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Article de recherche

L’axe NEAT1/miR-181a-5p/HMGB1 régule la polarisation des macrophages et l’inflammation dans les modèles de sepsis

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DOI :

10.3791/69802

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16 janvier 2026

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1Tianjin Medical University General Hospital, 2Department of Critical Care Medicine, Affiliated Hospital of Hebei University

Dans cet article

Résumé

Ce protocole intègre des échantillons cliniques, des macrophages cultivés et un modèle murin de ligature et ponction cécalienne (CLP) pour étudier comment l’axe NEAT1/miR-181a-5p/HMGB1 régule la polarisation des macrophages et l’inflammation en sepsis, fournissant des orientations étape par étape pouvant être adaptées à d’autres voies immunitaires médiées par lncRNA.

Résumé

La septicémie se caractérise par une réponse immunitaire de l’hôte dérégulée et reste une cause majeure de mortalité dans le monde. L’ARN non codant NEAT1 long a été impliqué dans des maladies inflammatoires, mais son rôle spécifique dans la polarisation des macrophages lors de la septicémie n’a pas été entièrement défini. Ici, nous examinons systématiquement l’axe NEAT1/miR-181a-5p/HMGB1 à travers des échantillons cliniques, des macrophages cultivés et un modèle souris CLP. La PCR quantitative, le western blotting, les tests de double luciférase et les expériences de tirage d’ARN sont utilisées pour confirmer l’interaction compétitive de l’ARN endogène (ceRNA) entre NEAT1, miR-181a-5p et HMGB1. Des tests fonctionnels, incluant l’immunofluorescence, la migration transwell et le marquage terminal par déoxynucléotyl transférase dUTP (TUNEL), sont appliqués pour évaluer la polarisation, la migration et l’apoptose des macrophages. In vivo, le modèle CLP combiné à ELISA et à l’histopathologie valide l’impact du knockdown de NEAT1 sur les profils cytokiniques et les lésions des organes. NEAT1 et HMGB1 sont augmentés, tandis que miR-181a-5p est régulé à la baisse, chez les patients atteints de septicémie et chez les macrophages stimulés par les lipopolysaccharides. Le silence du NEAT1 favorise la polarisation des macrophages M2, réduit les cytokines pro-inflammatoires, altère la migration des macrophages et soulage les lésions tissulaires chez les souris septiques via l’axe miR-181a-5p/HMGB1. À notre connaissance, il s’agit du premier protocole intégré à caractériser le circuit régulateur lncRNA-microARN-HMGB1 en septicémie à l’aide d’approches cliniques harmonisées, in vitro et in vivo. Il fournit un cadre méthodologique pour cibler les réseaux de ceRNA liés à NEAT1 comme stratégies thérapeutiques potentielles.

Introduction

La septicémie est définie comme un dysfonctionnement des organes mettant la vie en danger d’être causé par une réponse de l’hôte déréglée à l’infection1. Malgré les avancées dans la prise en charge clinique, sa mortalité reste élevée, et les mécanismes moléculaires sous-jacents au déséquilibre immunitaire ne sont pas entièrement compris 2,3. Parmi les régulateurs immunitaires, les ARN longs non codants (lncRNA) se sont révélés comme des modulateurs importants de la signalisation inflammatoire et de la fonctiondes macrophages 4,5. NEAT1, un transcript abondant enrichi en nucléaire, est un composant structurel des paraspeckles et a été associé à des réponses immunitaires et de lésionstissulaires 6,7. Des études antérieures ont lié le NEAT1 à une inflammation intestinale, à une ischémie/lésion de reperfusion, et au syndrome de détresse respiratoireaiguë 8,9,10.

Dans le contexte de la septicémie, les preuves accumulées indiquent que les ARNnc régulent la polarisation des macrophages et la signalisation inflammatoire, influençant ainsi la progression de la maladie et le résultat11,12. Par exemple, les ARNnc KCNQ1OT1 et SNHG1 ont été rapportés modulant la lésion myocardique induite par septicémie via des voies médiées parmicroARN 13,14. Cependant, la question de savoir si NEAT1 régule la polarisation des macrophages via l’axe miR-181a-5p/HMGB1 en sepsis n’a pas été définie de manière systématique. Pour combler cette lacune, nous avons établi un protocole qui combine des échantillons sanguins de patients, des macrophages RAW264.7 stimulés par des lipopolysaccharides, ainsi qu’un modèle murin de ligature cécale et de ponction pour interroger les axes NEAT1/miR-181a-5p/HMGB115,16. Utilisant la PCR quantitative, le western bloting, les tests de reportage à double luciférase, le tirage vers le bas de l’ARN et les lectures fonctionnelles de la polarisation, de la migration et de l’apoptose, des macrophages M1/M2, ce protocole fournit un cadre expérimental reproductible pour définir NEAT1 comme régulateur de la fonction des macrophages en sepsis et pour soutenir le développement de stratégies ciblant leslncRNA 17,18.

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Protocole

Toutes les procédures impliquant des participants humains ont été approuvées par le comité d’éthique de l’hôpital affilié de l’Université du Hebei (Approbation n° HDFY-LL-2021-232). Un consentement éclairé écrit a été obtenu de tous les participants ou, le cas échéant, de leurs mandataires légaux. Toutes les expériences animales ont été menées conformément aux directives institutionnelles et aux réglementations nationales, et ont été approuvées par le même comité d’éthique. Le protocole approuvé précisait les détails de la procédure de ligature et ponction cecalienne (CLP), l’administration d’adénoviraux, le protocole anesthésique et les critères humains.

Prélèvement d’échantillons patients

Les patients atteints de septicémie ont été recrutés prospectivement à l’Hôpital affilié de l’Université du Hebei entre février 2022 et juillet 2024. Un total de 50 patients répondaient aux critères d’inclusion, dont 26 hommes et 24 femmes, âgés de 24 à 69 ans (moyenne 52,4 ± 10,2 ans). La septicémie a été diagnostiquée selon les critères de Sepsis-3, nécessitant une infection suspectée ou confirmée ainsi qu’une augmentation du score de l’évaluation séquentielle de l’insuffisance organique (SOFA) de ≥ de 2 points. Pour chaque patient, la source principale de l’infection (telle que l’infection pulmonaire, intraabdominale, urinaire ou sanguine) et la gravité de la maladie (septicémie ou choc septique) ont été enregistrées, et la distribution des scores SOFA a été résumée pour caractériser la charge de la maladie. En tant que groupe témoin, 39 individus en bonne santé sans preuve clinique d’infection ou de maladie inflammatoire systémique ont été recrutés (20 hommes et 19 femmes, âgés de 26 à 70 ans, moyenne 50,7 ± 11,0 ans), et il n’y avait pas de différences significatives d’âge ou de sexe entre les groupes.

Le sang veineux periphérique a été prélevé chez les patients atteints de septicémie avant l’initiation du traitement spécifique à la septicémie lorsque cela était possible. Le sang (généralement 5 à 10 mL) était aspiré dans des tubes recouverts d’acide éthylénédiaminetétraacétique (EDTA) et légèrement inversé plusieurs fois pour mélanger l’anticoagulant. Les échantillons ont été traités dans environ 1 heure après la collecte. Le plasma était obtenu par centrifugation à 1 500 × g pendant 10 minutes à température ambiante, aliquoté dans des microtubes marqués, puis stocké à -80 °C pour des mesures ultérieures de cytokines. Pour l’extraction d’ARN et de protéines, des cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMC) ont été isolées à partir d’une portion des mêmes échantillons à l’aide d’un milieu de séparation à gradient de densité selon les instructions du fabricant. Les cellules ont ensuite été lavées deux fois dans le PBS, comptées, puis stockées sous forme de granulés cellulaires à -80 °C.

Culture cellulaire et transfection

Les cellules macrophages murines RAW264,7 ont été maintenues dans un milieu RPMI-1640 complété avec 10 % de sérum fœtal bovin inactivé par la chaleur, 100 U/mL de pénicilline et 100 μg/mL de streptomycine dans un incubateur humidifié à 37 °C avec 5 % deCO2. Les cellules étaient traversées avec un grattoir cellulaire avant d’atteindre la surconfluence afin de préserver un phénotype stable.

Pour la transfection, 264,7 cellules RAW264,7 ont été ensemencées à 5 ×10 cellules par puits dans des plaques à 6 puits dans 2 mL de milieu complet, environ 24 heures avant l’exposition au réactif. Lorsque les cultures atteignaient une confluence de 70-90 %, les acides nucléiques (tels que les plasmides d’expression NEAT1 ou HMGB1, les constructions en épingle à cheveux court, les mimiques ou inhibiteurs de miR-181a-5p, et leurs contrôles correspondants) étaient complexés avec un réactif de transfection lipidique dans un milieu sans sérum selon les instructions du fabricant. Typiquement, 2 à 3 μg d’ADN plasmidique ou 50 à 100 pmol de petit ARN étaient mélangés au volume recommandé de réactif, laissés à former des complexes à température ambiante pendant 10 à 15 minutes, puis ajoutés goutte à goutte aux cellules dans un milieu sans antibiotiques. Après 4 à 6 heures, le milieu était remplacé par un milieu complet frais, et les cellules étaient incubées pendant 24 à 48 heures supplémentaires avant des essais en aval.

Induction de polarisation des macrophages

Pour induire la polarisation inflammatoire des macrophages, les cellules RAW264.7 ont été laissées à adhérer dans des plaques à 6 puits pendant au moins 4 heures dans un milieu complet. Le milieu a ensuite été remplacé par du DMEM contenant 100 ng/mL de lipopolysaccharide (LPS), et les cellules ont été incubées pendant 6 heures à 37 °C avec 5 % deCO-2. Après stimulation, les cellules étaient immédiatement traitées pour l’extraction d’ARN et de protéines, la coloration par immunofluorescence, les tests de migration ou l’analyse de l’apoptose, selon le plan expérimental.

Réaction en chaîne quantitative en temps réel de la polymérase (qRT-PCR)

L’ARN total a été extrait de cellules cultivées, de PBMC ou de tissus de souris à l’aide d’un réactif monophasique à base de phénol-guanidinium selon les procédures standard. En résumé, les échantillons ont été lysés dans 1 mL de réactif par 106 cellules ou 50 à 100 mg de tissu, incubés pendant 5 minutes à température ambiante, puis mélangés vigoureusement au chloroforme (0,2 mL pour 1 mL de réactif). Après une incubation de 2 à 3 minutes, les lysats étaient centrifugés à 12 000 × g pendant 15 minutes à 4 °C pour séparer les phases. La phase aqueuse a été transférée dans un nouveau tube, et l’ARN a été précipité avec un volume égal d’isopropanol. Le mélange a ensuite été incubé pendant environ 10 minutes puis centrifugé à nouveau à 12 000 × g pendant 10 minutes à 4 °C. Le pellet obtenu a été lavé à 75 % d’éthanol, centrifugé à 7 500 × g pendant 5 minutes à 4 °C, brièvement séché à l’air, puis dissous dans de l’eau sans RNase. La concentration et la pureté de l’ARN ont été évaluées à l’aide de la spectrophotométrie UV, et des échantillons avec un rapport A260/A280 d’environ 1,8-2,0 ont été utilisés pour les analyses en aval. Lorsque cela était nécessaire, l’intégrité était vérifiée par électrophorèse sur gel d’agarose.

L’ADN complémentaire (cDNA) a été synthétisé à partir d’ARN total à l’aide d’un kit de transcription inversée commercialement disponible, suivant les instructions du fabricant. Pour miR-181a-5p, des amorces spécifiques à gènes ou à lanche tige ont été utilisées selon recommandation. La PCR quantitative en temps réel a été réalisée à l’aide d’un système de PCR en temps réel et d’un mélange maître approprié (comme la chimie SYBR Green- ou basée sur la sonde) dans un volume total de réaction de 20 μL contenant un gabarit d’ADNc et 0,2 à 0,4 μM de chaque amorce. Les conditions typiques de cyclage comprenaient une dénaturation initiale à 95 °C pendant 3 minutes, suivie de 40 cycles à 95 °C pendant 10 s et 60 °C pendant 30 s, avec une analyse de la courbe de fusion lorsque nécessaire pour confirmer la spécificité de l’amplicon. Les niveaux d’expression de NEAT1 et HMGB1 ont été normalisés en GAPDH, et l’expression de miR-181a-5p a été normalisée en petits ARN nucléaires U6. L’expression relative a été calculée à l’aide de la méthode 2-ΔΔCt et exprimée comme un changement de pli par rapport aux groupes témoins. Les séquences d’amorces et les tailles d’amplicons ont été compilées dans un tableau distinct pour être soumis sous forme de Tableau Supplémentaire 1.

Plaque western

Pour le western blotting, les cellules ont été lavées deux fois avec du PBS glacé et lysées dans un tampon approprié par immunoprécipitation radio-précipitée (RIPA) complété par des inhibiteurs de protéase. Les lysats ont été incubés sur glace pendant 15 à 30 minutes avec un mélange doux occasionnel, puis centrifugés à 12 000 × g pendant 15 minutes à 4 °C pour éliminer les débris cellulaires. Les surnadants ont été collectés, et les concentrations de protéines ont été déterminées à l’aide d’un test d’acide bicinchoninique (ACB).

Des quantités égales de protéines (typiquement 40 μg par voie) ont été mélangées avec un tampon de chargement, bouillies à 95 °C pendant 5 à 10 minutes pour dénaturer les protéines, puis séparées sur des gels de sulfate de dodécyle (SDS)-polyacrylamide de concentration appropriée en acrylamide (par exemple, 10-12 % pour HMGB1). Les protéines ont été transférées sur des membranes de fluorure de polyvinylidène (PVDF) à l’aide d’un système de transfert humide ou semi-sec dans des conditions recommandées pour la plage de poids moléculaire d’intérêt. Les membranes ont été bloquées avec 5 % de lait écrémé ou d’albumine sérique bovine (BSA) dans une solution saline tris-tamponnée avec 0,1 % Tween-20 (TBST) pendant 1 heure à température ambiante, puis incubées toute la nuit à 4 °C avec des anticorps primaires contre HMGB1 (par exemple, dilution 1:500) et GAPDH (par exemple, dilution 1:1 000) dilués dans un tampon bloquant. Après trois lavages dans TBST, les membranes ont été incubées avec des anticorps secondaires conjugués à la peroxydase de raifort appropriés pendant 1 h à température ambiante. Après des lavages supplémentaires, les bandes protéiques ont été visualisées à l’aide d’un substrat chimiluminescence amélioré et capturées avec un système d’imagerie numérique. Les intensités des bandes ont été quantifiées à l’aide d’un logiciel d’analyse d’image, les signaux HMGB1 ont été normalisés en GAPDH, et l’expression relative a été comparée entre les groupes.

Essai de reporter dual-luciférase

Des fragments de type sauvage et mutants de NEAT1 et de la région non traduite 3′ de HMGB1 (3′-UTR) contenant les sites de liaison miR-181a-5p prédits ont été clonés en un vecteur rapporteurluciférase 19. Tous les constructs ont été vérifiés par séquençage de Sanger pour confirmer les sites d’insertion et demutation 20. Les cellules RAW264,7 ont été ensemencées dans des plaques à 24 puits et laissées à adhérer toute la nuit. Les cellules ont ensuite été co-transfectées avec des plasmides rapporteurs et soit par des inhibiteurs de miR-181a-5p, des mimiques, ou des contrôles négatifs correspondants à l’aide d’un réactif de transfection à base de lipides, comme décrit pour la procédure générale de transfection.

Après environ 24 à 48 heures d’incubation, les cellules ont été lavées avec du PBS, lysées dans un tampon de lyse passif approprié (par exemple, 20 μL par puits), puis légèrement agitées pour assurer une lyse complète. L’activité de la luciférase a été mesurée à l’aide d’un kit de dosage à double luciférase et d’un luminomètre, conformément aux instructions du fabricant. L’activité luciférase de la luciole a été normalisée en activité luciférase de Renilla pour contrôler l’efficacité de la transfection, et l’activité relative de la luciférase de chaque groupe a été comparée au témoin correspondant.

Essai de migration Transwell

La migration des macrophages a été évaluée à l’aide de chambres transwell pré-recouvertes d’un gel de matrice extracellulaire adapté aux essais d’invasion cellulaire. Le gel a été dilué à 1:6 dans un milieu sans sérum sur glace, et 50 μL de la solution diluée ont été ajoutés à la surface supérieure de chaque insert. La plaque a été incubée à 37 °C pendant environ 4 heures afin de permettre au gel de se solidifier. Des cellules RAW264,7 transfectées ou traitées ont été prélevées, remises en suspension dans un milieu sans sérum à 1 × 106 cellules/mL, et 100 μL de suspension cellulaire (1 × 105 cellules) ont été ajoutées à la chambre supérieure. La chambre inférieure a été remplie de 600 μL de milieu complet contenant 10 % de sérum bovin fœtal en tant que chimioattrant.

Les cellules ont été incubées à 37 °C avec 5 % deCO2 pendant 24 heures. À la fin de l’incubation, les cellules non migratrices restantes sur la surface supérieure de la membrane ont été délicatement retirées avec un coton-tige. Les cellules migrées adhérentes à la surface inférieure de la membrane ont été fixées avec 95 % d’éthanol pendant environ 20 minutes à température ambiante, puis colorées avec une solution de violet cristallin à 0,5 % pendant 10 à 15 minutes. L’excès de colorant était éliminé par lavage avec PBS, et les membranes étaient séchées à l’air. Les cellules migrées ont été examinées au microscope optique, et les cellules de plusieurs champs sélectionnés au hasard par insert ont été comptées de manière aveugle pour quantifier la capacité migratoire.

Essai d’apoptose TUNEL

Pour la détection de l’apoptose, les cellules RAW264.7 ont été cultivées sur des bâtons de verre et soumises aux traitements ou transfections indiqués. Les cellules ont été fixées avec 4 % de paraformoldéhyde pendant 30 à 60 minutes à température ambiante puis rincées avec du PBS. L’activité endogène de la peroxydase a été bloquée par l’incubation dans du peroxyde d’hydrogène à 0,3 % pendant 20 minutes, suivie de lavages de PBS. Un kit de test TUNEL a été utilisé, et le mélange de marquage a été appliqué pour recouvrir les cellules. Les échantillons ont été incubés à 37 °C pendant environ 60 minutes dans une chambre humidifiée, et la réaction a été arrêtée conformément aux instructions du kit. Après incubation avec de la streptavidine-HRP ou un réactif de détection équivalent pendant 30 minutes à 37 °C, les noyaux ont été visualisés avec un substrat chromogénique tel que la 3,3′-diaminobenzidine (DAB) jusqu’à ce que des noyaux apoptotiques colorés en brun deviennent visibles. Les lames étaient contre-colorées à l’hématoxyline, déshydratées par de l’éthanol gradué, dégagées en xylène et montées avec un milieu permanent. Des cellules apoptotiques et des noyaux totaux ont été observés au microscope optique, et l’indice apoptotique a été calculé en pourcentage de cellules TUNEL-positives.

Immunofluorescence

Pour l’immunofluorescence, des sections tissulaires enfouies dans la paraffine ont été décirées dans le xylène et réhydratées à travers une série éthanol graduée dans de l’eau. La récupération d’antigènes a été réalisée à l’aide d’un tampon approprié (tel qu’un tampon de citrate, pH 6,0) et la récupération de l’épitope induite par la chaleur par micro-ondes ou cocotte-minute, selon les recommandations des anticorps. Après refroidissement et rinçage, les sections ont été bloquées avec un sérum normal à 5 % dans le PBS pendant 1 heure à 37 °C afin de réduire la liaison non spécifique. Les tissus ont ensuite été incubés toute la nuit à 4 °C avec des anticorps primaires contre les marqueurs de polarisation des macrophages et les cytokines inflammatoires, notamment CD206, TNF-α, IL-1β, IL-6, synthase d’oxyde nitrique inductible (iNOS), IL-4, IL-10 et Arg-1 (généralement à 1:500 de dilution), dilués dans un tampon de blocage.

Le lendemain, les sections ont été lavées au PBS et incubées avec des anticorps secondaires conjugués au fluorophore appropriés pendant 1 heure à 37 °C dans l’obscurité. Les noyaux ont été contre-colorés avec 4′,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) pendant 5 minutes. Après les lavages finaux, les sections ont été montées avec un support anti-décoloration et examinées au microscope à fluorescence à l’aide de filtres adaptés. Les images ont été obtenues avec des réglages d’exposition cohérents entre groupes, et des barres d’échelle (par exemple, 20 μm) ainsi que des grossissements étaient indiqués dans toutes les cases et légendes de figures.

Modèle souris de sepsis induite par CLP

Les mâles C57BL/6 souris (24-32 g) ont été acclimatés pendant au moins une semaine avant l’opération puis répartis aléatoirement dans les groupes Sham, CLP, CLP plus épingle courte témoins négatif, ou CLP plus NEAT1 épingle courte (n = 6 par groupe). Les souris ont été anesthésiées par inhalation d’éther dans une chambre fermée pendant environ 1 à 3 minutes, jusqu’à la perte de l’éther du réflexe de redressement ou d’un autre anesthésique approuvé par l’institution, à une dose et une durée d’exposition qui ont entraîné la perte du réflexe de redressement tout en maintenant une fonction respiratoire adéquate. Les poils abdominaux ont été rasés et la peau désinfectée avec une solution antiseptique appropriée. Une laparotomie de la ligne médiane d’environ 1 à 2 cm a été réalisée pour exposer le cecum avec son intestin adjacent.

Pour la CLP, le cecum a été doucement extériorisé et ligaturé avec une suture stérile sur environ les deux tiers de sa longueur, en veillant à ne pas obstruer la valve iléocécale ni compromettre le flux sanguin mésentérique. Le cæcum ligaturé a été perforé deux fois avec une aiguille stérile de la jauge spécifiée dans le protocole approuvé (par exemple, 21 G), et une petite quantité de matières fécales a été doucement extrudée pour assurer la persévérance des sites de ponction. Le cecum a ensuite été remis dans la cavité péritonéale, et la paroi abdominale ainsi que la peau ont été refermées en couches avec des points de suture. Les souris opérées par simulacre subissaient la même laparotomie et exposition au cecum sans ligature ni perforation.

Pour obtenir un knockdown in vivo de NEAT1, un vecteur adénoviral codant shNEAT1 et un vecteur témoin négatif correspondant ont été préparés à un titre défini (par exemple, 1 ×10 9 unités formant des plaques/mL). Un volume fixe de suspension virale (tel que 100 μL par souris) était administré via la veine du queue à un moment spécifié par rapport à la CLP (par exemple, 1 h après l’opération), tel que décrit dans le plan expérimental et approuvé par le comité d’éthique. Après l’opération, les souris ont reçu des soins postopératoires standards, y compris une réanimation au liquide sous-cutané si nécessaire, et ont été surveillées pour détecter des signes cliniques de sepsis et de détresse. À la date prédéterminée, les animaux ont été euthanasiés de manière humaine par inhalation excessive d’éther dans une chambre fermée, utilisant environ 5 à 10 mL d’éther pour assurer une cessation rapide de la respiration, suivie d’une confirmation de décès, du sang prélevé pour une analyse des cytokines, et des organes prélevés pour l’histopathologie, l’immunofluorescence et les tests moléculaires.

Analyse statistique

L’analyse statistique était réalisée à l’aide de SPSS version 23.0 ou d’un logiciel statistique équivalent. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± écart-type (DE) sauf indication contraire. Pour les comparaisons entre deux groupes, un test t de Student non apparié a été utilisé lorsque les données étaient normalement distribuées avec des variances homogènes. Pour les comparaisons entre trois groupes ou plus, une analyse unidirectionnelle de la variance (ANOVA) a été appliquée, suivie de tests post-hoc appropriés pour des comparaisons multiples lorsqu’un effet global significatif était détecté. Une valeur p bilatérale < 0,05 était considérée comme statistiquement significative. La signification des symboles statistiques (par exemple, p < 0,05, *p < 0,01) a été définie dans les légendes de figures, et le nombre de répliques biologiques est indiqué dans le texte ou les légendes correspondants.

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Résultats

Détection de l’expression et des interactions de NEAT1/miR-181a-5p/HMGB1 dans la septicémie

Chez les sérums des patients atteints de septicémie, les niveaux de NEAT1 et HMGB1 étaient significativement plus élevés que chez les témoins sains, tandis que miR-181a-5p était nettement réduit. Des schémas d’expression similaires ont été observés chez les PBMC et chez les macrophages RAW264.7 stimulés par des lipopolysaccharides, indiquant que cet axe est constamment modifié dans la s...

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Discussion

La septicémie se caractérise par une dysrégulation immunitaire profonde et souvent durable, dans laquelle des phases d’hyperinflammation et d’immunosuppression coexistent et contribuent conjointement à l’insuffisance organique et à de mauvais résultats21,22. Les preuves accumulées indiquent que les ARN longs non codants (lncRNA) participent à ces processus en modulant la signalisation inflammatoire et la polarisation des macropha...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt financier concurrent.

Remerciements

Les auteurs remercient le personnel clinique et de laboratoire de l’Hôpital affilié de l’Université du Hebei pour leur aide au recrutement des patients, au traitement des échantillons et aux soins aux animaux. Ce travail a été soutenu par la Commission de la Santé de la province du Hebei (Grant n° 20220640).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Vecteur adénoviral (shNEAT1)10692-V5Vigene BiosciencesAdénovirus utilisé pour réduire l’expression de NEAT1 in vivo et in vitro.
Kit de test protéique BCA23227Thermo FisherKit utilisé pour quantifier la concentration de protéines dans les lysats cellulaires.
Kit de test de reporter à double luciféraseE1910PromegaKit utilisé pour les tests de journalistes à double luciférase afin de mesurer l’interaction miR-181a-5p.
Kits ELISA (cytokines)N/AR& Systèmes DKits utilisés pour mesurer les niveaux de cytokines dans les échantillons séricaux et tissulaires.
Sérum fœtal bovin (FBS)16000-044GibcoSupplément utilisé dans les milieux de culture pour la croissance cellulaire.
Anticorps GAPDH2118STechnologie de signalisation cellulaireAnticorps primaire contre le GAPDH utilisé comme contrôle de charge dans Western Blot.
Kit de coloration à l’hématoxyline et à l’éosineN/AThermo FisherKit utilisé pour la coloration histologique des sections tissulaires pour l’analyse pathologique.
Anticorps d’immunofluorescence (CD206)14693-1-APProteintechAnticorps utilisé pour détecter le marqueur du macrophage M2 CD206 dans les sections tissulaires.
Lipopolysaccharide (LPS)L2630Sigma-AldrichLPS utilisé pour induire la polarisation inflammatoire des macrophages dans les cellules RAW264.7.
miR-181a-5p MimicN/AN/AUn imitateur synthétique du miR-181a-5p utilisé pour moduler les niveaux du miR-181a-5p.
Plasmide d’expression NEAT1N/AN/APlasmide utilisé pour la surexpression de NEAT1 dans les macrophages RAW264.7.
Cellules macrophages RAW264.7TIB-71ATCCLignée cellulaire de macrophages murines utilisée pour des expériences in vitro.
Tampon de lyse RIPA89901Thermo FisherTampon utilisé pour lyser les cellules afin d’extraire la protéine totale.
RPMI-1640 Moyen11875-093GibcoMilieu de culture pour les macrophages RAW264.7.
SYBR Green Master Mix4385612Thermo FisherRéactif utilisé pour l’analyse quantitative en temps réel par PCR.
Chambres de test de migration Transwell3422CorningChambres utilisées pour les tests de migration transwell afin d’évaluer la migration des macrophages.
Kit de test d’apoptose TUNELAB66110AbcamKit utilisé pour détecter l’apoptose dans les cellules RAW264.7 par coloration TUNEL.
Anticorps Western Blotting (HMGB1)ab18256AbcamAnticorps primaire contre HMGB1 utilisé dans le western blotting.

Références

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