :
   1. 1 % (en poire/vol) BSA : dissoudre 0,15 g de BSA dans 15 mL de solution séline tamponnée phosphate (DPBS) de Dulbecco.
   2. 20 % (en poids/vol) de BSA : dissoudre 3 g de BSA dans 15 mL de DPBS.
   3. 35 % (en poids/vol) BSA : dissoudre 0,7 g de BSA dans 2 mL de DPBS.
      REMARQUE : Filtrez toutes les solutions à travers une membrane PES de 0,22 μm avant utilisation.
9. Solution salée équilibrée de Hanks (HBSS)/BSA/Tampon de glucose : Ajoutez 167 μL de glucose à 30 % (en poids/vol) (du Step 1.1) et 1,4 mL de BSA à 35 % (en poid/vol) (du Step 1.8) à 50 mL de HBSS, mélangez doucement.
   REMARQUE : Préparez cette solution fraîchement en conditions stériles lors de l’étape 2.1.2. Conservez à 4 °C jusqu’à utilisation.
10. Tampon de collecte tissulaire : Compléter 12 mL de tampon HBSS/BSA/Glucose (à partir de l’étape 1.9) avec 800 μL de DNase I (10 mg/mL). À utiliser pour le stockage temporaire des tissus et le rinçage de pipettes.
    REMARQUE : Préparez cette solution fraîchement en conditions stériles lors de l’étape 2.1.2.
11. Solution de tribromoéthanol à 1,25 % (en p/v) : Dissoudre 1,25 g de 2,2,2-Tribromoéthanol dans 2,5 ml de 2-Méthyl-2-butanol, puis ajouter ce mélange à 97,5 ml de ddH_2Ostérile ou de solution physiologique pour obtenir une solution claire de tribromoéthanol à 1,25 %.
    REMARQUE : Préparez la solution fraîchement avant chaque utilisation. Conservez-le à l’abri de la lumière à température ambiante et utilisez-le rapidement.

2. Procédure expérimentale (en prenant trois souris comme exemple)

1. Préparation avant l’expérience (Chronométrage : 30 min)
   1. Autoclave nécessitait des consommables et désinfectait les instruments chirurgicaux avec 75 % d’éthanol (vol/vol).
   2. Préparez les solutions fonctionnelles : 1× PBS (à partir de l’étape 1.3), FBS à 2 % (vol/vol) dans PBS (à partir de l’étape 1.3), HBSS/BSA/solution de glucose (à partir de l’étape 1.9), et tampon de collecte de tissus (à partir de l’étape 1.10).
   3. Versez 10 mL de 1× PBS dans un plat à cellules de 10 cm et laissez-le sur la glace.
   4. Préparez trois ampoules, ajoutez 3 mL de tampon de collecte de tissus à chacune, et gardez-les sur la glace.
   5. Préparez trois tubes centrifugeuses de 15 mL, ajoutez 10 mL de FBS à 2 % (vol/vol) dans du PBS à chacun, et conservez-les sur la glace.
2. Récolte de cerveaux de souris (Chronométrage : 30 min)
   1. Les souris ont été profondément anesthésiées par injection intrapéritonéale de tribromoéthanol (à partir de l’étape 1.11) à une dose de 0,2 mL pour 10 g de poids corporel. Après la perte des réflexes pédaliers, l’euthanasie a été pratiquée par luxation cervicale.
      REMARQUE : Si la souris n’atteignait pas un plan d’anesthésie chirurgicale (évaluée en l’absence de réflexe de retrait pédal) dans les 5 à 10 minutes suivant l’injection, une dose supplémentaire intraperitonéale de tribromoéthanol, équivalente à un tiers de la dose initiale, était administrée.
   2. Vaporisez la région de la tête et du cou avec 75 % d’éthanol. Faites une incision médiane du cuir chevelu de l’occipital au frontal pour exposer le crâne. Effectuer une incision transversale antérieure aux orbites bilatérales, suivie d’incisions latérales le long des bords inférieurs du cervelet pour détacher la base du crâne. Enfin, incisez le calvaire longitudinalement le long de la suture sagittale de postérieur vers antérieur. Soulevez le lambeau crânien pour exposer le cerveau enfermé en dure-mère. Soulever doucement le cerveau tout en sectionnant les nerfs optiques et la connexion moelle allongée-moelle épinière avec des ciseaux^{chirurgicaux 15}. Placez le cerveau intact dans une boîte de 10 cm contenant 10 mL de 1× PBS glacé.
      REMARQUE : Manipulez doucement le tissu pour éviter les dégâts.
   3. Transférez le cerveau dans du papier aluminium. À l’aide de pinces, soulevez la dure-mère des marges et excisez-la le long des sillons médiens. Après un retrait complet de la dure-dure, exposez l’espace sous-arachnoïdien. Rincez l’espace subarachnoïdien avec une solution HBSS, puis disséquez les vaisseaux à l’aide d’une aiguille émoussée et retirez soigneusement la pia mater¹⁶. Coupez le cerveau en tranches de 2 à 3 mm d’épaisseur à l’aide d’une lame de rasoir. Écartez les sections olfactives du bulbe et du caudal. Isolez le cortex cérébral le long du corps calleux et transférez le tissu cortical vers des ampoules contenant 3 mL de tampon de collecte^{tissulaire glacée 11}.
   4. L’isolement des péricytes dans ce protocole vise spécifiquement le cortex cérébral. Pour d’autres régions d’intérêt : placez des sections coronales dans une diapositive à deux puits avec une goutte de 2 % (vol/vol) FBS dans PBS. Identifier les régions cibles à la microscopie de dissection, isoler manuellement, puis procéder aux étapes de traitement identiques.
3. Dissociation tissulaire (Temps : 3-3,5 h)
   1. Réduire les tissus dans des ampoules à l’aide de scalpels chirurgicaux en fragments d’environ 1 mm × 1 mm.
      REMARQUE : Terminez le hachage en 5 minutes pour préserver la fraîcheur des tissus.
   2. Pré-rinçez les pointes de pipette avec un tampon de collecte de tissu. Aspirez lentement les fragments hachés vers l’apex de la pointe tout en gardant une orientation verticale (pointe vers le bas). Expulsez doucement les fragments dans des tubes centrifugeuses pré-refroidis de 15 mL (préparés à l’étape 2.1.5).
      REMARQUE : Évitez d’aspirer des fragments dans le canon supérieur pour éviter qu’ils ne adhèrent à la paroi de la pipette.
   3. Lavez les ampoules contenant des fragments (de l’étape 2.3.1) avec 2 % (vol/vol) FBS dans le PBS et transférez le lavage dans des tubes centrifugeuses. Centrifugez à 300 x g à 4 °C pendant 5 minutes.
   4. Rejetez les surnatants après centrifugation. Resuspendez les granulés dans 3 mL de solution enzymatique de travail CD (à partir de l’étape 1.5) par tube. Divisez chaque suspension également en trois tubes (total 9 tubes, 1 mL/tube), puis complétez avec 4 mL de solution enzymatique de travail CD (volume final : 5 mL/tube).
   5. Incubez les tubes dans un four d’hybridation à 37 °C pendant 100 minutes avec un secouement orbital à 100 x^{g 14}.
   6. Préparez la solution de dissociation tissulaire pendant l’incubation en ajoutant 1 mL de solution de DNase I à 10 mL de FBS à 2 % (vol/vol) dans PBS (à partir de l’étape 1.10).
   7. Terminez la digestion par centrifugation à 300 x g à 4 °C pendant 5 minutes.
      REMARQUE : Évaluez l’efficacité digérative de façon microscopique à l’aide d’une aliquote de 10 à 20 μL. L’extrémité idéale se manifeste sous forme de fragments vasculaires en forme de perles ; Des segments vasculaires allongés indiquent une sous-digestion, tandis que les cellules uniques prédominantes indiquent une surdigestion.
   8. Resuspendez les granulés dans 1 mL de solution de dissociation tissulaire par tube. Dissociez-vous mécaniquement en pipettant 100 fois¹¹.
      REMARQUE : Évitez l’aspiration en volume complet de pipette afin de minimiser la formation de bulles et de préserver la viabilité cellulaire.
   9. Regroupez toutes les suspensions (sur un total de 9 tubes de digestion représentant les tissus cérébraux de 3 souris) dans un tube centrifugeuse de 50 mL. Rincez chaque tube de digestion avec 2 mL de FBS à 2 % (vol/vol) dans PBS et combinez les lavages. Centrifugez à 300 x g à 4 °C pendant 5 minutes.
   10. Après centrifugation, des couches distinctes sont visibles. Éliminer soigneusement la couche supérieure (contenant des impuretés et de petits débris cellulaires), tout en conservant la couche intermédiaire (composée de cellules ou groupes cellulaires de densité plus faible) et la couche inférieure (cellules intactes et fragments de tissu partiellement non digérés). Ajoutez 12,5 mL de solution à 20 % de BSA et inversez doucement le tube pour resuspendre les granules. Centrifugez à nouveau à 1000 × g à 4 °C pendant 20 minutes.
   11. Collectez la granule du fond (enrichie dans des cellules intactes de plus grande pureté) et transférez le surnageant (contenant principalement des débris de myéline, des lipides et un petit nombre de cellules) dans un nouveau tube centrifugeuse de 50 mL. Reposez par inversion douce et répétez centrifugeuse à 1 000 x g à 4 °C pendant 20 minutes.
   12. Resuspendez chaque pellet obtenu des deux étapes de centrifugation (étape 2.3.10 et étape 2.3.11) dans 2 mL de 2 % (vol/vol) FBS en PBS chacun (volume combiné final : 4 mL).
       REMARQUE : Évitez de toucher les parois des tubes lors de la resuspension afin de minimiser la contamination par les débris.
   13. Combinez les deux suspensions resuspendues de l’étape précédente dans un tube centrifugeuse de 15 mL. Centrifugeuse à 300 × g, 4 °C pendant 5 minutes. Éliminez le surnageant (tampon de déchets contenant de la BSA, des débris cellulaires et potentiellement des traces de lipides myéliniques résiduels). Resuspendez le pellet (les cellules cibles finales purifiées et lavées, intactes à haute pureté) dans 2 mL de solution PBS contenant 2 % de FBS.
       REMARQUE : Cette étape consiste à transférer les cellules dans un tampon de suspension propre et adapté pour les applications en aval.
   14. Préparez quatre tubes centrifugeuses de 15 mL, chacun contenant 4 mL de solution Percoll à 22 %. Posez doucement 0,5 mL d’aliquotes de la resuspension sur le gradient de Percoll (quatre aliquotes au total) pour maximiser le rendement de la cellule. Centrifugez à 560 x g à 4 °C pendant 10 minutes.
       REMARQUE : Réglez la centrifugeuse en mode « pas de frein » pour éviter la perturbation du gradient de densité induite par le vortex, afin de garantir que les débris myéliniques restent stabilisés dans le surnageant.
   15. Aspirez soigneusement les surnatants. Resuspendez les granulés dans 1 mL de tampon HBSS/BSA/glucose par tube. Suspensions de piscine dans un nouveau tube de 15 mL. Rincez les tubes de Percoll avec 2 mL de tampon HBSS/BSA/glucose et combinez les lavages. Centrifugeuse à 300 x g à 4 °C pendant 5 minutes).
4. Préparation et acquisition de tri par cytométrie en écoulement (Temporisation : 50 min)
   1. Aspirez soigneusement le surnageant. Resuspendez le comprimé cellulaire dans 1 mL de tampon HBSS/BSA/glucose.
   2. Ajoutez 5 μL de réactif bloquant le récepteur Fc (FcR) à la suspension cellulaire et incubez à 4 °C pendant 5 minutes.
   3. Ajouter les anticorps conjugués fluorescentement suivants à la suspension cellulaire aux volumes indiqués (suffisants pour les tissus dérivés de 3 souris) : 5 μL de CD45-PE ; 5 μL de CD41-PE ; 20 μL de CD31-APC ; 15 μL de CD13-FITC.
   4. Incubez les cellules sur de la glace pendant 20 minutes dans le noir.
      REMARQUE : Protégez de la lumière. Évitez de remuer.
   5. Ajoutez 6 mL de HBSS/BSA/tampon de glucose pour laver les cellules. Centrifugez à 300 x g à 4 °C pendant 5 minutes.
   6. Aspirez le surnageant. Resuspendez le comprimé cellulaire dans 1 mL de tampon HBSS/BSA/glucose. Ajoutez 200 μL de solution 7-aminoactinomycine D (7-AAD) (pour exclure les cellules mortes) et incubez sur de la glace pendant 10 minutes. Ensuite, ajustez le volume à 2 mL avec HBSS/BSA/tampon de glucose.
      REMARQUE : Protégez de la lumière.
   7. Ajoutez une solution BSA à 1 % pour trier les tubes de collecte (tubes coniques de 15 mL), faites doucement tourner pour rincer les surfaces internes. Aspirez la solution excédentaire, laissant exactement 1 mL de solution de BSA à 1 % dans chaque tube pour recevoir les cellules triées. Conserver temporairement sur la glace.
   8. Filtrez la suspension des cellules colorées à travers un tamis de 40 μm juste avant le tri.
   9. Établir une porte initiale basée sur les paramètres de diffusion avant (FSC-A) et de dispersion latérale (SSC-A) afin d’exclure les débris cellulaires présentant de faibles signaux FSC-A/SSC-A.
   10. La déplétion des cellules de lignée hématopoïétique a été obtenue par un gating dual-négatif pour CD45 et CD41, éliminant efficacement la contamination des leucocytes, des cellules immunitaires et des plaquettes.
   11. Capturer les péricytes présumés par sélection CD13-positive à partir de cellules de la paroi vasculaire.
   12. Évaluer l’intégrité des membranes via un sondage fluorescent 7-AAD ; exclure les cellules apoptotiques par la porte de signalement 7-AAD⁻.
       REMARQUE : Collectez des péricytes de haute pureté CD31⁻/CD13⁺ via sélection CD31-négative. Collectez les péricytes triés directement dans des tubes contenant 1 % de BSA (de l’étape 2.4.7) et placez-les sur la glace. Préparez immédiatement les suspensions monocellulaires pour le comptage. Ensuite, charge directement les échantillons pour le séquençage, sans aucune étape intermédiaire de la culture.
5. Séquence et analyse scRNA (Tming : 3-4 jours)
   1. Des suspensions monocellulaires de péricytes triés ont été préparées selon le protocole tiré du guide utilisateur des 10x Genomics « GEM-X Universal 3' Gene Expression v4 4-plex Reagent Kits » (CG000731^)17,18. La suspension de cellules préparée pour la charge avait une viabilité de > 90 % et était diluée à une concentration dans la plage recommandée de 300-2000 cellules/μL.
   2. Combinez la suspension monocellulaire avec des billes de gel codées à barres et des enzymes, puis séparez en billes de gel en émulsion (GEM) via une encapsulation microfluidique^{de gouttelettes 19}. Effectuer une lyse cellulaire in situ , une transcription inverse et la liaison code-barres-ADNc.
   3. Brisez les GEMs pour récupérer des produits. Amplifier l’ADNc par PCR selon le protocole suivant : dénaturation initiale à 9 °C pendant 4 secondes ; suivi d’un cycle (13 cycles pour <500 cellules cibles, 12 cycles pour 501-6000 cellules cibles) comprenant une dénaturation à 9 °C pendant 2 s, un recuit à 9 °C pendant 3 s, et une extension à 7 °C pendant 6 s par cycle ; et une extension finale à 72 °C pendant 1 minute suivie d’un maintien à 4 °C. Validez les produits amplifiés pour la taille du fragment (200-300 pb) et le rendement.
      REMARQUE : Les produits d’amplification peuvent être stockés à 4 °C pendant jusqu’à 72 heures ou à -2 °C pendant une semaine, ou bien traités directement à l’étape suivante.
   4. Pour l’ADN qualifié : fragmenter, effectuer une réparation de l’extrémité, ligater l’adaptateur P7 et amplifier avec des amorces index. Sélectionnez la taille des fragments pour construire des bibliothèques de séquençage.
   5. Bibliothèques de séquences sur la plateforme Illumina NovaSeq après validation QC.
   6. Séquençage les données de démultiplexage pour extraire les codes-barres cellulaires, les identifiants moléculaires uniques (UMI) et les séquences d’ARN. Aligner lit avec le génome de référence.
   7. Quantifiez les nombres d’UMI, estimez le nombre de cellules valides et générez une matrice d’expression^{gène-code-barres 20}.
   8. Supprimez les doublets en utilisant le package DoubletFinder (v2.0.6) dans R. Prédisez en se basant sur l’identification artificielle du plus proche voisin pour garantir la qualité des données.
   9. Réaliser une analyse en composantes principales (PCA) et une réduction de dimensionnalité par Uniform Varifold Approximation and Projection (UMAP) en utilisant Seurat (v5.0). Identifier les groupes cellulaires et visualiser les gènes marqueurs spécifiques aux péricytes pour valider l’identité cellulaire.

Résultats

Pour obtenir une isolation précise des péricytes cérébraux, les cellules dissociées du tissu cérébral ont été colorées avec PE Texas Red anti-souris CD41/CD45, anti-souris conjugué FITC CD13 et anti-souris conjugué APC CD31, établissant une stratégie de tri en plusieurs étapes intégrant marqueurs de surface et détection de viabilité (Figure 2). Le filtrage initial basé sur les paramètres de diffusion avant (FSC-A) et de dispersion latérale (SSC-A) a effectiv...

Discussion

Cette étude décrit une stratégie FACS systématiquement optimisée et validée, basée sur le marquage multicolore CD13⁺/CD31⁻ pour l’isolation très efficace des péricytes vasculaires cérébraux^{de souris 24}. Les analyses cytométriques en flux et les analyses ultérieures du scRNA-seq ont confirmé que la méthode distingue précisément les péricytes des cellules endothéliales et produit des cellules qui répondent systématiquement à tous les indicateurs critiques de contrôl...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibicol	A5669701	Aliquot et conserver à -20°C; peut être conservé à 4°C jusqu'à 1 semaine après décongélation
Phosphate Buffered Saline(10×PBS, pH 7,4)	Life Technologies	70011-044	Dilution avant utilisation pour le lavage cellulaire
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G7021-1KG	Pour la préparation du tampon énergétique cellulaire
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A1933-25g	Protège les cellules et empêche l'adhérence
Dulbecco's  Phosphate Buffered Saline (DPBS,1×)	Gibco	14190-144
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS,1×)	Life Technologies	14175-095	Pour le lavage et la resuspension cellulaire
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water	Life Technologies	10977-015	Pour la préparation de systèmes de réaction sans nucléase
Collagenase/Dispase	Sigma-Aldrich	11097113001-100mg	Pour la digestion des tissus et la dissociation cellulaire; aliquoter et conserver à -20°C
DNaseI(RNase-Free)	TIANGEN	RT411-1500U	Prévient l'agrégation de l'ADN; aliquoter et conserver à -20°C
Percoll	Sigma-Aldrich	P1644-100ML	Pour la séparation cellulaire; conserver à 4°C
FITC Rat Anti-Mouse CD13	BD Biosciences	558744	Conjugué fluorescent; conserver à l'abri de la lumière à 4°C pendant un mois maximum
APC Rat Anti-Mouse CD31	BD Biosciences	551262	Conserver à l'abri de la lumière à 4°C pendant plusieurs mois
PE Rat Anti-Mouse CD41	BD Biosciences	558040	Conserver à l'abri de la lumière à 4°C pendant plusieurs mois
PE Rat Anti-Mouse CD45	BD Biosciences	553081	Conserver à l'abri de la lumière à 4°C pendant plusieurs mois
FITC Rat IgG1, κ Isotype Control	BD Biosciences	552916	Contrôle de fluorescence; conserver à l'abri de la lumière à 4°C
APC Rat IgG2a, κ Isotype Control	BD Biosciences	553932	Conserver à l'abri de la lumière à 4°C pendant plusieurs mois
PE Rat IgG2b, κ Isotype Control	BD Biosciences	553989	Conserver à l'abri de la lumière à 4°C pendant plusieurs mois
RNase AWAY Decontamination Reagent	Ambion	10328011	Pour éliminer la contamination par les RNases
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block)	BD Pharmingen	553141	Prévient la liaison d'anticorps non spécifique
7-Aminoactinomycin D (7-AAD)	BD Pharmingen	559925	Pour l'exclusion des cellules mortes.
2,2,2-Tribromoethanol	Sigma-Aldrich	T48402-25g	Pour la préparation de la solution de tribromoéthanol à 1,25% (p/v)
2-Methyl-2-butanol	Psaitong	M20008-500mL	Pour la préparation de la solution de tribromoéthanol à 1,25% (p/v)
C57BL/6 mouse	Jiangsu Huachuang Xinnuo Pharmaceutical Technology Co., Ltd.	SYXK (Su) 2020-0041
50 mL centrifuge tube	Corning	430291
15 mL centrifuge tube	Corning	430791
cell cluture dish 100mm×20mm	Corning	430167
Cell Ranger		3.1.0/4.0.0	Logiciel d'analyse de données de séquençage à cellule unique
Loupe Cell Browser		4.1	Navigateur de cellules
STAR		2.5.1b	Alignement de l'ARN
irlbpy		-	Analyse de composante principale
tsne		0.15	Analyse Barnes-Hut t-SNE (t-Distributed Stochastic Neighbor Embedding)
k-means		0.17	Cloisonnement K-Means
graph-based clustering		0.17	Cloisonnement basé sur les graphes
FastQC		v0.11.2	Contrôle de qualité des données (QC)