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Article de méthode

Test MeRIP-qPCR pour détecter les niveaux de modification m6A d’ARN spécifique dans les cellules d’ostéosarcome

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DOI :

10.3791/69880

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30 décembre 2025

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1Longhua Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 2Key Laboratory of Theory and Therapy of Muscles and Bones, Ministry of Education

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Ce protocole fournit une approche détaillée pour évaluer les niveaux de modification de m6Ad’ARN spécifique à l’aide de MeRIP-qPCR.

Résumé

La modification épitranscriptomique de l’ARN joue un rôle crucial dans l’initiation et le développement de divers cancers, parmi lesquels la N 6-méthyladénosine (m6A) est la modification la plus répandue et la plus diversifiée sur le plan fonctionnel. Ici, nous présentons un protocole simplifié et reproductible utilisant MeRIP-qPCR pour évaluer les niveaux de modification de m6Ade certains transcrits dans les cellules d’ostéosarcome. Dans ce test, l’ARN total a été extrait, suivi d’une incubation avec un anticorps spécifique anti-m6Acontre l’ARN immunocapture de la modification m6A. Ensuite, l’ARN a été fragmenté, et l’enrichissement des fragments d’ARN modifiés en m6A a été réalisé à l’aide de billes magnétiques à base de protéine G. L’ARN enrichi était libéré par la digestion de la protéinase K et purifié par des billes liant l’ARN. Enfin, l’ARN a été soumis à la transcription inverse et à la réaction en chaîne quantitative par polymérase (PCR) pour évaluer les niveaux de m6Adans les gènes candidats. Les résultats ont démontré que cette méthode distingue efficacement les différences de méthylation et constitue un outil fiable pour explorer les mécanismes fonctionnels de la modification de la m6Adans les cellules ostéosarcome. En conclusion, MeRIP-qPCR propose une approche simple et très spécifique pour étudier la modification de m6Adans les cellules ostéosarcome. Ce protocole possède un grand potentiel pour élucider les réseaux régulateurs de m6Aet identifier de nouvelles cibles thérapeutiques.

Introduction

Les dernières recherches sur l’épitranscriptome révèlent que la modification de l’ARNN, 6-méthyladenosine (m6A), la méthylation de la position N6 sur l’adénosine, est la modification chimique intrinsèque la plus abondante connue de l’ARNm dans les celluleseucaryotes 1. m6A est impliqué dans un large éventail de processus biologiques, notamment la stabilité de l’ARNm, le splicing, l’exportation nucléaire et l’efficacité de la traduction2. Il est important de noter que les preuves accumulées suggèrent que la dysrégulation de la modification m6Acontribue à l’initiation et au développement de divers cancers, dont l’ostéosarcome, une tumeur osseuse maligne très agressive qui touche principalement les adolescents et les jeunesadultes 3.

L’étude de la modification m6Anécessite des méthodologies robustes et fiables. Plusieurs approches ont été développées pour détecter les niveaux de modification de m6A, notamment m6A dot blot, m6A ELISA et MeRIP-seq. Le test blot de points m6A est simple et économique, mais il souffre d’une sensibilité limitée et d’une quantification médiocre. Il fournit le niveau demodification m 6A de l’ARN total, plutôt que le niveau demodification m 6A d’unARN 4 spécifique. m6A ELISA offre une détection relativement pratique et à haut débit ; cependant, la réactivité croisée et la faible précision restent des préoccupations majeures, et elle manque également de capacité à révéler des modifications spécifiques aux transcriptsou au site 5. MeRIP-seq permet une cartographie à l’échelle du transcriptome de m6A ; cependant, ses exigences en matière d’apport d’ARN important, de résolution relativement faible et de dépendance aux anticorps limitent la précision et la reproductibilitéMeRIP-seq 6. En revanche, MeRIP-qPCR combine immunoprécipitation et PCR quantitative, offrant une sensibilité et une spécificité accrues pour une détection ciblée de m6Asur un ARN7 spécifique. Cette méthode permet une détection sensible et ciblée de l’enrichissement différentiel m6A dans les gènes candidats, ce qui la rend particulièrement adaptée aux études de validation dans la recherche sur le cancer liée au m6A. Cette méthode offre une alternative économique et accessible pour les laboratoires souhaitant étudier les mécanismes de régulation médiés par le m6A.

Ici, nous avons fourni un protocole détaillé (Figure 1) pour évaluer les niveaux de modification m6Ade c-Myc dans les cellules ostéosarcomiques en utilisant MeRIP-qPCR comme exemple. MeRIP-qPCR, s’appuyant sur l’enrichissement par anticorps des fragments d’ARN méthylés, également associé à la transcription inverse et à la PCR quantitative, évalue la présence et l’abondance relative de m6Asur un ARN spécifique. Nous avons démontré que cette approche distinguait efficacement les différences de méthylation de c-Myc et fournissait une plateforme fiable pour étudier le rôle fonctionnel dem6Adans les cellules ostéosarcome. Cette étude met en lumière le potentiel de MeRIP-qPCR comme outil pratique et spécifique pour la recherche sur la modification du m6Adans l’ostéosarcome et prépare le terrain pour identifier de nouvelles cibles thérapeutiques.

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Protocole

1. Préparation de l’ARN

REMARQUE : L’extraction d’ARN est réalisée à l’aide d’un kit d’extraction d’ARN. Travailler dans un cabinet de biosécurité propre lors de la manipulation des cellules et des réactifs ARN. Portez un équipement de protection individuelle approprié (blouse de laboratoire, gants, lunettes de protection). Pré-refroidissez la centrifugeuse à 4 °C avant de démarrer.

  1. Préparez les cellules.
    1. Retirez le milieu de culture de la gamelle de 3,5 cm et lavez doucement les cellules une fois avec du PBS pré-refroidi. Ajoutez un volume approprié de tampon de lyse ARN directement sur la boîte pour lyser complètement les cellules et pipetez doucement pour homogénéiser.
    2. Transférez la suspension de la cellule dans un tube microcentrifuge de 1,5 mL.
    3. Centrifugez à 1000 × g pendant 5 minutes à 4 °C.
      REMARQUE : Assurez-vous que le rotor est équilibré et que le couvercle est bien fermé.
    4. Retirez soigneusement le tube de la microcentrifugeuse après la centrifugation.
    5. Aspirez complètement le surnageant à l’aide d’une pipette de 1 mL sans déranger la pellete au fond.
      REMARQUE : Ne touchez pas à la pellete cellulaire avec la pointe de la pipette.
  2. Cellules de lyse.
    1. Ajoutez 300 μL de tampon de lyse à la pellete cellulaire.
    2. Mélangez soigneusement en inversant le tube 30 fois jusqu’à ce que la solution soit claire et visqueuse, sans amas visibles.
    3. Incubez le tube à température ambiante pendant 2 minutes.
  3. ARN précipité.
    1. Ajoutez 300 μL d’éthanol à 100 % au lysat (volume égal de tampon de lyse).
    2. Pipettez doucement de haut en bas immédiatement (environ 8 à 10 fois) pour bien mélanger.
  4. Effectuez la liaison de colonnes d’ARN.
    1. Placez une colonne de purification d’ARN dans un tube de collecte de 2 mL fourni.
    2. Transférez tout le mélange dans la colonne de purification.
      REMARQUE : Évitez de toucher la membrane blanche au centre.
    3. Fermez le bouchon et la centrifugeuse à 12 000 × g pendant 1 minute.
    4. Jetez le liquide inférieur et tapotez doucement le tube de collecte à l’envers sur du papier absorbant pour éliminer le liquide résiduel.
    5. Remet la colonne de purification dans le tube de collecte.
  5. Laver les impuretés.
    1. Ajoutez 500 μL de tampon de lavage (eau sans nucléase) à la colonne de purification.
      REMARQUE : Évitez de toucher la membrane blanche au centre.
    2. Centrifugez à 12 000 × g pendant 1 minute et jetez le liquide inférieur.
    3. Centrifugez à nouveau à 12 000 × g pendant 1 minute pour éliminer le liquide résiduel.
    4. Transférez la colonne de purification dans un tube propre de microcentrifuge de 1,5 mL.
    5. Ouvrez le bouchon et laissez la colonne reposer 2 minutes à température ambiante.
  6. ARN éluté.
    1. Placez la colonne de purification dans un nouveau tube de microcentrifuge de 1,5 mL.
    2. Ajoutez 25 μL de tampon d’élution directement au centre de la membrane.
    3. Incubez à température ambiante pendant 5 minutes.
    4. Centrifugeuse à 12 000 × g pendant 1 minute pour collecter l’ARN dans le tube inférieur.
    5. Réappliquez l’éluate sur la membrane et centrifugez à nouveau à 12 000 × g pendant 1 minute pour maximiser le rendement.
      REMARQUE : Ajoutez toujours un tampon d’élution directement au centre de la membrane de la colonne. Évitez de l’ajouter à la paroi latérale, car cela peut empêcher la dissolution de l’ARN et réduire considérablement le rendement. De plus, ne percez pas la membrane avec la pointe de la pipette.
  7. Mesurez la concentration d’ARN.
    1. Rincez le port d’échantillon du spectrophotomètre avec 1,5 μL de tampon d’élution.
    2. Utilisez 1,5 μL de tampon d’élution comme blanc. Confirmez que la lecture est proche de zéro.
    3. Chargez 1,5 μL d’échantillon d’ARN et mesurez la concentration.
    4. Évaluer la qualité des échantillons d’ARN à l’aide d’un spectrophotomètre (A260/A280 = 1,8-2,2, A260/A230 = 2,0-2,5) et d’électrophorèse sur gel d’agarose.

2. Immunoprécipitation à ARN méthylé (MeRIP)

  1. Préparation du mélange d’immunocapture
    1. Procurez-vous un nouveau tube PCR de 0,2 mL.
    2. Ajoutez les composants comme indiqué dans le tableau 1 (exemple pour une réaction).
  2. Immunocapture
    1. Fermez bien le bouchon du tube. Placez le tube PCR sur un rotateur ou un shaker roulant.
    2. Incubez à température ambiante pendant 90 minutes.
      REMARQUE : Assurez-vous que la solution est mélangée de façon continue et douce.
  3. Clivage de l’ARN
    1. Après l’incubation, ajoutez 10 μL d’Enfortisseur de Digestion Nucléaire (EMI) et 2 μL de mélange enzymatique de clivage (CEM) dans chaque tube.
    2. Mélangez doucement en pipettant de haut en bas 5 à 6 fois.
    3. Incubez à température ambiante pendant 4 minutes.
    4. Préparation du contrôle de l’ARN d’entrée
      1. Pour assurer la cohérence entre l’immunoprécipitation (IP) et les échantillons d’entrée, traitez une portion d’ARN en parallèle comme contrôle d’entrée.
      2. Transférez 1 μg d’ARN total (10 % d’entrée) de chaque échantillon dans un tube PCR séparé. Ajoutez 20 μL de tampon de capture immuno-immunitaire (ICB), 1,5 μL d’EMI, 1 μL de CEM, et incubez à température ambiante pendant 2 minutes.
  4. Enrichissement magnétique et lavage
    1. Placez le tube PCR sur un support magnétique.
    2. Laissez reposer le tube pendant 2 minutes jusqu’à ce que la solution devienne claire et que les billes soient capturées sur la paroi du tube.
    3. Aspirez soigneusement et jetez le surnageant sans déranger les perles.
    4. Gardez le tube sur un support magnétique et ajoutez 150 μL de tampon de lavage (WB).
    5. Retirez le tube du support magnétique et inclinez-le doucement à l’envers pour resuspendre complètement les billes.
    6. Ramenez le tube sur le support magnétique. Attends 1 à 2 minutes que la solution disparaisse, puis jette le surnageant.
    7. Répétez l’étape du lavage trois fois.
    8. Rincez à nouveau les billes avec 150 μL de tampon de digestion protéique (PDB) en utilisant la même méthode.
  5. Libération et récupération d’ARN enrichi
    1. Préparez la solution de digestion des protéines en mélangeant la protéinase K et la PDB dans un ratio de 1:9. (Pour chaque réaction, préparez 20 μL : 2 μL de protéinase K + 18 μL de PDB).
    2. Retirez le tube du support magnétique après le lavage final.
    3. Ajoutez 20 μL de solution de travail pour la digestion des protéines fraîchement préparée au pellet de billes et mélangez doucement.
    4. Placez le tube PCR dans un thermocycleur et incubez à 55 °C pendant 15 minutes.
    5. Remettez le tube PCR sur le support magnétique. Attends que la solution soit radieuse (environ 2 minutes).
    6. Transférez soigneusement l’intégralité du surnageant (environ 20 μL) dans un nouveau tube PCR de 0,2 mL.
      REMARQUE : L’ARN est désormais dans le surnageant. Jetez les perles.
  6. Purification de l’ARN
    1. Ajoutez 20 μL de solution de purification de l’ARN (RPS) à chaque tube d’échantillonnage, tube témoin négatif et tube d’entrée.
    2. Ajoutez 160 μL d’éthanol à 100 %.
    3. Des billes de liaison d’ARN vortex pour les resuspendre.
    4. Ajoutez 2 μL de billes de liaison à l’ARN en suspension à chaque tube.
    5. Mélangez soigneusement de haut en bas au moins 10 fois.
    6. Incubez à température ambiante pendant 5 minutes pour permettre la liaison à l’ARN.
    7. Placez le tube sur le support magnétique. Attends que la solution soit radieuse (environ 2 minutes).
    8. Jetez soigneusement le surnageant sans déranger les perles.
    9. Gardez le tube sur un support magnétique et ajoutez 150 μL d’éthanol à 90 % fraîchement préparé. Incubez pendant 30 secondes.
    10. Jetez l’éthanol à 90 %. Répétez le lavage à 90 % d’éthanol une fois de plus (deux lavages au total).
    11. Retirez le tube du support magnétique.
    12. Ajoutez 13 μL de tampon Elution aux billes séchées.
    13. Incubez à température ambiante pendant 5 minutes pour éluer de l’ARN.
    14. Remettez le tube sur le support magnétique. Attends que la solution soit radieuse (environ 2 minutes).
    15. Transférez soigneusement l’intégralité du surnageant (environ 13 μL) dans un nouveau tube PCR sans RNase.
    16. Utilisez immédiatement ou stockez l’ARN à -20 °C.

3. RT-qPCR

  1. Transcrire en retour l’ARN enrichi en m6A en ADNc
    1. Utilisez de l’ARN purifié provenantdu groupe m6 A-IP, Input ou IgG pour la transcription inverse.
    2. Mettez en place la réaction de transcription inverse (RT).
      REMARQUE : Assurez une entrée ARN égale dans tous les groupes afin de permettre une comparaison fiable lors de l’analyse qPCR en aval.
  2. Amplification qPCR
    1. Préparez les réactions qPCR en utilisant la chimie verte SYBR. Ajoutez 10 μL de SYBR Green Master Mix (2×), 0,5 μL d’amorce directe (10 μM), 0,5 μL d’amorce inversée (10 μM), 7 μL de ddH2O et 2 μL d’ADNc dans chaque tube, mélangez soigneusement, puis centrifugez brièvement avant de charger dans l’instrument qPCR.
      REMARQUE : Installez trois puits de réplication pour chaque échantillon d’ADNc (Entrée, IgG, m6A-IP). Consultez le tableau 2 pour la liste des amorces.
    2. Exécutez le programme qPCR.
      1. Effectuer les réactions qPCR sur un thermocycleur en temps réel en utilisant le programme suivant : régler la dénaturation initiale à 95 °C pendant 30 s ; exécuter 40 cycles comprenant la dénaturation à 95 °C pendant 15 s, le recuit à 58 °C pendant 10 s, et l’extension à 72 °C pendant 30 s.
      2. Après amplification, effectuer une analyse de la courbe de fusion en réglant la dénaturation à 95 °C pendant 15 s, en refroidissant à 60 °C pendant 1 minute, puis en augmentant progressivement la température à 95 °C à un taux de rampe de 0,5 °C/s avec une acquisition continue de fluorescence afin de confirmer la spécificité des produits amplifiés.
  3. Analyse des données
    1. Analysez les valeurs de Ct des groupes cible et témoin.
    2. Calculez l’enrichissement en utilisant l’une des méthodes suivantes :
      1. Méthodes 1 : % Méthode d’entrée
        %Input = 2[Ct(Input)−Ct(IP)] × DF × 100 %
        REMARQUE : Ct (entrée) et Ct (IP) représentent respectivement les valeurs seuils de cycle des échantillons d’entrée et IP, et le facteur de dilution (DF) est l’inverse de la fraction d’entrée utilisée pour la qPCR (par exemple, si 10 % de l’ARN total a été utilisé comme entrée, alors DF = 10).
      2. Méthodes 2 : Méthode comparative du CT (méthode 2^-ΔΔCt )
        ΔCt échantillon=Ct IP−Ct IgG
        Ct=ΔCttraité−ΔCt contrôle, Fold=2−ΔΔCt.
        REMARQUE : Maintenir les quantités d’ARN apportées, la mise en place de la réaction et l’efficacité de l’amorce cohérentes sur tous les échantillons.

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Résultats

Nous fournissons ici un résultat représentatif de l’analyse MeRIP-qPCR, le niveau demodification m6A de c-Myc dans les cellules hFOB1.19 et 143B. Comme montré à la Figure 2, l’enrichissement de c-Myc avec l’anticorps anti-m6A était significativement plus élevé que le contrôle IgG, qui ne montrait que des niveaux de fond, suggérant que l’anticorps anti-m6A est à la fois efficace et spécifique. Nous avons également observé que ...

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Discussion

MeRIP-qPCR s’est imposé comme un outil précieux pour étudier les modifications de l’ARN m6Aaux applications larges. Il est particulièrement utile pour valider les résultats de séquençage à haut débit et localiser précisément les sites de modification dans des régions spécifiques des gènes cibles lors d’études mécanistiques. De plus, cette méthode peut être facilement mise en œuvre dans la plupart des laboratoires de biologie moléculaire grâce à son coût relativement faible et ...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Cette étude a été soutenue par des subventions de la National Nature Science Foundation (82174408, 82374477, 82474535 et 82205145).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
100 % d’éthanolShanghai Titan Scientific Co., Ltd., Amérique1158566
143BATCC, AmériqueATCC CRL-8303TM
2 et fois ; SYBR Mix QPCR vertBeijing Qihengxing Biotechnology Co., Ltd., ChineFS-Q1002
Denovix DS-11 & nbsp ;DenovixDS-11  ;Spectrophotomètre
Médium DMEMCORPORATION WISENT, Chine319-005-CL
Milieu DMEM/F-12Gibco, Amérique11320033
ÉpiQuik CUT & Kit d’enrichissement ARN RUN m6A (MeRIP)Epigentek, AmériqueP-9018-24
Sérum fœtal bovinCORPORATION WISENT, Chine086-150
hFOB1.19Banque cellulaire de l’Académie chinoise des sciences, ChineGNHu14
Kit de test de méthylation de l’ARN m6AAbcam, Angleterreab185912
Kit de transcription inverse à microARNEZBioscience-EZB, AmériqueA0010CGQ
Système temps réelBIO-RAD, AmériqueCFX96
Kit d’extraction totale d’ARNEZBioscience-EZB, AmériqueB0004DP
TrypLE Express EnzymeGibco, Amérique12604021

Références

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Réimpressions et autorisations

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Test MeRIP-qPCR pour détecter les niveaux de modification m6A d’ARN spécifique dans les cellules d’ostéosarcome
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