Cet article présente un modèle ischémique de MRC utilisant une IRI rénale unilatérale avec une néphrectomie controlatérale réalisée un jour avant la collecte de l’échantillon ; ce protocole permet une évaluation fonctionnelle basée sur le sérum, une survie élevée et une pathologie reproductible de la MRC à 28 et 42 jours, offrant une plateforme polyvalente pour les études mécanistes et interventionnelles.
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Article de méthode
Modèle murin de transition d’une maladie rénale aiguë à chronique induite par une ischémie rénale/lésion de reperfusion
Dans cet article
Résumé
Résumé
L’occlusion chirurgicale transitoire du pédicule rénal induit une lésion ischémie-rénale (IRI), un modèle largement utilisé pour étudier l’insuffisance rénale aiguë (AK) et sa progression vers la maladie rénale chronique (MRC) chez la souris. Cependant, les protocoles conventionnels empêchent souvent soit l’évaluation fonctionnelle basée sur le sérum, soit entraînent une forte mortalité. Bien que les modèles IRI rénales unilatéraux et bilatéraux existants mettent l’accent sur la reproductibilité, des défis subsistent pour atteindre à la fois une sévérité constante des blessures et une survie à long terme adaptées à l’étude de la progression de la MRC. Ici, nous présentons un protocole d’approche dorsale qui fournit un modèle robuste et reproductible de la transition ischémique AKI vers MRC. L’approche dorsale facilite un accès direct aux reins et minimise la manipulation intra-abdominale. Nous utilisons une IRI rénale unilatérale combinée à une néphrectomie controlatérale, réalisée un jour avant la prélèvement sanguin et tissulaire. Cette approche offre deux avantages majeurs : (1) elle minimise la variabilité en évitant les incohérences associées aux blessures bilatérales, et (2) elle permet d’atteindre une survie de près de 100 % tout en maintenant une blessure constante, contrairement aux protocoles où la néphrectomie est pratiquée plus tôt et associée à une mortalité plus élevée. L’évaluation fonctionnelle est réalisée par BUN sérique et créatinine, et la fibrose interstitielle est quantifiée par le dépôt de collagène trichrome de Masson et les gènes marqueurs de la MRC à 28 et 42 jours après l’IRI rénale. Ensemble, ces résultats fournissent un aperçu complémentaire de l’altération fonctionnelle et du développement de la pathologie tissulaire. Ce protocole établit un modèle fiable et polyvalent de la MCC ischémique chez la souris pour des recherches mécanistiques.
Introduction
L’AKI est une complication courante chez les patients hospitalisés et reste un problème majeur de santé mondiale. Des études épidémiologiques indiquent que l’IRA survient chez jusqu’à 20 % des personnes hospitalisées et chez 30 à 60 % des patients en étatcritique 1,2. Bien que certains patients récupèrent la fonction rénale, d’autres présentent une récupération incomplète, ce qui les prédispose à uneMRC de type 3. La transition de l’AKI vers la MRC est de plus en plus reconnue comme un déterminant majeur des résultats à long terme et est devenue un sujet de recherche mécanistique et thérapeutique 4,5,6. Pour étudier les mécanismes moléculaires sous-jacents et tester des thérapies potentielles, des modèles animaux reproductibles sont essentiels.
L’occlusion transitoire chirurgicale du pédicule rénal (artère et veine) induit une IRI rénale, l’un des modèles les plus utilisés pour étudier l’AKI chez la souris. Cette procédure provoque une lésion épithéliale tubulaire aiguë et une réponse inflammatoire pouvant évoluer vers une fibrose interstitiellechronique 7,8. Cependant, les protocoles IRI rénaux conventionnels présentent plusieurs défis. L’IRI rénale unilatérale est associée à une mortalité minimale et est largement utilisée pour des études à longterme 9 ; cependant, l’évaluation de la fonction rénale (par exemple, la chimie sérique, l’analyse urinaire ou le taux de filtration glomérulaire) n’est pas envisageable. Les IRI rénales bilatérales ou les modèles combinant une IRI rénale unilatérale avec une néphrectomie controlatérale simultanée ou précoce sont associés à une mortalité accrue, limitant leur utilisation pour les études chroniques. Bien que des variations robustes de ces modèles aient été récemmentétudiées 10, leur application dans les contextes d’études chroniques mérite une attention particulière. De plus, certains protocoles utilisent une laparotomie de la ligne médiane ventrale, qui nécessite la manipulation des organes intra-abdominaux pour exposer le pédicule rénal. Cela peut augmenter l’invasivité chirurgicale et la complexité technique. Skrypnyk et al. ont rapporté que la néphrectomie controlatérale pratiquée 8 jours après une ischémie unilatérale permet une évaluation sérologique de la fonction rénale après une blessure, tout en maintenant un taux de survie élevé11. Ce protocole fournit un ensemble systématique de procédures optimisées pour évaluer la progression de l’AKI à la MRC sur une période allant jusqu’à 42 jours.
Cette étude démontre un modèle ischémique d’AKI-MRC utilisant une IRI rénale unilatérale, suivie d’une néphrectomie controlatérale retardée réalisée un jour avant la prélèvement des reins et des échantillons sanguins. Nous avons déjà utilisé des procédures similaires en tant que modèle AKI dans plusieurs publications12, 13, 14, 15. Nous avons réussi à étendre cette approche pour étudier la transition AKI vers MRC, dans laquelle, aux jours 28 et 42, des signes clairs de MRC sont apparents (Figure 1 pour le schéma). Cette approche assure une excellente survie, induit un phénotype très fibrosique dans les reins lésés et permet d’évaluer la fonction rénale à partir du sang collecté. Par conséquent, cette approche est particulièrement utile pour les études nécessitant une évaluation sérologique (contrairement à l’IRI rénale unilatérale seule) et un taux de survie amélioré (par rapport à l’IRI rénale bilatérale). Une approche par flanc dorsal a été utilisée pour accéder directement au rein. Comparée à la laparotomie ventrale de la ligne médiane, cette approche minimise la manipulation intra-abdominale et confine la manipulation chirurgicale aux tissus rénaux et périhilaires, améliorant ainsi la cohérence des procédures.
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Protocole
Les expériences animales menées dans cette étude ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Université de Pittsburgh (IACUC ; Protocole n° 23103811), conformément aux directives institutionnelles. Un groupe témoin de chirurgie simulée peut être inclus si nécessaire et subit généralement une exposition chirurgicale sans pincement vasculaire ni néphrectomie contralatérale. Consultez la section Matériaux pour des informations détaillées sur les outils et équipements utilisés. Les objets tranchants, y compris les aiguilles, les lames de scalpel et les pinces, doivent être jetés dans des contenants à objets tranchants désignés. Les déchets biologiques, y compris les tissus et les cadavres, doivent être manipulés et éliminés conformément aux protocoles institutionnels de gestion des déchets biologiques. Les réactifs et l’équipement utilisés sont listés dans le tableau des matériaux.
1. Préparation animale et installations chirurgicales
- Autoclave de tous les instruments chirurgicaux avant utilisation. Lors d’opérations chirurgicales sur plusieurs animaux, retirez le sang et les débris des instruments entre les procédures, puis stérilisez-les pendant 10 à 15 secondes à l’aide d’un stérilisateur à billes chaudes. Laissez refroidir les instruments avant de les réutiliser.
- Installez une bouillotte à circulation d’eau et placez une lampe infrarouge au-dessus du champ opératoire.
- Placez la souris dans une chambre d’induction anesthésique et induisez l’anesthésie avec de l’isoflurane (1,5 %-2 % en oxygène, 1-2 L/min) (selon les protocoles approuvés par l’institution). Une fois que la souris semble avoir perdu connaissance, confirmez la profondeur anesthésique adéquate en effectuant une pincée de l’orteil pour vérifier la perte des réflexes.
- Transférez la souris sur la bouillotte chirurgicale chauffante et maintenez l’anesthésie via un cône nasal.
- Administrez Ethiqa XR (buprénorphine à libération prolongée ; 3,25 mg/kg, s.c.) pour l’analgésie postopératoire.
- Placez la souris en position couchée sur le coussinet chirurgical. Fixez les membres avec du ruban adhésif si nécessaire pour minimiser les mouvements.
- Rase les poils dorsaux autour de la zone d’incision prévue à l’aide d’une tondeuse.
- Appliquez une pommade ophtalmique sur les yeux pour éviter la sécheresse pendant la procédure.
- Insérez une sonde rectale, fixez-la avec du ruban adhésif, puis connectez-la à un thermomètre pour une surveillance continue.
- Désinfectez la zone chirurgicale en alternant 10 % de povidone-iode et 70 % d’éthanol, puis couvrez la zone d’un drapé stérile.
2. IRI rénale unilatérale
- Réalisez une incision cutanée dorsale médiane (3-4 cm) couvrant le niveau des reins.
- Séparez la peau des couches sous-cutanées à l’aide de ciseaux séparateurs de tissus.
- Identifiez la localisation rénale par palpation à travers la peau.
- Au niveau où le rein est visualisé, à environ 1 cm latéralement par rapport à la colonne vertébrale du côté gauche, effectuer une incision musculaire longitudinale de 1 à 1,5 cm.
REMARQUE : Si l’incision est trop longue, le rein peut glisser dans la cavité abdominale, compliquant la manipulation ultérieure. Une incision cutanée minimale peut maintenir le rein extériorisé. - Externalisez doucement le rein par l’incision dorsale. Si une fine membrane gêne l’accès, disséquez-la sans détour.
- Lors de la stabilisation du rein avec des pinces non dentelées, disséquez de manière directe la graisse périhilaire et le tissu conjonctif autour des pédicules rénaux supérieur et inférieur afin de créer un « canal » pour la pose d’une pince vasculaire.
- Confirmez que la température corporelle centrale est suffisamment élevée (36,8-37,2 °C) avant d’induire l’ischémie. Appliquez une pince vasculaire non traumatique à travers l’artère rénale et la veine en faisceau en faisceaux.
REMARQUE : Assurez-vous que les vaisseaux sont centrés dans les mâchoires de la serre et comprimés avec une pression constante. Appliquez la serre à un endroit uniforme sur le hilum. Orientez la pince perpendiculairement à l’axe du récipient. Cette pince particulière peut être réutilisée pour environ 10 procédures animales. - Tirez la peau pour recouvrir le rein afin de la garder aussi proche que possible de la température corporelle centrale.
- Maintenez la température corporelle centrale à 36,8-37,2 °C pendant l’ischémie en réglant la pompe à chaleur à 38-39 °C (ajustez si besoin) et en allumant/éteignant la lampe infrarouge pour maintenir la température corporelle cible (ajustez la distance de la lampe si besoin).
REMARQUE : Ce système de chauffage « sandwich », composé d’un coussin chauffant circulant l’eau et d’une lampe infrarouge, maintient efficacement la température corporelle centrale dans la plage étroite de 36,8 à 37,2 °C. Notez la température corporelle centrale chaque minute pour vous assurer qu’elle est maintenue entre 36,8 et 37,2 °C. - Après 30 minutes de période ischémique, retirez la pince et remettez le rein à l’aide d’un coton dans la cavité abdominale.
REMARQUE : Confirmez que l’ensemble du rein semble uniformément pâle avant le déclampage. Après avoir retiré la serre, confirmez la réperfusion réussie. Si la reperfusion est fortement retardée, par exemple 30 secondes ou plus, cela peut indiquer une réperfusion incomplète, et l’exclusion de l’animal des analyses ultérieures doit être envisagée. La susceptibilité à l’IRI rénale et la gravité subséquente de la MRC sont significativement influencées par l’âge, le sexe et la tension de fond. La réalisation d’une expérience pilote pour déterminer la durée optimale de l’ischémie est essentielle pour chaque conception d’étude. - Fermez la couche musculaire avec des points absorbables 5-0 puis la peau avec des clips de plaie (par exemple, 9 mm).
REMARQUE : Retirez les clips de plaie 10 jours après l’opération. - Arrêtez l’anesthésie à l’isoflurane et laissez la souris récupérer dans une cage propre. Si l’animal s’est remis de l’anesthésie et ne montre aucun signe de détresse ou d’hypothermie, ramenez la cage dans la salle d’entretien. Les animaux sont surveillés pour détecter douleur ou inconfort après l’opération, et des doses supplémentaires d’Ethiqa XR sont administrées selon les besoins. Des critères d’évaluation humains sont établis selon les directives institutionnelles de l’IACUC afin de minimiser la détresse animale.
REMARQUE : Ethiqa XR fournit des analgésies jusqu’à 3 jours. Administrez une dose supplémentaire si les animaux présentent des signes de douleur ou d’inconfort 72 heures après la dose initiale.
3. Néphrectomie controlatérale
- Suivez l’étape 1, les étapes de préparation des animaux.
- Effectuez une incision cutanée comme décrit aux étapes 2.1 et 2.2.
- Au niveau où l’on visualise le rein droit, à environ 1 cm latéral de la colonne vertébrale du côté droit, effectuer une incision musculaire longitudinale de 1 à 1,5 cm.
- En tenant le rein avec des pinces non dentelées, disséquez brutalement la graisse périhilaire et le tissu conjonctif pour exposer le pédicule rénal.
- Séparez soigneusement la glande surrénale du rein, en laissant la glande surrénale intacte et en évitant de lésions à ses vaisseaux.
- Ligate le pédicule rénal avec une pince de ligature (taille du clip : petite) et des sutures de soie 4-0, puis transsecte les vaisseaux du côté rénal. Ensuite, transpercez l’uretère et retirez le rein.
- Fermez l’incision comme décrit à l’étape 2.11.
4. Collecte de sang et de tissu rénal
- Induire l’anesthésie chez la souris avec de l’isoflurane (1,5 %-2 % en oxygène, 1-2 L/min) et confirmer la profondeur de l’anesthésie par pincement d’orteil pour vérifier la perte des réflexes.
- Placez la souris en position couchée, puis faites une incision médiane et retirez le diaphragme.
- Exposez soigneusement le cœur et insérez une aiguille 23-G fixée à une seringue de 3 mL dans le ventricule gauche.
- Prélève le sang lentement (600-1 000 μL).
- Retirez l’aiguille pour prévenir l’hémolyse et transférez le sang dans le tube de prélèvement.
- Retirez le rein gauche et coupez-le à l’aide d’un scalpel (lame montée sur un manche) selon les exigences de l’étude.
- Pratiquez l’euthanasie en retirant le cœur sous anesthésie (selon les protocoles approuvés par l’institution).
- Traiter les tissus sectionnés selon les exigences de l’étude (par exemple, fixation, brusquement congélation).
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Résultats
Le changement caractéristique de la couleur rénale observé lors de l’opération a confirmé l’induction d’une ischémie rénale uniforme suivie d’une réperfusion réussie. Une ischémie réussie est indiquée par un changement de la couleur du rein, passant du noir au violet foncé, avec une amélioration ultérieure après le retrait d’une pince vasculaire, confirmant la reperfusion. Si l’ischémie rénale n’est pas induite avec succès, le rein ne présente que des changements de couleur minimes, et l...
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Discussion
Ce protocole fournit un modèle reproductible induit par IRI renale de la transition de l’IRC vers la MRC, caractérisée par une dysfonction rénale soutenue et une fibrose interstitielle progressive, largement considérées comme les caractéristiques de laMRC 17,18. L’obstruction utérale unilatérale (UUO) est un modèle largement utilisé de la MRC, qui induit une néphropathie obstructive et provoque principalement la fibrose via <...
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Remerciements
Ce travail a été soutenu par le NIDDK K01-DK133635 ; Distinction UPMC VMI P3HVB ; Prix de la Fondation Samuel et Emma Winters ; Subvention de démarrage UPMC CHP RAC ; Prix des subventionnaires de la Fondation UPMC CHP ; Programme d’opportunités de l’Alliance des ressources sur les reins George M. O’Brien (OKRA OPP) (vers TC), NIDDK R01-DK121758 ; DK134346 ; R25-DK119180 (vers SSL), NIDDK R01-DK125015 ; R01-DK137410 (à JH), et Carolyn et Mark Snyder et la famille Snyder (à JH et SSL). Nous remercions le laboratoire central d’histologie UPMC CHP pour son aide en histologie et imagerie scannée, ainsi que les laboratoires de diagnostic vétérinaire de l’Université d’État du Kansas pour leur soutien en chimie sérique.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Filtre à gaz d’anesthésie | A.M. Bickford & nbsp ; | F-AIR | |
| Chambre d’induction d’anesthésie, chauffage | Produits du laboratoire AIMS | WCS8 | |
| Tube de collecte de sang | BD Microtainer | 365967 | |
| Éthanol | Laboratoires de décontamination | 2701 | |
| Ethiqa XR (buprénorphine à libération prolongée) | Santé animale Fidelis | NDC 86084-100-30 | |
| Pommade oculaire | AKORN | NDC 17478-062-35 | |
| Compresses en gaze, stériles & nbsp ; | Dynarex | 3353 | |
| Tondeuse à cheveux pour petits animaux | WAHL | CLP-9868 | |
| Lampe chauffante, infrarouge | Physitemp Instruments | HL-1 | |
| Pompe à chaleur pour la circulation de l’eau chaude | BrainTree Scientific | HTP-1500 | |
| Système de chaleur/anesthésie pour petits animaux, Versaflex ; | BrainTree Scientific | EZ-7150 | |
| Rideaux chirurgicaux rétenants de chaleur | Braintree Scientific | SPDR-MPS | |
| Stérilisateur à billes chaudes | Simon Keller | Steri 250 | |
| Solution d’isoflurane | Covetrus | 29405 | |
| Application de clip de ligature | BEURK | 533140 | |
| Ligature des clips | BEURK | 533837 | |
| Microsonde pour la température rectale ; | Physitemp | RET-3 | |
| Thermomètre à microsonde | Physitemp | BAT-12 | |
| Microscope, optique | Leica | DM2500 | |
| Microscope, scanner à curseur | Leica | Scanner de diapositives Aperio CS2 | |
| Souris (FVB/NJ) | Laboratoire Jackson | 001800 | |
| Aiguille (23G) | BD | 305145 | |
| Povidone iode swabsticks ; | Dynarex | 1201 | |
| Lames de scalpel | Outils scientifiques finement | 10020-00 | |
| Poignée de scalpel | Outils scientifiques finement | 10060-13 | |
| Pinces chirurgicales, non dentelées | Instrument chirurgical Roboz | RS-5228 | |
| Pinces chirurgicales, dentelées | Outils scientifiques finement | 11051-10 | |
| Pinces chirurgicales, dentées | Outils scientifiques finement | 11019-12 | |
| Gants chirurgicaux | CTI | SPGF750 | |
| Ciseaux séparateurs de tissu chirurgical | Outils scientifiques finement | 14072-10 | |
| Suture, acide polyglycolique (PGA)/absorbable ; (5-0) | Dynarex | 9131 | |
| Suture, soie (4-0) | Oasis | MV-683-V | |
| Seringue (3 ml) | BD | 309628 | |
| Rideaux serviettes, stériles & nbsp ; | Dynarex | 4410 | |
| Pince vasculaire en application de pinces | Outils scientifiques finement | 15057-14 | |
| Pince vasculaire, non traumatique & nbsp ; | Outils scientifiques fins ; | 18055-03 | |
| Applicateur de clip de plaisir | Outils scientifiques finement | 12020-09 | |
| Clips de plaie | Outils scientifiques finement | 12022-09 |
Références
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Réimpressions et autorisations
