Construction d’organoïdes des glandes salivaires à partir de glandes salivaires mineures humaines

Résumé

Ce protocole génère des organoïdes des glandes salivaires mineures humaines par l’auto-organisation des cellules souches des glandes salivaires mineures humaines (hMSG-SC) et des cellules souches mesenchymaires des glandes salivaires mineures humaines (hMSG-MSC) au sein d’un système matrigel 3D.

Résumé

Cette étude décrit un protocole pour la construction d’organoïdes humains de glandes salivaires mineures (hMSG) afin d’établir un modèle reproductible pour la recherche sur la régénération tissulaire. Les cellules souches/progénitrices des glandes salivaires (hMSG-SC) et les cellules souches mésenchymateuses (hMSG-MSC) ont été isolées à partir de tissus mineurs pédiatriques des glandes salivaires, dilatées et co-semées dans un système tridimensionnel (3D) basé sur Matrigel. L’auto-organisation a conduit à la formation d’organoïdes avec des structures ductal-acinar, récapitulant plus efficacement l’hétérogénéité cellulaire native que les modèles uniquement épithéliaux. Le protocole actuel met l’accent sur des conditions de culture optimisées pour préserver les phénotypes cellulaires et sur des étapes standardisées pour le passage, le mélange de rapports et la manipulation de Matrigel (une matrice commerciale de socle), améliorant ainsi la reproductibilité. Il est important de noter que la présence de cellules mésenchymateuses offre un microenvironnement favorable qui favorise la survie épithéliale, la prolifération et la morphogenèse, surmontant ainsi les limites de faible efficacité et de structure incomplète. Cette approche permet une génération cohérente d’organoïdes glandulaires salivaires et offre un modèle robuste pour étudier le développement, la restauration fonctionnelle et les mécanismes des maladies, tout en soutenant des applications translationnelles potentielles dans les thérapies régénératives.

Introduction

Les glandes salivaires sont des glandes exocrines essentielles dans la cavité buccale, responsables de la sécrétation de la salive pour maintenir l’humidité buccale, faciliter la digestion et assurer une défense^{antimicrobienne 1}. Le dysfonctionnement de ces glandes, comme dans le syndrome de Sjögren ou les dommages post-radiothérapie, peut entraîner de graves problèmes bucco-dentaires, et les traitements régénératifs efficaces font actuellement défaut². La technologie organoïde, une méthode émergente pour construire des substituts cellulaires imitant la structure et la fonction des tissus et des organes dans un système de culture tridimensionnelle (3D), offre un outil prometteur pour la recherche sur la régénération des glandes^{salivaires 3}.

Ces dernières années, des systèmes de culture organoïde des glandes salivaires de souris et humains ont été mis en place^{avec succès 4,5}. Divers types de cellules souches, dont les cellules souches/progénitrices des glandes^{salivaires 4,5}, les cellules souches^{pluripotentes 6,7}, et les cellules souches dérivées de l’épithélium telles que les cellules souches folliculaires^{dentaires 8}, ont été utilisés pour générer ces organoïdes. Néanmoins, plusieurs défis techniques subsistent. Les cellules souches/progénitrices de l’épithéliale des glandes salivaires humaines primaires (hSG-epiS/PCs) présentent une prolifération limitée et une faible survie in vitro, ce qui limite l’efficacité de formation des organoïdes et sa reproductibilité⁹. De plus, les organoïdes dérivés uniquement de cellules épithéliales manquent souvent d’hétérogénéité multicellulaire et ne parviennent pas à reproduire pleinement l’architecture ramifiée et l’organisation fonctionnelle acinar-ductale des glandes^{natives 10}.

Dans ce contexte, cette étude vise à établir une méthode standardisée pour construire des organoïdes des glandes salivaires mineures humaines. Tout d’abord, nous avons isolé les cellules souches (hMSG-SC) et les cellules souches mésenchymataires (hMSG-MSC) à partir de tissus mineurs des glandes salivaires^humaines 11,12,13. Les organoïdes ont ensuite été initiés via un mécanisme d’auto-assemblage en co-ensemençant les hMSG-SC et hMSG-MSC dans Matrigel. Cette méthode fournit une plateforme reproductible pour la culture organoïde des glandes salivaires et pose une base importante pour les recherches futures en régénération des glandes salivaires et en modélisation des maladies.

Protocole

Des échantillons de glandes salivaires mineures humaines (hMSG) ont été prélevés auprès de patients subissant une chirurgie des lèvres au Département de chirurgie plastique et reconstructive, Shanghai Ninth People’s Hospital, faculté de médecine de l’Université Jiao Tong de Shanghai. Les patients (n > 10) avaient entre 3 mois et 10 ans, sans antécédents de troubles glandules ou de maladies auto-immunes. Tous les tissus ont été prélevés à partir de glandes salivaires mineures redondantes et histologiquement normales, excisées lors de la réparation de la fente labiale, ce qui fournit une source de tissu viable éthiquement approuvée et optimale pour l’isolement des cellules souches/progénitrices. Le consentement éclairé a été obtenu avant l’opération, et l’étude a été approuvée par le Comité d’éthique médicale de l’Hôpital du Peuple de Shanghai Ninth (Approbation n°2018-56). Les réactifs et l’équipement utilisés sont listés dans le tableau des matériaux.

1. Collecte de tissu des glandes salivaires mineures humaines

1. Immédiatement après l’excision, immergez les tissus des glandes salivaires dans le Médium Eagle Modifié (DMEM) de Dulbecco, complété avec des antibiotiques, et maintenez-les à 4 °C jusqu’à un traitement supplémentaire (dans les 6 heures).

2. Isolement cellulaire des tissus des glandes salivaires mineures humaines

1. Assurez des conditions stériles en préparant un kit chirurgical autoclavé et en réalisant toutes les interventions à l’intérieur d’un cabinet de biosécurité (BSC de classe II).
2. Transférez le tissu excisé dans une cuvette contenant la solution de phosphate tampon (PBS) de Dulbecco et lavez soigneusement. Pendant le lavage, utilisez des pinces pour retirer soigneusement tout tissu conjonctif et le sang résiduel, afin de vous assurer que le tissu des glandes salivaires est complètement nettoyé.
3. Ajoutez 1 mL de milieu sans sérum pour éviter la déshydratation des tissus. Coupez le tissu en morceaux ne dépassant pas 0,5^{mm 3} à l’aide de ciseaux ophtalmiques stériles.
4. À l’aide de pinces stériles, répartissez uniformément les morceaux de tissu au fond d’une fiole de culture T-25.
5. Ajoutez 10 mL de substrat à la fiole de culture.
   REMARQUE : Pour la culture des cellules souches épithéliales (hMSG-SC), le principal milieu de culture utilisé est le milieu kératinocytique (KM), contenant 5 μg/mL d’albumine sérique bovine, 50 μg/mL d’extrait hypophysaire bovin, 5 μg/mL de transhérrine, 3,75 μg/mL d’insuline, 3 ng/mL de facteur de croissance des fibroblastes 2, 1 ng/mL de facteur de croissance épidermique, 500 ng/mL d’épinéphrine, 0,5 μg/mL d’hydrocortisone, ^10-8 M prostaglandines E₂, et 30 nM_{T 3}. Pour la culture de cellules souches mésenchymateuses (hMSG-MSC), le milieu de culture primaire est composé de DMEM/F12 complétée avec 10 % de sérum fœtal bovin (FBS), 1 % de pénicilline-streptomycine (5 000 U/mL) et un supplément de GlutaMAX à 1 %.
6. Placez la fiole T-25 verticalement dans un incubateur à 37 °C, 5 % de CO₂ pendant 4 à 5 heures. En position verticale, le milieu ne contacte pas le tissu haché, permettant aux explants de se déposer et de s’attacher fermement à la surface inférieure.
7. Après 4 à 5 heures, basculez la fiole en position horizontale afin que le milieu de culture recouvre complètement les morceaux de tissu attachés et soutienne la croissance cellulaire.
8. Remplacez la moitié du milieu au jour 4, puis remplacez le milieu tous les 3 jours jusqu’à ce que des colonies cellulaires apparaissent. Lorsque l’inhibition de la croissance cellulaire est observée, procéder à la transmission.

3. Passage cellulaire

1. Cellules du passage lorsque les colonies cellulaires primaires présentent une inhibition de croissance ou lorsque la confluence cellulaire atteint 80 % à 90 %.
2. Aspirez le milieu de culture et lavez les cellules une fois avec du PBS.
3. Ajoutez 1 mL de Trypsine-EDTA à 0,25 % et incubez à 37°C, 5 % de CO₂ pendant 4 minutes pour les cellules épithéliales et 1,5 min pour les cellules mésenchymates, respectivement.
4. Neutralisez la trypsine en ajoutant 5 mL de milieu DMEM pré-chauffé, complétés par 10 % de FBS. Pipettez doucement les cellules pour assurer une dissociation correcte, puis transférez la suspension cellulaire dans un tube centrifugeuse et centrifugez à 300 × g pendant 5 minutes.
5. Jetez le surnageant et resuspendez les hMSG-SC dans un milieu KM, puis resuspendez les hMSG-MSC dans le milieu cellulaire mésenchymateux (MSCM).
6. Semez les cellules en suspension dans des flasques de culture T-25 à un ratio 1:3, puis incubez à 37 °C, 5 % de_CO2 pour une expansion continue.

4. Auto-organisation des hMSG-MSC et hMSG-SC pour la construction d’organoïdes

1. Dégel Matrigel sur glace pendant 3-4 heures.
2. Préchauffez une plaque de 24 puits à 37 °C dans un incubateur et pré-refroidissez les pointes de pipette à 4 °C pour une manipulation précise.
3. Ajoutez 450 μL de PBS stérile pré-refroidi à 1 mL de Matrigel complètement décongelé.
4. Mélangez doucement à l’aide de pointes de pipette pré-refroidies et distribuez 350 μL de Matrigel dilué par puits dans la plaque préchauffée à 24 puits, en veillant à ne pas former de bulles.
5. Inclinez doucement la plaque pour assurer un revêtement uniforme de Matrigel.
6. Placez la plaque dans_{un incubateur} à 37 °C et 5 % de CO 2 pendant 20 à 30 minutes pour permettre à la Matrigel de se solidifier. Évitez de trop sécher le Matrigel.
7. Cultivez séparément les hMSG-MSC et hMSG-SC aux passages 3-5 jusqu’à atteindre une confluence de 80 % à 90 %. Digérez les cellules contenant 0,25 % de trypsine-EDTA, neutralisez avec un milieu complet et comptez le nombre de cellules à l’aide d’un compteur cellulaire automatisé ou d’un hémocytomètre.
8. Centrifugez à 300 × g pendant 5 minutes, jetez le surnageant, puis remettez en suspension dans un milieu de culture frais.
9. Mélangez hMSG-MSC et hMSG-SC dans un ratio de 1:1.
10. Semez les cellules dans des plaques à 24 puits recouvertes de Matrigel à une concentration totale de 2 x 10^{5 cellules} par puits.
11. Ajoutez 1 mL de milieu de culture organoïde (MSCM : KM = 1:1) à chaque puits.
12. Incubez à 37 °C, 5 % de_CO2 , et changez le milieu tous les 3 jours.
13. Sous-culture des organoïdes tous les 7 jours dans un ratio de 1:2 à 1:4, puis resuspendus dans un milieu de congélation cellulaire pour stockage à -80 °C.

5. Statistiques et reproductibilité

1. Analysez toutes les données à l’aide de logiciels statistiques et de graphiques et présentez comme moyenne ± écart-type (SD). Des tests t de Student à deux queues non appariés ont été utilisés pour comparer deux groupes. P < 0,05 était considéré comme statistiquement significatif.
   REMARQUE : Toutes les expériences ont été répétées indépendamment au moins trois fois avec des résultats similaires, et toutes les analyses statistiques étaient basées sur au moins trois expériences ou échantillons indépendants.

Résultats

Les explants de tissu des glandes salivaires mineurs humains, cultivés dans des flasques de T25, ont montré une prolifération cellulaire claire autour des blocs tissulaires après environ 5 jours. Dans un milieu de culture de cellules souches riche en sérum, les cellules présentaient une morphologie en forme de fuseau caractéristique des hMSG-MSC (Figure 1A,B). L’analyse de cytométrie en flux a révélé que ces cellules exprimaient des niveaux élevés de marqueurs mésenchymateux...

Discussion

Ce protocole permet la construction réussie d’organoïdes des glandes salivaires mineures humaines grâce à l’isolement et à la culture de hMSG-SC et hMSG-MSC. La formation des organoïdes dépend d’une préparation soigneuse des explants tissulaires, du maintien de conditions de culture distinctes pour les cellules épithéliales et mésenchymates, ainsi que d’un co-ensemencement précis des deux types cellulaires sur Matrigel. Des ratios cellulaires et des densités de semis appropriés sont esse...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Dulbecco » s Eagle Moyen Modifié (DMEM)	Gibco	C11885500BT
0,25 % de trypsine-EDTA	Gibco	25200056
Dulbecco » s Eagle Moyen Modifié (DMEM)/F12	Gibco	C11330500BT
Sérum fœtal bovin (FBS)	Gibco	10270106
GlutaMAX	Gibco	35050061
Milieu kératinocytaire	Sciencell	2101
Matrigel	BD	356230
Milieu de cellules souches mésenchymeuses (MSCM)	Sciencell  ;	7501
Pénicilline/Streptomycine  ;	Gibco	15140122
Solution physiologique tamponnée au phosphate (PBS)	Gibco	C20012500BT