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Article de méthode

Essai par blot de points pour détecter les niveaux globaux de modification de l’ARNde la N 6-méthyladenosine

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DOI :

10.3791/69860

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6 février 2026

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1Longhua Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 2Key Laboratory of Theory and Therapy of Muscles and Bones, Ministry of Education

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Ici, nous présentons un protocole pour évaluer semi-quantitativement les niveaux globaux de m⁶A en utilisant le blot de points. L’ARN total est extrait, dénaturé, taché sur une membrane en nylon, sondé avec un anticorps anti-m⁶A, et visualisé par chimiluminescence. L’intensité du signal, quantifiée par l’analyse en niveaux de gris ImageJ, reflète l’abondance relative de méthylation, offrant un flux de travail reproductible pour la recherche.

Résumé

La N 6-méthyladénosine (m⁶A) est la modification interne la plus abondante de l’ARN messager eucaryote (ARNm) et sert de régulateur clé de l’expression génique post-transcriptionnelle. Les méthodes d’investigation de m⁶A peuvent être appliquées à plusieurs niveaux de résolution, incluant la quantification globale, la détection spécifique aux nucléotides et l’analyse de transcrits particuliers d’intérêt. Parmi ceux-ci, le test blot en points offre une approche simple, rapide et rentable pour une évaluation semi-quantitative des niveaux mondiaux de modification m⁶A. Dans ce test, les cellules sont d’abord traitées pour extraire l’ARN total, qui est ensuite dilué et dénaturé. Les échantillons d’ARN sont placés sur une membrane en nylon, sondés avec un anticorps anti-m⁶A, et visualisés par chimiluminescence, l’intensité du signal indiquant l’abondance relative de la méthylation. Enfin, la quantification et la comparaison des intensités de signaux sont effectuées en mesurant les valeurs en niveaux de gris avec ImageJ. Comparé aux méthodes basées sur le séquençage ou la spectrométrie de masse, le blot de points nécessite un minimum d’instruments et d’expertise technique, ce qui le rend particulièrement adapté au dépistage de routine, aux études fonctionnelles préliminaires et aux analyses comparatives. Ce protocole fournit un flux de travail détaillé et reproductible pour la mise en œuvre du test blot de points m⁶A dans des applications de recherche fondamentale et translationnelles.

Introduction

La N 6-méthyladénosine (m⁶A) est la modification interne la plus répandue dans l’ARN messager eucaryote (ARNm) et joue un rôle essentiel dans la régulation post-transcriptionnelle, incluant la stabilité, le splicing, la dégradation, la translation et l’exportation de l’ARN 1,2,3. La dysrégulation de la modification m⁶A a été impliquée dans divers processus physiologiques et pathologiques, notamment l’initiation, la progression et la métastasetumorale 4,5. Dans l’ostéosarcome, des niveaux élevés de m⁶A ont été observés tant dans les lignées cellulaires que dans les tissus, suggérant un rôle de la méthylation aberrante de l’ARN dans la biologie desmaladies 6,7. Par conséquent, une évaluation systématique de l’abondance globale de m⁶A, ainsi que ses modifications dans les transcrits associés à l’ostéosarcome et les voies régulatrices, est essentielle pour clarifier les mécanismes biologiques et les implications cliniques de la méthylation de l’ARN dans l’ostéosarcome.

Plusieurs méthodes analytiques sont disponibles pour étudier les modifications m⁶A 8,9. La chromatographie liquide-spectrométrie de masse/spectrométrie de masse (LC-MS/MS)10 et les tests immunosorbants liés aux enzymes (ELISA) 11 sont tous deux utilisés pour mesurer les niveaux globaux de m⁶A. Le premier offre une grande sensibilité mais nécessite un équipement spécialisé et une expertise, tandis que le second donnedesm 6 A levels relatifs et contribue à un coût plus élevé que le test dot blot. MeRIP-qPCR permet une évaluation ciblée de certains transcriptes, mais elle est fortement influencée par l’efficacité del’immunoprécipitation 12. MeRIP-seq13, m⁶A-seq 14 et m⁶A-SAC-seq15 sont des approches basées sur le séquençage, capables de cartographier précisément les sites de méthylation m⁶A ; cependant, ils sont coûteux et nécessitent une analyse bioinformatique approfondie.

Le test de blot de points m⁶A offre une méthode simple, rapide et économique pour déterminer les niveaux mondiaux de modification de m⁶A dans l’ARN. En tant qu’immunotest semi-quantitatif, son principal avantage réside dans la génération d’une vue globale de l’abondance de m⁶A sans nécessiter d’équipements spécialisés ni d’analyses bioinformatiques complexes. Cela fait du test blot de points m⁶A un outil précieux pour le dépistage de routine, la validation fonctionnelle préliminaire et la recherche clinique, ainsi qu’un complément pratique aux approches avancées basées sur le séquençage et la spectrométrie de masse. Le protocole actuel propose un flux de travail détaillé étape par étape, garantissant une détection reproductible et une large applicabilité.

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Protocole

REMARQUE : Le protocole est organisé en trois sections : préparation de l’ARN, test par blot de points et quantification. Le tableau des matériaux résume les matériaux requis, le tableau supplémentaire 1 détaille les formulations des réactifs, et la figure 1 illustre le flux de travail expérimental.

1. Préparation de l’ARN

  1. Préparation cellulaire
    1. Retirer les cellules 143B avec un knockdown stable SNHG21 (shSNHG21), les cellules témoins négatives (shCtrl) et les cellules traitées avec la 3-déazadénosine (3-DAA ; [100 μM, 24 h]) et acide méclofénamique (MA ; [100 μM, 24 h]) de l’incubateur à 37 °C.
    2. Vérifiez que la confluence cellulaire est d’environ 80-90 % et que les cellules sont en bon état au microscope.
    3. Retirez le milieu de culture, puis rincez les cellules deux fois avec 1 mL de PBS.
    4. Retirez le PBS, puis ajoutez 1 mL de trypsine par plat de 6 cm.
    5. Secouez doucement pour répartir la trypsine uniformément et faites couver pendant 1 minute.
    6. Retirez la trypsine, puis ajoutez 1 mL de milieu contenant 10 % de FBS pour arrêter la digestion.
    7. Pipette la suspension cellulaire plusieurs fois pour disperser les cellules.
    8. Transférez la suspension cellulaire dans un tube microcentrifuge sans RNase de 1,5 mL.
      REMARQUE : Étiquetez le tube avant utilisation. Les étapes 1.1.3 à 1.1.8 doivent être effectuées dans des conditions stériles.
    9. Centrifugeuse à 1000 × g pendant 3 minutes, puis retire complètement le surnageant.
  2. Extraction d’ARN
    REMARQUE : L’extraction d’ARN est réalisée à l’aide d’un kit de purification ARN EZ-press.
    1. Ajoutez 600 μL de tampon de lyse (présent dans le kit de purification ARN) au pellet et au vortex soigneusement pour lyser complètement les cellules, puis laissez reposer 5 minutes.
      REMARQUE : Environ 2 × 106 cellules sont utilisées pour l’isolement de l’ARN.
    2. Ajoutez un volume égal de 100 % d’éthanol et de vortex soigneusement.
    3. Ajoutez 600 μL de ce mélange sur une colonne de rotation assemblée avec un tube de collecte.
      REMARQUE : Assemblez la colonne de rotation et le tube de collecte avant utilisation, et étiquetez le tube avant utilisation.
    4. Centrifugez à 12 000 × g pendant 1 minute et jetez le liquide dans le tube de collecte.
      REMARQUE : Évitez le contact entre le fond de la colonne et le liquide ou l’opérateur.
    5. Répétez les étapes ci-dessus 1.2.3-1.2.4 pour le mélange restant.
    6. Ajoutez 500 μL de tampon de lavage (présent dans le kit de purification ARN) à chaque colonne de spin, laissez-la reposer à température ambiante pendant 1 minute.
    7. Centrifugez à 12 000 × g pendant 1 minute et jetez le liquide dans le tube de collecte.
    8. Centrifugez à nouveau la colonne vide à 12 000 × g pendant 1 minute pour éliminer le liquide résiduel.
    9. Transférez la colonne de rotation dans un nouveau tube sans RNase de 1,5 mL, ouvrez le couvercle et laissez-le sécher à l’air pendant 2 minutes.
      REMARQUE : Étiquetez le tube avant utilisation.
    10. Ajoutez 25 à 50 μL de tampon d’élution (eau sans enzymes) au centre de la colonne de spin.
    11. Incubez à température ambiante pendant 2 minutes.
    12. Centrifugez à 12 000 × g pendant 1 minute pour éluer l’ARN.
    13. Jetez la colonne de spin et placez l’ARN sur la glace.
      REMARQUE : Conserver l’ARN à -80 °C jusqu’à utilisation.
  3. Dilution de l’ARN
    1. Mesure de la concentration d’ARN des cellules 143B shSNHG21, des cellules 143B shCtrl et des cellules traitées avec 3-DAA et MA à l’aide d’un spectrophotomètre DS-11.
    2. Préparez 1 μg d’ARN total de chaque lignée cellulaire.
    3. Diluer en série l’ARN à 400 ng, 200 ng et 100 ng avec de l’eau traitée au pyrocarbonate de diéthyle (DEPC).
      REMARQUE : Ajustez le gradient de concentration si nécessaire.
  4. Dénaturation de l’ARN
    1. Chauffez les échantillons d’ARN dilué à 95 °C pendant 3 minutes.
    2. Transférez immédiatement les échantillons dans de la glace pour les refroidir.
      REMARQUE : L’ARN dénaturé peut être stocké à 4 °C pendant jusqu’à 1 semaine.

2. Tache de points

  1. Spotting d’ARN
    1. Coupez la membrane en nylon chargée positivement à la taille souhaitée.
    2. Tracez des lignes de référence et étiquetez la membrane avec le nom de l’échantillon.
    3. Mélangez l’ARN soigneusement par vortex ou pipetage doux par tourbillonnage.
    4. Placez 1 à 2 μL de chaque échantillon d’ARN sur les positions désignées de la membrane.
      REMARQUE : Utilisez en permanence des pointes de pipette sans RNase. Évitez le contact direct entre la pointe de la pipette et la membrane. Laissez l’ARN diffuser naturellement sur la membrane. Utilisez une nouvelle pointe de pipette pour chaque échantillon. Ne pas dépasser 2 μL par point pour éviter une diffusion irrégulière.
  2. Réticulation à ARN
    1. Faites sécher la membrane à l’air libre pendant 3 minutes.
    2. Effectuer la réticulation ARN en irradiant la membrane dans un réticulateur UV à 254 nm, 120 mJ/cm².
      REMARQUE : Incubez la membrane à 37 °C pendant 30 minutes comme alternative alternative.
    3. Lavez la membrane avec 10 mL de 1x TBST sur une plateforme basculante pendant 5 minutes pour éliminer l’ARN non lié.
  3. Blocage par membrane
    1. Préparez une solution à 5 % de BSA.
      REMARQUE : Préparez cette solution fraîchement avant utilisation.
    2. Incubez la membrane dans la solution bloquante à température ambiante pendant 2 heures.
  4. Incubation des anticorps
    1. Incubez la membrane avec l’anticorps anti-m⁶A pendant la nuit à 4 °C.
      REMARQUE : Diluer l’anticorps 1:1000 dans une solution de 5 % de BSA avant utilisation. Incubez la membrane sur une plateforme basculante avec un léger secouement (50 tr/min).
    2. Lavez la membrane trois fois avec 10 mL de 1x TBST sur une plateforme basculante pendant 10 minutes.
    3. Incubez la membrane avec un anticorps secondaire conjugué à la peroxydase de raifort (HRP) pendant 1 h à température ambiante.
      REMARQUE : Diluer l’anticorps 1:1000 dans une solution de 5 % de BSA avant utilisation.
    4. Lavez la membrane trois fois avec 10 mL de 1x TBST sur une plateforme basculante pendant 10 minutes.
  5. Détection de chimiluminescence
    1. Appliquez uniformément le substrat de HRP chimiluminescent goutte dans la membrane.
      REMARQUE : Incubez la membrane avec le substrat pendant 1 minute à température ambiante en balançant doucement.
    2. Détecter le signal à l’aide d’un système d’imagerie chimiluminescence.
    3. Utilisez une fonction d’exposition automatique dans le système d’imagerie chimiluminescence comme pré-scan initial.
      REMARQUE : Accepter l’auto-temps seulement si le signal le plus lumineux est saturé à moins de 65 % ; sinon, réduisez l’exposition par deux et réacquérez jusqu’à ce que le signal de pic tombe dans une fourchette de 30-60 %.
  6. Coloration au bleu de méthylène (MB)
    1. Incubez la membrane dans la solution de coloration MB pendant 1 minute.
    2. Lavez la membrane trois fois avec 10 mL de 1x TBST sur une plateforme basculante pendant 5 minutes, puis prenez l’image comme témoin de chargement.
      REMARQUE : Teindre la même membrane utilisée pour la chimiluminescence. Évitez de déranger les sédiments dans la solution de coloration. Portez des vêtements de protection et un masque, car le MB est difficile à enlever.
    3. Retirez la membrane boucle de MB après l’imagerie avec une solution contenant 1 % de SDS sur une plateforme basculante pendant 15 minutes pour faciliter la documentation ou une éventuelle re-sonde.

3. Quantification

  1. Mesure de la valeur en niveaux de gris
    1. Importez l’image dans le logiciel ImageJ.
    2. Convertir l’image en format 8 bits en utilisant le type Image > Type > 8 bits.
    3. Soustraire le fond par le processus > soustraire le fond.
      REMARQUE : Rayon : 50,0 pixels, vérifier Fond clair.
    4. Utilisez l’outil Rectangle pour sélectionner la zone d’analyse.
    5. Définissez les voies séquentiellement avec Analyser > Gels > sélectionner la première voie.
    6. Générez des profils d’intensité en utilisant l’analyse > les gels, > tracez les voies et mesurez les pics.
    7. Mesurez respectivement les valeurs en niveaux de gris de m⁶A et MB.
  2. Copiez les données dans un tableau pour analyse.
  3. Comparez les intensités des signaux pour évaluer les niveaux mondiaux de modification de m⁶A.

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Résultats

Pour valider rigoureusement la performance du test de blot en point et examiner le rôle de SNHG21 dans la régulation des niveaux globaux de m6A , les cellules 143B ont été soumises à des perturbations pharmacologiques qui suppriment ou améliorent la méthylation de m6A et ont surveillé l’abondance de m6A dans les deux sens.

Quantification par blot de points de l’abondance globale m6 A
Nous avons d’abord évalué la c...

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Discussion

Dans cette étude, la réduction du SNHG21 dans les cellules ostéosarcome 143B a entraîné une diminution de l’intensité du signal m⁶A, démontrant la valeur de ce test pour évaluer si les modifications génétiques affectent la méthylation de l’ARN. De plus, ce test sert d’outil pour de multiples applications, notamment : 1) Études fonctionnelles et validation mécanistique : Ce test peut être utilisé pour un dépistage préliminaire rapide afin de déterminer si les niveaux globaux de m⁶A sont a...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs ne rapportent aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par des subventions de la National Nature Science Foundation (82174408, 82374477 et 82474535). La figure 1 a été créée avec BioRender.com.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
3-dézaadénosine (3-DAA)MCEHY-W013332A1 mg
Anticorps monoclonal anti-m6AProteintech68055-1-IG50 & mu ; L
Albumine sérique bovine (BSA, fraction V)BioFroxx4240GR100  ;100 g
Système d’imagerie ChemiDoc MPBIO RAD12003154
DMEM Glucose élevéWISENT319-005-CL500 mL
Spectrophotomètre DS-11DeNOVIXDS-11
Kit de purification ARN EZ-pressEZB  ;B0004DP100 préparations
FBS - Qualité supérieureWISENT086-150500 mL
IgG anti-souris de chèvre conjugué HRP (H+L)BeyotimeA02161 mL
Immobilon Western chemiluminescent HRP substrat   ;MilliporeWBKLS05002 et fois ; 250 mL
Acide méclofénamique (MA)MCEHY-1172751 mg
Solution de coloration au bleu de méthylèneSolarbioG13000,1 %, 100 mL
Membrane de transfert en nylonLABSELECTTM-NY-XS-457.4 et hors ; 8,5 cm, 0,45 & mu ; m, 10 PCS/BAG
Tampon PBS (poudre sèche prête à l’emploi)biosharpBL601ApH : 7,2-7,4, 2 L/sac
Dodécyle sulfate de sodium (SDS)SigmaL5750-500G500 g
Poudre de prémélange tampon TBSSangon  ; A510025-00011EA (243,9 g de poudre)
TrypLE Express EnzymeGibco12604-0211 et fois, 500 mL
Préadolescent-20SangonA600560-0500500 mL
Réticulateur UVUVPCL-1000

Références

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Réimpressions et autorisations

Mots-clés

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