Analyse intégrative du profilage génomique ciblé et de l’infiltration des cellules immunitaires dans le pronostic de l’adénocarcinome pulmonaire

Résumé

Ce protocole permet l’intégration du séquençage de nouvelle génération et de l’immunofluorescence multicolore pour profiler l’adénocarcinome pulmonaire. Il vise à analyser la relation entre l’hétérogénéité génomique et la densité des cellules immunitaires infiltrant les tumeurs. Cette approche multidimensionnelle facilite une évaluation complète du microenvironnement tumoral pour une évaluation pronostique postopératoire.

Résumé

Le pronostic de l’adénocarcinome pulmonaire (LUAD) est traditionnellement évalué via le stadage tumeur-ganglion-métastase (TNM), qui ne prend pas en compte l’état immunitaire du patient. Ce protocole intègre le profilage génomique et l’analyse du microenvironnement immunitaire afin de faciliter une évaluation pronostique postopératoire plus complète. La méthode consiste en une analyse rétrospective des tissus tumoraux enfouis en paraffine utilisant deux techniques principales. Tout d’abord, le séquençage de nouvelle génération (NGS) est réalisé avec un panel personnalisé de 37 gènes afin d’identifier les mutations des gènes moteurs et des variants d’importance incertaine. Deuxièmement, l’immunofluorescence multiplex (mIF) est utilisée pour cibler des marqueurs tels que HLA-DR, CD68, CD163, CD206,-L1 et PanCK. Cela permet de quantifier la distribution spatiale et la densité pour des sous-populations spécifiques de cellules immunitaires dans diverses régions tumorales. Cette approche intégrée permet l’évaluation simultanée de l’hétérogénéité génomique et des caractéristiques des cellules immunitaires infiltrant la tumeur. Les données obtenues identifient des combinaisons spécifiques de profils mutationnels — tels que le statut EGFR — et des densités cellulaires immunitaires. Ces combinaisons intégrées permettent d’étudier leur impact collectif sur la survie des patients, offrant une approche prometteuse pour le développement de futurs modèles pronostiques du cancer du poumon. Ce protocole démontre une méthode robuste pour caractériser les caractéristiques biologiques complexes du microenvironnement tumoral LUAD.

Introduction

Le LUAD est le sous-type de cancer du poumon le plus répandu, pourtant le taux moyen de survie sur 5 ans reste faible, à environ 15 ^%. L’évaluation pronostique actuelle repose principalement sur le système de stadification TNM ; Cependant, cette méthode néglige souvent l’état immunitaire global du patient, ce qui peut limiter sa précision prédictive. Les preuves suggèrent que l’hétérogénéité génomique et le microenvironnement tumoral (TME) jouent tous deux des rôles critiques dans la tumorigenèse et la progression de la maladie^{des LUAD 2,3}.

Ces dernières années, la transition du séquençage Sanger traditionnel vers le NGS ciblé a permis l’analyse simultanée et à haute sensibilité de plusieurs gènes moteurs, tels que EGFR, TP53 et KRAS ^4,5. Bien que NGS fournisse une carte haute résolution des altérations génétiques, les données génomiques seules ne peuvent pas capturer les interactions cellulaires complexes et l’organisation spatiale au sein de la TME.

Pour remédier à ces complexités, le MFI offre des avantages significatifs par rapport aux méthodes traditionnelles de profilage immunitaire. Alors que l’immunohistochimie à plex unique (IHC) est limitée à un marqueur par section, le mIF permet la détection simultanée de plusieurs marqueurs protéiques tout en préservant l’architecture spatiale du tissu. Contrairement à l’IHC séquentielle, qui peut entraîner la dégradation tissulaire, ou à la cytométrie en flux et au séquençage d’ARN en masse, qui entraînent une perte de localisation spatiale et de résolution unicellulaire ^6,7,8, le mIF combiné à l’annotation régionale spatiale permet une caractérisation in situ multi-paramètre du paysage^{immunitaire 9}.

Ce protocole établit un flux de travail combiné intégrant NGS ciblée, mFI et évaluation de la région spatiale (englobant tout le tissu, la frontière tumorale et le noyau tumoral). Une telle approche multidimensionnelle est nécessaire pour étudier l’interaction entre les altérations génomiques et la densité cellulaire immunitaire — une relation que les approches monomodales échouent souvent à saisir. En évaluant ces caractéristiques intégrées, ce protocole offre une stratégie complémentaire pour caractériser les caractéristiques biologiques de LUAD et propose un cadre plus robuste pour la stratification pronostique postopératoire.

Protocole

Cette étude rétrospective a été approuvée par le Comité d’éthique médicale de l’hôpital Kunming Yan’an (Approbation n° 2021-140-01). Le consentement éclairé a été obtenu de tous les participants.

Conception de l’étude et collecte d’échantillons
Une cohorte de 63 patients atteints de TUAD confirmée de manière pathologique ou histologique ayant subi une résection chirurgicale entre 2015 et 2021 a été recrutée. Les critères d’exclusion comprenaient la réception de chimiothérapie néoadjuvante, de radiothérapie ou d’immunothérapie avant la chirurgie. De plus, les patients présentant des cancers concomitants, des comorbidités sévères, une mauvaise qualité tissulaire ou des dossiers cliniques incomplets ont été exclus de l’analyse. Les blocs tumoraux fixés dans la paraffine fixée (FFPE) ont été transformés en sections de 1 mm pour la déparaffinisation. Comme illustré dans le flux de travail (Figure 1), ces échantillons ont subi une analyse intégrée utilisant le mIF et un NGS ciblé. Cette approche combinée permet l’évaluation simultanée des altérations génomiques et des caractéristiques du microenvironnement immunitaire, fournissant un cadre multidimensionnel pour caractériser la biologie tumorale.

Suite
Les médicaments ciblés, l’immunothérapie, ainsi que la progression ou la mort de la maladie du patient ont été suivis par suivi téléphonique, et des informations détaillées ont été recueillies sur l’état de survie des patients, la progression ou la récidive de la maladie, les traitements adjuvants reçus après la chirurgie, ainsi que sur toute comorbidité nouvellement diagnostiquée. Le suivi s’est terminé en juillet 2023, et le critère final d’observation était la progression ou la mort de la maladie. La survie globale était définie comme le temps allant du début de l’opération jusqu’au décès du patient. Aucun patient n’a été perdu lors d’un suivi. Le temps minimum de suivi était de 21 mois.

Préparation et séquençage de la bibliothèque NGS
Extraction d’ADN à partir de sections de tissu FFPE
Obtenir des coupes de tissu FFPE (épaisseur de 3 à 10 μm) à partir d’échantillons pathologiques. Placez les sections dans des tubes stériles à microcentrifuge. Ajoutez du xylène à chaque tube et faites couver pendant 5 à 10 minutes à température ambiante pour retirer la paraffine. Centrifugez à 12 000 x g pendant 5 minutes et jetez soigneusement le surnageant. Répétez le traitement au xylène 1 fois pour garantir une déparaffinisation complète. Lavez les granulés séquentiellement avec de l’éthanol 100 % deux fois pour éliminer les résidus de xylène. Faites sécher le pellet à température ambiante à l’air jusqu’à ce que l’éthanol résiduel soit complètement évaporé. Ajoutez le tampon de lyse approprié et la protéinase K (fournis dans le kit d’extraction ADN) et incubez à 56 °C pendant 1 à 3 heures (ou toute la nuit si nécessaire) jusqu’à ce que le tissu soit complètement lysé. Effectuer une incubation supplémentaire à 90 °C pendant 1 heure pour inverser la réticulation du formol. Extraire l’ADN génomique à l’aide d’un kit d’extraction d’ADN FFPE commercial (voir Tableau des matériaux) selon les instructions du fabricant. La qualité de l’ADN des échantillons de FFPE est souvent fragmentée ; par conséquent, la qualité de l’ADN doit respecter des seuils d’intégrité minimaux (par exemple, DIN ≥ 5) afin d’assurer une préparation réussie des bibliothèques pour les NGS ciblés.

Quantification et normalisation de l’ADN
Quantifier l’ADN à l’aide d’une méthode fluorométrique pour garantir une mesure précise des concentrations. Normaliser les échantillons d’ADN à une concentration finale d’environ 5 à 10 ng/μL à l’aide d’un tampon Tris-HCl (pH 8,5). Effectuer progressivement les étapes de dilution si nécessaire afin d’assurer la précision et la stabilité de la concentration d’ADN.

Préparation de la bibliothèque et enrichissement des cibles
Préparez des bibliothèques de séquençage utilisant des NGS ciblés hybrides basés sur la capture sur l’ADN extrait du tissu^{FFPE 10}. Effectuez l’enrichissement de la cible à l’aide d’un panneau de sondes personnalisé couvrant les régions exoniques de gènes sélectionnés associés au développement tumoral. Évaluer la qualité des bibliothèques et la répartition de la taille des fragments à l’aide de méthodes standard (par exemple, systèmes basés sur l’électrophorèse), si nécessaire.

Regroupement de bibliothèques et séquençage
Quantifiez chaque bibliothèque à l’aide d’un test fluorométrique. Poolez les bibliothèques aux concentrations équimolaires selon les exigences du kit de séquençage. Chargez les bibliothèques poolées sur la plateforme de séquençage Illumina et effectuez le séquençage avec un motif de séquençage en fin de paire de 150 bp.

Traitement des données et détection de variantes
Les lectures de séquençage brut ont été traitées à l’aide de pipelines bioinformatiques standards, incluant le découpage d’adaptateurs, le filtrage de qualité et l’alignement au génome de référence humain (GRCh37/hg19). Les indicateurs de contrôle qualité étaient les suivants : Q20 > 85 %, profondeur moyenne de séquençage > 2500x, taux de réussite cible > 65 %, et pénalité de base Fold 80 ≤ 2. Contrôle qualité et alignement : Les données brutes FASTQ ont subi un contrôle qualité à l’aide de FastQC et Trim Galore (ou Trimmomatic) pour éliminer la contamination des adaptateurs et les séquences de faible qualité. Les lectures nettoyées ont été alignées sur le génome de référence humain GRCh37 (hg19) à l’aide de l’aligneur Burrows-Wheeler (BWA). Traitement post-alignement : Le tri, le marquage des doublons et le recalibrage du score de qualité de base (BQSR) ont été effectués à l’aide de Picard et du Genome Analysis Toolkit (GATK) afin de minimiser les faux positifs. Appels variants : Les polymorphismes mononucléotides (SNP) et InDels de la lignée germinale ont été détectés à l’aide du MEM BWA (0.7.16a - r1181). Les SNV et InDels somatiques ont été identifiés par une approche consensuelle utilisant Mutect2 et VarScan2. Les mutations de basse fréquence ont été évaluées davantage à l’aide du modèle statistique de Freebayes (v 1.3.2). Annotation et filtrage : Les variantes ont été annotées à l’aide d’ANNOVAR, intégrant les données de gnomAD, ClinVar et COSMIC. Les variants germinaux ont été distingués des mutations somatiques en filtrant les SNP de population à haute fréquence et en évaluant les fréquences allèles variantes (AFV). Seuils de VAF : Un seuil de ≥5 % de VAF a été utilisé pour les événements clonaux (par exemple, ROS1 et ALK), tandis qu’un seuil de 1 % a été appliqué aux mutations génétiques (par exemple, EGFR) afin d’assurer la détection des altérations de basse fréquence, rendue possible par la profondeur moyenne élevée de séquençage de >500x. Les mutations germinales ont été distinguées des mutations somatiques grâce aux données du projet 1000 Genomes (1000G) et à une base de données locale de Han chinois en bonne santé établie dans notre laboratoire. L’évaluation de la pathogénicité des variants somatiques détectés a été réalisée selon le cadre AMP/ASCO/^{CAP 11}, qui affine la classification des preuves pour les variants somatiques grâce à une approche à plusieurs niveaux fondée sur des preuves. Les variants pathogènes/probablement pathogènes (P/LP) sont conservés, leur classification étant fondée sur des critères de niveau I/II nécessitant des preuves A/B (approbation FDA, essais cliniques) ou C/D (précliniques/études de cas) pour la classification. Le Tier III (VUS) manque de preuves concluantes, tandis que le Tier IV indique des variants bénins par la fréquence de la population (par exemple, la GNOMDA) ou des études fonctionnelles ; ces mutations sont exclues des analyses ultérieures. L’évaluation de la pathogénicité des variants détectés de la lignée germinale a été réalisée selon les directives ACMG/^{AMP 12}. Des variants de pathogène (P), probable pathogène (PL) et signification incertaine (VUS) ont été recensés dans cette étude. Seuls les variants à haute confiance répondant aux critères de contrôle qualité ont été inclus dans les analyses en aval (QUAL ≥1 ; profondeur de couverture >10 pour la mutation germinale et profondeur de couverture >500x pour la mutation somatique)

Préparation de l’échantillon à partir de tissu FFPE
Préparation des sections de paraffine
Découpez les blocs de tissu FFPE en sections de 3 μm d’épaisseur à l’aide d’un microtome. Faites flotter des sections sur un bain-marie à 40–45 °C pour aplatir le tissu. Montez les sections sur des lames adhésives de microscope et séchez à température ambiante. Placez les lames dans un four de séchage à 65 °C pendant 1 h pour assurer une adhérence ferme des sections de tissu aux lames et pour faire fondre l’excès de paraffine.

Déparaffinisation et réhydratation
Placez les lames dans un support de teinture et immergez-les dans la solution de nettoyage I pendant 5 minutes. Transférez les lames séquentiellement vers la solution de dégagement II et la solution de dégagement III, 5 minutes chacune, pour dissoudre complètement la paraffine. Transférez les lames à 100 % d’éthanol pendant 3 minutes pour éliminer le réactif résiduel de dégagement. Réhydratez les sections de tissu selon une série d’éthanol graduée : 95 % d’éthanol pendant 3 minutes et 80 % d’éthanol pendant 3 minutes. Rincez les coulisses 2 fois dans de l’eau distillée, en laissant 3 minutes entre les lavages. Le xylène et l’éthanol utilisés lors de la déparaffinisation ont été manipulés dans une hotte chimique en raison de leur volatilité et de leur toxicité. Toutes les solutions de déchets contenant des solvants organiques ont été collectées séparément et éliminées conformément aux directives institutionnelles d’élimination des déchets dangereux.

Partition de coloration HE
Coloration à l’hématoxyline et à l’éosine
Immergez les lames après déparaffinisation et réhydratation dans une solution d’hématoxyline pendant 5 à 10 minutes à température ambiante. Rincez les glissières sous l’eau du robinet courante pendant 5 minutes. Différenciez les lames dans de l’alcool à 1 % d’acide chlorhydrique pendant quelques secondes (3 à 10 s). Rincez immédiatement avec de l’eau du robinet courante. Noyaux bleus en immergeant les lames dans de l’eau du robinet ou une solution de bleuissement pendant 5 minutes. Immergez les lames dans une solution d’éosine pendant 1 à 3 minutes à température ambiante. Rincez brièvement dans de l’eau distillée si nécessaire.

Déshydratation et défrichage
La déshydratation glisse dans l’éthanol gradué : 80 % d’éthanol pendant 1 minute ; 95 % d’éthanol pendant 1 minute, et 100 % d’éthanol 2 fois pendant 1 minute. Des lames claires en xylène I–II, 2 à 5 min chacune.

Montage
Appliquez une goutte de baume neutre. Placez soigneusement une housse de couverture pour éviter les bulles d’air. Laissez les lames sécher à température ambiante avant l’imagerie.

Coloration immunofluorescence multiplex des sections de tissu FFPE
Une coloration immunofluorescence multiplex séquentielle a été réalisée pour détecter plusieurs marqueurs immunitaires et tumoraux sur la même section tissulaire. Cette approche permet la visualisation in situ de populations cellulaires diverses tout en préservant le contexte spatial¹³. Récupération d’antigènes : Remplissez un bocal de coloration avec un tampon de récupération d’antigènes. Placez le bocal dans un four à micro-ondes et chauffez à haute puissance pendant 3 à 5 minutes jusqu’à ce que la solution commence à bouillir. Transférez soigneusement les lames après la déparaffinisation et la réhydratation dans le tampon de récupération chauffé, afin de garantir que les sections tissulaires sont complètement immergées. La chaleur glisse à faible puissance micro-ondes pendant 15 minutes pour permettre un démasquage efficace de l’antigène. Après chauffage, laissez les lames refroidir naturellement à température ambiante pendant 30 minutes. Transférez les lames dans de l’eau glacée pendant 5 minutes pour arrêter le processus de récupération antigénique.

Lavage et préparation de la barrière hydrophobe
Rincez les lames 1 fois avec de l’eau distillée pour éliminer les résidus de récupération. Utilisez un stylo barrière hydrophobe pour tracer un cercle autour de chaque section de tissu. Le rinçage glisse à nouveau brièvement avec de l’eau distillée. Lave les lames 2x avec le tampon TBST. Après chaque lavage, placez les lames horizontalement pendant 3 minutes pour assurer un retrait complet du tampon.

Blocage
Appliquez un tampon bloqueant pour couvrir complètement la section tissulaire (~100 μL par lame). Incubez les lames dans une chambre humidifiée à température ambiante pendant 15 minutes.

Incubation primaire des anticorps
Retirez le tampon de blocage en tapotant doucement le bord de la culasse sur du papier absorbant. Les anticorps primaires contre HLA-DR, CD68, CD163, CD206,-L1 et PanCK ont été appliqués à des dilutions de travail optimisées allant de 1:100 à 1:400. Appliquez ~100 μL de solution primaire diluée d’anticorps sur chaque section tissulaire. Couver les lames dans une chambre humidifiée : 37 °C pendant 1 heure, ou 4 °C pendant la nuit pour augmenter la sensibilité.

Lavage
Lave les lames 3 fois avec le tampon TBST, 3 min à chaque lavage. Placez les lames horizontalement après chaque lavage pour permettre le drainage des tampons.

Incubation secondaire des anticorps
Préparez la solution secondaire d’anticorps en diluant 1:3 dans le tampon TBST. Appliquez environ 100 μL de solution secondaire d’anticorps sur chaque lame. Incubez les lames à 37 °C pendant 10 minutes dans une chambre humidifiée. Lave les lames 3 fois avec TBST, 3 min à chaque lavage.

Amplification du signal fluorescent
Diluez le réactif d’amplification fluorescent 1:100 dans le tampon d’amplification. Appliquez 100 μL de réactif dilué sur chaque lame. Incubez les lames à température ambiante pendant 10 minutes dans le noir pour éviter le photoblanchiment. Lave les lames 3 fois avec TBST, 3 min à chaque lavage.

Récupération d’antigènes entre marqueurs
Effectuer la récupération d’antigènes micro-ondes comme décrit. Après chauffage, refroidissez les diapositives successivement : 5 min dans de l’eau tiède et 5 min dans de l’eau glacée.

Coloration séquentielle de marqueurs supplémentaires
Répétez les étapes d’incubation primaire et secondaire des anticorps pour chaque marqueur anticorps supplémentaire. Assurez-vous que la récupération d’antigènes est effectuée après la coloration de chaque marqueur avant de passer au prochain anticorps.

Contre-coloration nucléaire
Lave les lames 1 fois avec le tampon TBST. Appliquez une teinture nucléaire DAPI. Incubez à température ambiante pendant 5 minutes dans le noir. Lave les lames 3 fois avec de l’eau distillée. Détermination du point final : Les noyaux doivent apparaître clairement colorés sous microscopie à fluorescence.

Coloration finale uniquement au marqueur
Appliquez une solution de biotine diluée à 1:200 dans un tampon d’amplification, incubez 10 minutes à température ambiante. Lave les lames 3 fois avec le tampon TBST. Effectuer la récupération d’antigènes comme décrit. Lave les lames 3 fois avec le tampon TBST. Appliquez un réactif endogène bloquant la biotine, incubez à 37 °C pendant 30 minutes. Appliquez la teinture colorante 1:100 à TBST et faites couver 30 minutes à température ambiante dans le noir. Lavez les lames 1 fois avec TBST et laissez évacuer 3 minutes.

Montage
Ajoutez une goutte de médium antidécolorant sur la partie de tissu. Placez soigneusement une housse sur la glissade. Laissez sécher les lames avant l’imagerie.

Acquisition d’images des sections H&E et mIF
Des images à lame entière (WSI) des sections de tissu FFPE colorées par H&E et mIF ont été obtenues à l’aide d’un scanner de lames. Le balayage en champ clair était effectué pour les sections H&E, tandis que le balayage à fluorescence était utilisé pour les sections mIF. Objectif : grossissement de 20x pour un scan d’ensemble ; Grossissement 40x pour l’imagerie régionale haute résolution. Réglages d’excitation et d’émission : Optimisés pour chaque fluorophore selon les spécifications du fabricant. Temps d’exposition et gain : Ajustés automatiquement par un logiciel d’imagerie pour garantir une intensité de signal adéquate sans saturation.

Contrôle qualité mIF et évaluation de l’image
Pour garantir la fiabilité des résultats du mIF, un protocole QC rigoureux a été mis en place avant la classification des tissus et la quantification cellulaire à l’aide du système de pathologie numérique HALO. Suppression des artefacts et définition de la zone évaluable : Les images de diapositives entières (WSI) ont été minutieusement examinées pour exclure manuellement les régions contenant des plis tissulaires, des artefacts de coloration et des signaux de fond non spécifiques. Cette étape était essentielle pour prévenir les faux signaux positifs et garantir la précision de l’analyse spatiale. Après ce dépistage, une moyenne de 80 % (plage : 50 %–95 %) de la surface tissulaire sur tous les échantillons a été désignée comme la région mIF évaluable. Vérification pathologique et partitionnement : Pour délimiter avec précision les compartiments tumoraux et stromals, les sections mIF ont été croisées avec des sections en série adjacentes colorées à H&E. Les annotations ont été examinées indépendamment par deux pathologistes expérimentés, les écarts étant résolus par consensus. Les échantillons avec une surface de tissu tumoral inférieure à 30 % ont été exclus de l’étude afin de maintenir une rigueur analytique. Validation post-quantification : Après un phénotypage et une quantification automatisés des cellules, la distribution spatiale et les schémas d’expression des sous-populations de cellules immunitaires ont été réévalués par les pathologistes. Cette revue a permis que les données quantitatives numériques étaient cohérentes avec les caractéristiques histomorphologiques sous-jacentes, garantissant ainsi la fiabilité et la précision des résultats.

Analyse de pathologie numérique et annotation régionale
Les images panoramiques numérisées ont été importées dans la plateforme d’analyse d’images de pathologie numérique pour leur traitement. Le plugin HALO AI Nuclei Seg-Plugin était utilisé pour segmenter et identifier les cellules. En utilisant la coloration H&E comme référence, les régions d’intérêt (ROI) suivantes ont été annotées manuellement : région tumorale entière (WSIT) ; Limite tumorale (TB) ; Noyau tumoral (TC). La détection du signal positif a été déterminée sur la base des seuils d’intensité de fluorescence et de la localisation subcellulaire attendue de chaque marqueur. Cette approche spécifique à chaque compartiment a été appliquée pour minimiser les interférences de fond et améliorer la précision de l’identification des cellules immunitaires. La densité cellulaire immunitaire a été quantifiée en nombre de cellules positives au marqueur par région tumorale sélectionnée. Aligner les images mIF avec les annotations correspondantes dérivées de H&E en fonction de la morphologie tissulaire. Les patients ont été stratifiés en groupes à haute densité et à faible densité selon la valeur médiane de la densité cellulaire immunitaire pour chaque marqueur.

Analyse statistique
Le logiciel SPSS 17.0 était utilisé pour l’analyse. Les données distribuées normalement étaient exprimées en moyenne ± écart-type, et les données quantitatives non distribuées anormalement étaient exprimées en médiane (plage de quantiles 25 % à 75 %). La corrélation entre chaque type de mutation génique, densité cellulaire immunitaire et caractéristiques cliniques a été analysée par le modèle de régression des risques proportionnels de Cox en utilisant le modèle de lignes de vie Python. Selon la taille de l’échantillon et si les données correspondaient à la distribution normale, le test de Student ou le test Mann-Whitney U a été utilisé pour la comparaison entre variables continues. Le test de rang signé Wilcoxon a été utilisé pour comparer les variables de rang. Le test du chi carré ou test exact de Fisher a été sélectionné pour l’analyse des variables catégorielles non ordonnées selon la taille de l’échantillon et la fréquence théorique. Le test de Spearman ou test de Pearson était utilisé pour l’analyse de corrélation. Le taux global de survie des patients a été obtenu par la méthode Kaplan-Meier, et le test de rang logarithmique a été utilisé pour les tests. Les courbes de survie ont été dessinées en utilisant le langage R basé sur le logiciel RStudio. La valeur p <0,10 était considérée comme statistiquement significative.

Applicabilité pratique et limites
Pour une mise en œuvre fiable de ce flux de travail intégré, les blocs de tissu FFPE doivent respecter des normes de qualité strictes, incluant une cellulité tumorale idéale de ≥30 % et l’absence de nécrose étendue ou d’artefacts tissulaires significatifs. Le succès technique du MII dépend fortement de la préservation des tissus ; Des facteurs tels que la surfixation, des dommages excessifs ou une autofluorescence de fond élevée peuvent entraîner une pénétration insuffisante des anticorps et une intensité de signal sous-optimale. De plus, plusieurs limites inhérentes à cette étude doivent être prises en compte. Premièrement, l’analyse repose sur une cohorte rétrospective à centre unique de 63 patients, ce qui pourrait limiter la puissance statistique et la généralisation large des résultats à d’autres populations. Deuxièmement, le champ de l’évaluation est limité à un panel NGS fixe de 37 gènes et à un ensemble spécifique de marqueurs immunitaires (HLA-DR, CD68, CD163, CD206,-L1 et PanCK ; Tableau supplémentaire 1). Comme indiqué dans les sources, bien que cette approche combinée fournisse un cadre plus solide pour la stratification pronostique, des études prospectives plus larges et multicentriques sont nécessaires pour valider davantage ces associations et affiner l’utilité prédictive des biomarqueurs identifiés.

Résultats

Caractéristiques cliniques des patients atteints d’adénocarcinome pulmonaire
Au total, 63 patients diagnostiqués avec un LUAD ayant subiun traitement chirurgical dans notre hôpital entre 2015 et 2021 et remplissant les critères d’inclusion ont été collectés dans cette étude. Les caractéristiques cliniques des patients inclus sont présentées dans le tableau 1. Parmi les patients inscrits, l’âge médian était de 60 ans (47-73 ans), incluant 30/6...

Discussion

Profilage immunologique intégré génomique et spatialement résolu du LUAD
Cette étude démontre un flux de travail intégré combinant NGS ciblé et mIF pour caractériser le paysage multidimensionnel des LUAD. Nos résultats génomiques correspondent à la littérature antérieure, notamment concernant les variations ethniques dans la fréquence des mutations. Le taux observé de mutations de l’EGFR (environ 40 % à 60 %) correspond aux fréquences rapportées dans les popu...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
AlphaTSA Multiplex IHC Kit	alphaxbio Technology Co., Ltd.	AXT36025011	Coloration par immunofluorescence multiplex
Milieu de montage antifade	Leagene Technology Co., Ltd.	IH0252, Lot0525A17	Coloration par immunofluorescence multiplex
CD163  ;	Beijing Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co. Ltd	ZM0428  ;	RRID : AB_3714707 ; Coloration par immunofluorescence multiplex
CD206	Abcam, Inc	Cat# 5307-1	RRID : AB_10896526 ; Coloration par immunofluorescence multiplex
CD68  ;	Beijing Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co. Ltd	ZM0060  ;	RRID : AB_2904190 ; Coloration par immunofluorescence multiplex
Panel personnalisé des gènes du cancer	TWIST Co., Ltd.		Préparation de la bibliothèque NGS & nbsp ;
Buffe de déparaffinisation	QIAGEN Co., Ltd.	19093	Extraction d’ADN coloration HE ; Coloration par immunofluorescence multiplex à partir de coupes de tissu FFPE
Dynabead M-270 streptavidine & nbsp ;	Thermo Co., Ltd.	65602	Préparation de la bibliothèque NGS & nbsp ;
Fluoromètre	ThermoFisher Scientific Co., Ltd.	QUBIT 4.0  ;	Préparation de la bibliothèque NGS & nbsp ;
Plateforme numérique d’analyse d’images pathologiques HALO	Indica Labs, Inc., Albuquerque	version 3.6.4134	Coloration HE et analyse de coloration immunofluorescence multiplex
Kit de coloration à l’hématoxyline-éosine	Wuhan elabscience Technology Co., Ltd.	E-IR-R117  ;	Tache HE
Kit d’ADN HiPure FFPE	Guangzhou Magen Biotechnology Co., Ltd.	D6323	Extraction d’ADN à partir de sections de tissu FFPE
HLA-DR & NBSP ;	HUABIO Co., Ltd.	ET1610-66  ;	RRID : AB_3069950 ; Coloration par immunofluorescence multiplex
Séquenceur d’ADN Illumina	Illumina,   ; Inc	550DX  ;	Séquençage
Balsam neutre	Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.	G8590	Tache HE
Panck  ;	Beijing Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co. Ltd	ZM0069	RRID : AB_2941997 ; Coloration par immunofluorescence multiplex
-L1	Systèmes R et D	Catalogue # AF1019	RRID : AB_354540 ; Coloration par immunofluorescence multiplex
Tampon TBST	abclonla Technology Co., Ltd.	RM00013	Coloration HE et coloration immunofluorescence multiplex
UN-Blocker  ;	Homgen Co., Ltd.		Préparation de la bibliothèque NGS & nbsp ;
VAHTS ADN Clean Beads & nbsp ;	Vazyme Co., Ltd.	N411	Préparation de la bibliothèque NGS & nbsp ;
Bibliothèque ADN uniersale VAHTS Kit de préparation pour illumina	Vazyme Co., Ltd.	ND610	Préparation de la bibliothèque NGS & nbsp ;
Système d’imagerie à lame entière	ZEISS Co., Ltd.	ZEISS AXIOSCAN 7 version 3.3  ;	Coloration HE et analyse de coloration immunofluorescence multiplex
Kit d’hybridation et de lavage xGen & nbsp ;	IDT Co., Ltd.	1080577	Préparation de la bibliothèque NGS & nbsp ;