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Article de recherche

Les effets causaux des métabolites plasmatiques sur la lésion du tendon d’Achille : une étude de randomisation mendélienne

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DOI :

10.3791/69807

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27 mars 2026

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1Department of Orthopaedic Centre Hand-Foot Surgery, People's Hospital of Ningxia Hui Autonomous Region, Ningxia Medical University, 2Ningxia Yinchuan Energy College, Nursing College, 3General Surgery Department, People's Hospital of Ningxia Hui Autonomous Region, Ningxia Medical University

Dans cet article

Résumé

Ici, nous présentons un protocole combiné de randomisation mendélienne et de validation expérimentale pour identifier les métabolites causaux dans la lésion du tendon d’Achille, identifier 19 métabolites plasmatiques ayant des liens causaux avec la lésion du tendon d’Achille, et démontrer l’application thérapeutique de la 5,6-dihydrothymine et de l’hydroxyasparagine pour favoriser la réparation tissulaire et réduire l’inflammation.

Résumé

Pour étudier les effets causaux des métabolites plasmatiques sur la progression et la récupération de la lésion du tendon d’Achille (ATI), une randomisation mendélienne (RM) a été appliquée à l’aide d’une approche à deux échantillons avec des données génétiques issues de deux grands ensembles de données. Les données ATI proviennent du projet IEU-OpenGWAS (ebi-a-GCST90018895), tandis que les données sur les métabolites plasmatiques comprenaient 1 400 métabolites. Des variables instrumentales (IV) significatives pour les métabolites ont été identifiées, et cinq méthodes d’IRM — IVW, RM-Egger, médiane pondérée, mode simple et mode pondéré — ont été appliquées pour évaluer les relations causales. Une analyse IRM inversée a été réalisée pour explorer l’impact de l’ITA sur les niveaux de métabolites. La réparation tissulaire et l’expression d’IL-6, TNF-α, VEGFA et TGF-β1 dans le tendon d’Achille de la souris ont été évaluées au jour 7 post-traitement avec 5,6-dihydrothymine (Dih) et hydroxyasparagine (Hyd) à l’aide de coloration H&E et Western blot. L’analyse IRM a identifié 19 métabolites présentant des associations causales significatives à l’ITA. Parmi ceux-ci, 12 métabolites, dont Dih (IVW : OR = 1,197, IC 95 % : 1,074-1,334 ; P = 0,001) et Pregnanediol-3-glucuronide (IVW : OR = 1,098, IC à 95 % : 1,023-1,177 ; P = 0,001), étaient positivement associés à la progression de l’ITA. En revanche, 7 métabolites, tels que Hyd (IVW : OR = 0,789, IC à 95 % : 0,707-0,880 ; P < 0,001), étaient liés à la récupération de l’ATI. L’analyse IRM inversée n’a pas indiqué d’effets causals significatifs de l’ITA sur les niveaux de métabolites, suggérant une relation unidirectionnelle. Les analyses à la radiographie et à l’urgence ont révélé que le traitement par Dih et Hyd a significativement amélioré la guérison du tendon d’Achille de manière dépendant de la dose. De plus, le traitement par Dih et Hyd a notablement réduit l’expression d’IL-6 et de TNF-α (P < 0,05) tout en augmentant les niveaux de VEGFA et TGF-β (P < 0,05), indiquant une réduction de l’inflammation et une promotion de la réparation tissulaire. Cette étude a identifié des relations causales potentielles entre certains métabolites plasmatiques et les résultats de l’ITA. Ces résultats pourraient orienter les stratégies thérapeutiques futures et mettre en lumière l’utilité de l’IRM dans l’exploration des associations métabolite-maladie.

Introduction

La lésion du tendon d’Achille (ATI) est une affection musculosquelettique répandue et invalidante, en particulier chez les athlètes et les personnes physiquementactives 1,2. Le tendon d’Achille, le plus grand et le plus fort du corps humain, joue un rôle central dans la locomotion, transmettant les forces des muscles du mollet au talon lors d’activités telles que la marche, la course et le saut 3,4,5,6. Son apport sanguin limité et le stress mécanique élevé qu’il subit le rendent particulièrement vulnérable à la surutilisation et aux blessures 2,7. L’ITA se manifeste sous diverses formes, allant d’une tendinopathie légère à une rupture complète, provoquant une douleur importante, une mobilité réduite et une rééducationprolongée 8,9. Malgré les progrès dans le traitement, l’ITA entraîne souvent une douleur persistante, une mobilité réduite et des temps de récupération allongés, avec un risque accru de complications chroniques et de récidivedes blessures 5,10,11,12.

Des études récentes ont mis en lumière le rôle crucial des métabolites plasmatiques dans le processus de guérison de l’ATI13,14. Ces métabolites, impliqués dans diverses voies biochimiques, sont considérés comme influençant des facteurs clés tels que l’inflammation, la réparation tissulaire et la santé destendons 15. Par exemple, des acides aminés et lipides spécifiques sont essentiels à la synthèse du collagène et à la gestion du stress oxydatif, deux éléments cruciaux en pathologietendineuse 16,17. Le plasma riche en plaquettes (PRP), riche en facteurs de croissance tels que le PDGF, le TGF-β, le VEGF et l’IGF, a montré un potentiel pour favoriser la guérison des tendons, bien que son efficacité dans le traitement de la tendinopathie chronique d’Achille restedébattue 14. Ces dernières années, les technologies omiques à haut débit, telles que la métabolomique et la protéomique, ont offert des opportunités sans précédent d’explorer le paysage moléculaire de conditions complexes comme l’ATI18,19. Des technologies métabolomiques avancées ont facilité l’identification de biomarqueurs liés aux résultats de l’ATI, fournissant des informations sur la manière dont certains métabolites influencent la progression et la récupération des blessures.

Le profilage des métabolites et l’analyse des voies métaboliques sont devenus des approches puissantes pour identifier les biomarqueurs et voies associés aux blessures20,21. La randomisation mendélienne (RM) est une méthode robuste d’inférence causale qui utilise des variantes génétiques comme variables instrumentales (IV) pour traiter les biais de confusion courants dans les études épidémiologiquestraditionnelles 22,23,24,25,26,27. L’IRM est particulièrement utile pour étudier les relations causales entre les expositions, telles que les métabolites plasmatiques, et les résultats comme l’ATI. Contrairement aux études observationnelles conventionnelles, qui sont susceptibles de confusion et de causalité inverse, l’IRM utilise des variantes génétiques sous forme de perfusions pour fournir des inférences causales plus fortes. Une compréhension plus approfondie de l’influence des métabolites plasmatiques sur la santé des tendons est essentielle pour faire progresser les stratégies thérapeutiques et améliorer les résultats de récupération.

S’appuyant sur ces avancées, la présente étude étudie le rôle causal des métabolites plasmatiques dans l’ATA à l’aide de l’IRM. Les variations génétiques associées aux niveaux de métabolites ont été analysées afin d’identifier des métabolites spécifiques liés à la progression et à la récupération de l’ITA. De plus, des métabolites candidats, tels que la 5,6-dihydrothymine (Dih) et l’hydroxyasparagine (Hyd), ont été validés expérimentalement dans des modèles animaux afin d’élucider leurs effets sur l’évolution et la guérison de l’ATI.

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Protocole

Approbation éthique et consentement à la participation

Tous les projets expérimentaux sur les animaux ont été strictement menés conformément aux mesures de gestion des animaux de laboratoire de la province de Ningxia et ont été approuvés par le Comité d’éthique de l’Hôpital Populaire de la Région autonome Hui de Ningxia, Université médicale de Ningxia.

Conception de l’étude

Cette étude a étudié les relations causales entre 1 400 métabolites plasmatiques et l’ATI en utilisant une méthodologie IRM à deux échantillons. Pour garantir la validité des IV dans l’inférence causale, trois hypothèses cruciales doivent être satisfaites : (1) la variation génétique est directement associée à l’exposition d’intérêt ; (2) la variation génétique n’est pas confondue par des facteurs potentiels de confusion entre l’exposition et le résultat ; et (3) la variation génétique influence le résultat exclusivement par l’exposition et non par des voies alternatives.

Sources des données GWAS pour ATI

Les données pour l’étude Genome-Wide Association Study (GWAS) sur l’ATI proviennent du projet IEU-OpenGWAS (https://gwas.mrcieu.ac.uk/), en utilisant spécifiquement l’ensemble de données ebi-a-GCST90018895. L’analyse GWAS a englobé 357 658 individus d’ascendance européenne, comprenant 7 746 cas et 349 912 témoins. À la suite des procédures de contrôle qualité, un total de 19 072 056 polymorphismes (SNP) mononucléotidiques ont été identifiés. Les procédures de contrôle qualité comprenaient le retrait des SNP présentant une fréquence allèlique mineure<0,01, un équilibre Hardy-Weinberg P<1×10-⁶, et un taux d’appel génotype <0,95. La stratification de la population a été évaluée à l’aide d’une analyse en composantes principales, et le facteur d’inflation génomique (λ) a été calculé pour évaluer le biais systématique.

Sources de données GWAS pour les métabolites plasmatiques

L’ensemble de données Facteurs d’Exposition comprend des données GWAS pour 1 400 métabolites plasmatiques, comprenant 1 091 niveaux de métabolites et 309 ratios de métabolites, tels que catalogués dans la base de données GWAS (https://www.ebi.ac.uk/gwas/studies/GCST90199621-90201020). Les analyses IRM étaient limitées aux individus d’ascendance européenne. Des informations détaillées sur l’ensemble de données sont fournies dans Supplementary Materials, Tableau S1.

Sélection des IV

Dans l’identification des IV, le seuil de signification statistique des SNP19 072 056 associés aux métabolites plasmatiques a été fixé à P < 1 × 10-5. Pour garantir l’indépendance des analyses, les SNP ont été agrégés en utilisant des seuils de r2 = 0,001 et kilobase (kb) = 10 000, excluant 19 037 213 SNP avec r2 > 0,001 et kb < 10 000 afin d’éliminer les effets potentiels du déséquilibre de liaison (LD). Les SNP avec des valeurs F-statistique < 10 ont été exclus des analyses ultérieures en raison de leur forte hétérogénéité, tandis que 34 843 SNP répondant aux critères ont été conservés comme IV valides.

Animaux et conception expérimentale

Toutes les expériences animales ont été menées en stricte conformité avec les mesures de gestion des animaux de laboratoire de la province de Ningxia et approuvées par le Comité d’éthique de l’Hôpital populaire de la région autonome Hui de Ningxia, Université médicale de Ningxia. Les souris mâles BALB/c (8 semaines, grade SPF) ont été achetées auprès de Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. (Pékin, Chine). Les souris ont été acclimatées pendant une semaine dans un environnement contrôlé (température 23 ± 1°C, humidité 60 ± 10 %), avec un accès libre à la nourriture et à l’eau standards, et un cycle de 12 heures de lumière et 12 heures d’obscurité. Après l’acclimatation, un modèle de lésion du tendon murien a été établi. Après une incision longitudinale cutanée, le tendon d’Achille gauche a été exposé et une transection transversale standardisée d’épaisseur complète a été réalisée au milieu du tendon à l’aide de ciseaux microchirurgicaux. Le tendon a été immédiatement réparé avec des sutures 6-0 non absorbables sous un stéréomicroscope. Immédiatement après l’opération, des radiographies ont été réalisées pour vérifier la réussite de l’établissement du modèle murin ATI. Simultanément, des images radiographiques ont été prises pour le groupe témoin sous conditions anesthésiques identiques afin de servir de témoinblanc 28. Toutes les interventions ont été réalisées sous anesthésie générale induite par injection intrapéritonéale de pentobarbital sodium (50 mg·kg-1), et un analgésique postopératoire a été administré de buprénorphine (0,05 mg·kg-1, sous-cutanée) toutes les 12 heures pendant 48 h29. Après l’induction réussie du modèle, les souris ont été réparties aléatoirement dans les groupes suivants : groupes témoins, modèles et groupes de traitement recevant la Dih à des doses faibles (10 mg·kg-1, LD-Hyd), moyennes (30 mg·kg-1, MD-Hyd) et élevées (50 mg·kg-1, HD-Hyd). Calcul de la taille de l’échantillon : Sur la base de données préliminaires montrant une amélioration de 40 % des scores de cicatrisation avec le traitement des métabolites (DE = 15 %), il a été déterminé que n = 6 souris par groupe fourniraient 80 % de puissance pour détecter cette différence à α = 0,05 (à deux queues). La randomisation a été réalisée à l’aide de nombres aléatoires générés par ordinateur par un enquêteur aveuglé à l’allocation de groupes. Des procédures expérimentales et des évaluations des résultats ont été réalisées par des chercheurs aveugles aux devoirs de groupe30.

Coloration à l’hématoxyline et à l’éosine (HE)

Le septième jour post-traitement, les souris ont été euthanasiées sous anesthésie profonde induite par injection intrapéritonéale de pentobarbital sodium (100 mg·kg-1), assurant ainsi une perte totale des réflexes avant la collecte des tissus. Le tissu tendineux d’Achille blessé, y compris une petite portion des tissus mous environnants, a été soigneusement prélevé et traité. Une piècede peau de 15 mm 2 centrée sur le tendon d’Achille a été excisée. Les échantillons de peau ont été fixés dans une solution de paraformoldéhyde à 4 % à température ambiante pendant 48 heures, suivis d’une déshydratation, d’un plongement de paraffine et d’un coupement de 5 μm. Les caractéristiques structurelles de la peau de la plaie, la formation du tissu de granulation et l’infiltration des cellules inflammatoires ont été évaluées à l’aide de coloration H&E. Pour l’évaluation histologique, les coupes ont été déparaffinées en xylène (2 × 10 min), réhydratées par éthanol gradué (100 %, 95 %, 85 % et 75 %, 5 minutes chacune), puis rincées dans de l’eau distillée. Les lames ont été colorées à l’hématoxyline Harris pendant 5 minutes, rincées dans de l’eau du robinet courante pendant 5 minutes, différenciées en alcool acide à 1 % pendant 10 secondes, puis bluisées dans de l’eau à 0,2 % d’ammoniac pendant 30 secondes. Après lavage, les sections ont été contre-colorées avec 0,5 % d’éosine pendant 2 minutes, suivies de déshydratation, de débouchage et de montage. Fiabilité de l’évaluation histologique : Pour garantir la précision des mesures, 20 % des échantillons sélectionnés au hasard ont été notés indépendamment par deux observateurs aveugles. La fiabilité inter-évaluateurs a été évaluée à l’aide du coefficient de corrélation intraclasse (ICC). L’ICC pour l’organisation du collagène était de 0,89 (IC 95 % : 0,81-0,94), pour la dégénérescence tissulaire de 0,92 (IC 95 % : 0,86-0,96), et pour l’infiltration inflammatoire des cellules de 0,87 (IC 95 % : 0,78-0,93), indiquant une excellente fiabilité. La fiabilité intra-évaluateur a été évaluée en faisant re-évaluer 15 % des échantillons par un observateur après un intervalle de deux semaines, donnant des valeurs ICC > 0,85 pour tous les paramètres31.

Analyse du western blot

L’expression protéique a été analysée par Western blot. La quantification des protéines a été réalisée à l’aide du kit de test de concentration des protéines BCA. Des quantités égales de protéines ont été séparées par électrophorèse en gel de 10 % de dodécyle sulfate-polyacrylamide de sodium (SDS-PAGE) et transférées dans une membrane de nitrocellulose. La membrane a été bloquée pendant 1 h avec 5 % de lait écrémé dans une solution sémale tamponnée contenant 0,1 % de Tween-20 à température ambiante. Les membranes ont été incubées toute la nuit à 4°C avec des anticorps primaires pour VEGFA (1:1000, ab46154), TGF-β1 (1:1000, 21898-1-AP), IL-6 (1:1000, 26404-1-AP) et TNF-α (1:1000, 17590-1-AP). Après trois lavages avec PBS, les membranes ont été incubées avec des anticorps secondaires (1:5000) pendant 90 minutes à température ambiante. Les bandes protéiques ont été visualisées à l’aide du kit de substrat chimiluminescence ECL (voir Tableau des matériaux pour plus de détails) en suivant le protocole du fabricant et analysées à l’aide du logiciel ImageJ (version 1.8 ; Instituts nationaux de la santé). Le GAPDH (10494-1-AP) était utilisé comme centre de contrôle de chargement.

Analyse statistique

Les analyses statistiques étaient réalisées à l’aide du logiciel R Studio. Les packages TwoSampleMR et ieugwasr R ont été utilisés pour extraire les données d’exposition et filtrer les IV valides, incluant le regroupement (r² < 0,001, la taille de la fenêtre = 10 000 kb), l’harmonisation des allèles et le calcul de la statistique F (F = β²_exposure/SE²_exposure). Pour les analyses IRM et IRM inverse, nous avons utilisé les packages VariantAnnotation, gwasglue et TwoSampleMR, qui ont facilité des tests robustes d’inférence causale et de sensibilité. Une étude IRM sur deux échantillons a été réalisée pour étudier les caractéristiques liées aux métabolites plasmatiques. Cinq approches analytiques distinctes ont été employées : pondération inverse de la variance (IVW), MR-Egger, médiane pondérée (WM), mode simple et mode pondéré. Les résultats primaires ont été déterminés à l’aide de la méthode de la TVI, avec une signification statistique fixée à P < 0,01. La méthode de la VV attribue des poids pour minimiser l’impact de la variation, fournissant des estimations d’effet plus précises. La régression de MR-Egger a été utilisée pour évaluer la pléiotropie (le phénomène où les gènes affectent plusieurs traits), la pléiotropie horizontale étant évaluée par la valeur P de l’interception (P > 0,05), et l’hétérogénéité testée à l’aide de la méthode IVW combinée à la statistique Q de MR-Egger. Aucune hétérogénéité significative n’a été observée lorsque P > 0,05. La correction par tests multiples a été appliquée selon la méthode du taux de fausse découverte (FDR) de Benjamini-Hochberg, FDR < 0,05 étant considérée comme significative. L’hétérogénéité a été quantifiée à l’aide de la statistique Q de Cochran et de la statistique I2 ,où I 2 > 50 % indiquait une hétérogénéité substantielle. Pour les valeurs de I2 , des intervalles de confiance à 95 % ont été calculés selon la méthode décrite par Ioannidis et al. Les analyses de sensibilité ont été réalisées en retirant séquentiellement chaque SNP afin d’évaluer l’influence de chaque variant sur les résultats globaux.

Pour évaluer la fiabilité des mesures, des analyses test-retest ont été réalisées sur des mesures clés de résultat (quantification en WB et notation histologique) en utilisant les coefficients de corrélation intraclasse (ICC). L’ICC a été utilisé pour évaluer la fiabilité inter-évaluateur et intra-évaluateur de la quantification et du score histologique du Western Blot (WB). Les critères ont été interprétés comme suit : en dessous de 0,50 (faible), entre 0,50 et 0,75 (modéré), entre 0,75 et 0,90 (bon), et au-dessus de 0,90 (excellent)32. Trois chercheurs indépendants ont évalué à l’aveugle le même ensemble d’échantillons à deux moments séparés d’une semaine. Les ICC pour la quantification Western blot de IL-6, TNF-α, VEGFA et TGF-β variaient de 0,87 à 0,93, indiquant une excellente fiabilité. Les ICC pour l’évaluation histologique étaient de 0,85 pour l’organisation du collagène et 0,82 pour l’évaluation de la néovascularisation.

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Résultats

Relation causale entre 1 400 métabolites plasmatiques et ATIs

Une analyse IRM complète de 1 400 métabolites plasmatiques a été réalisée afin d’évaluer leurs effets causaux sur l’ATI. L’analyse primaire a utilisé l’approche de la FIV, avec des contrôles stricts pour la lucide lucide et les facteurs de confusion potentiels, afin d’identifier les métabolites ayant un impact significatif sur la progression et la récupération de l’ITA. La figure 1 prés...

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Discussion

Cette étude a mené une analyse IRM complète pour explorer les relations causales entre 1 400 métabolites plasmatiques et l’ATI. Dix-neuf métabolites plasmatiques ont été identifiés comme significativement associés à la progression et à la guérison de l’ITA, avec Dih et Hyd comme facteurs clés influençant les résultats de l’ITA. Des expériences in vivo ultérieures ont confirmé les rôles bénéfiques de ces métabolites dans la promotion de la guérison des tendons. Le traitement par ...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Remerciements

Recherche d’application clinique sur l’évaluation de la flore intestinale et le traitement par étapes des ulcères chroniques du pied diabétique, Yinchuan Science and Technology Innovation Project (2024SF005). Application Recherche sur les effets de différentes méthodes chirurgicales sur l’apport sanguin du tissu péritendal et la réparation biomécanique de la rupture aiguë du tendon d’Achille fermé dans le cadre du programme de recherche et développement Ningxia Key (2019BEG3036).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
5,6-DihydrothymineRéactif696-04-8Réactif
Kit de test protéique BCARéactifP0012Réactif
Kit de substrat chimiluminescence ECLRéactifP0018SRéactif
Anticorps GAPDHAnticorps10494-1-APAnticorps
Kit de coloration à l’hématoxyline et à l’éosineRéactifG1120Réactif
HydroxyasparagineRéactifH1126Réactif
Anticorps IL-6Anticorps26404-1-APAnticorps
ImageJLogicielsVersion 1.8Logiciels
Nitrocellulose MembraneConsommablesHATF08130Consommables
ParaformélélidoïdeRéactifP0099-3LRéactif
RStudioLogicielsVersion 4.5.2Logiciels
Kit de préparation au gel SDS-PAGERéactifP0012ACRéactif
Pentobarbital sodiqueAnesthésique200-323-9Anesthésique
TGF-& bêta ; 1 AnticorpsAnticorps21898-1-APAnticorps
TNF-& alpha ; AnticorpsAnticorps17590-1-APAnticorps
Anticorps VEGFAAnticorpsab46154Anticorps
Système à rayons XInstrumentMX-20Instrument

Références

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