Article de méthode

Méthode standardisée pour détecter les nanotubes de tunnel dans les cellules cutanées humaines pour des applications d’ingénierie tissulaire

790 vues

⸱

DOI :

10.3791/69883

⸱

13 janvier 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Savaid Stomatology School, Hangzhou Medical College, 2Engineering Laboratory for Biomaterials and Tissue Regeneration, Ningbo Stomatology Hospital, 3Ningbo Savaid Stomatology and Otolaryngology Medical Institute, Ningbo ENT Hospital, 4Department of Urology, the Affiliated People's Hospital of Ningbo University

Dans cet article

Résumé

Ici, un protocole standardisé pour visualiser les nanotubes de tunnel entre les kératinocytes épidermiques humains et les fibroblastes dermiques en utilisant le marquage par membrane et la F-actine avec imagerie confocale z-stack est présenté, avec une co-coloration α-tubuline optionnelle, permettant la détection reproductible et la caractérisation du cytosquelette pour des applications en ingénierie tissulaire.

Résumé

Les nanotubes tunneliers (TNT) sont de fines conduits intercellulaires à base d’actine qui permettent un transfert longue portée d’organites et de cargaisons de signalisation. Bien que largement rapportées sur plusieurs types cellulaires, leur présence dans les cellules de la peau humaine n’a pas été bien décrite. Cet article décrit un protocole standardisé pour détecter et caractériser les TNT in vitro entre les kératinocytes épidermiques humains et les fibroblastes dermiques. La méthode consiste à préparer une co-culture de cellules primaires, à fixer doucement pour préserver les TNT fragiles, à marquer par membrane avec des agglutinines germinales de blé, à la coloration F-actine avec des phalloïdines, et à imager systématique par pile z par microscopie confocale inversée afin de distinguer les TNT suspendus au-dessus du substrat des filopodies adhérents. L’immunocoloration optionnelle pour la α-tubuline permet d’évaluer l’incorporation des microtubules. Les TNT se définissent par trois caractéristiques : de fines protubérances droites reliant deux cellules ou plus, la présence de F-actine, et la continuité entre paires cellulaires dans des sections optiques sérieuses. Les résultats représentatifs montrent que les TNT relient les paires dermal-dermaliques, épidermiques-épidermiques et dermiques-épidermiques, avec une composition cytosquelettique variable (F-actine seule ou F-actine plus α-tubuline). Les étapes critiques incluent une fixation douce, l’utilisation de réactifs frais et l’acquisition de suffisamment de plans Z pour éviter une mauvaise classification, tandis que les artefacts courants incluent la rupture du TNT et la coloration incomplète. Ensemble, ces étapes optimisées permettent la détection reproductible de TNT dans les systèmes cellulaires cutanés et offrent une base méthodologique pour de futures recherches sur la communication médiée par le TNT en biologie et régénération cutanée.

Introduction

Les nanotubes tunneliers (TNT) sont des canaux à base d’actine à l’échelle nanométrique qui permettent le transfert intercellulaire direct d’organites et de molécules de signalisation. Ils mesurent généralement entre 6 et 100 μm de long et 50 à 500 nm de diamètre, certains atteignant jusqu’à 700 nmd’épaisseur 1. Contrairement aux protubérances membranaires vides, les TNT contiennent des filaments cytosquelettiques, le plus souvent de la F-actine, qui confère une rigidité structurelle et soutient le transport mitochondrial 2,3,4. En culture bidimensionnelle, les TNT sont définis par trois caractéristiques : fines (20 à 700 nm), des protubérances droites suspendues au-dessus du substrat qui relient deux cellules ou plus ; la présence de filaments de F-actine ; et la capacité de transférer des cargaisons.

Depuis leur première identification dans les cellules PC-12 par Rustom et al.5, les TNT ont été étudiés dans plusieurs systèmes, notamment les systèmescardiovasculaire 6,immunitaire 7 etrespiratoire 8, l’épithélium cornéen9, les tumeurs10 et le systèmenerveux 11,12. Ils contribuent à des processus physiologiques et pathologiques tels que la signalisation immunitaire, l’apoptose, le transport de matériaux et l’angiogenèse 13,14,15. Les TNT peuvent médier le transfert longue distance de diverses cargaisons, notamment les mitochondries, le réticule endoplasmique, les acides nucléiques, les ions, et même lesvirus 5,16,17.

La peau est un organe structurellement complexe, l’épiderme et le derme reposant sur une communication constante pour l’homéostasie, la cicatrisation des plaies et la régénération desappendices 18,19,20. Bien que les TNT aient été décrits dans de nombreux tissus, y compris le système immunitaire, le système neuronal et l’épithéliumcornéen 7,9,12, leur présence dans les cellules de la peau humaine n’a pas été rapportée dans la littérature publiée. S’appuyant sur le cadre méthodologique décrit par Sáenz-de-Santa-María et al.21, nous présentons un protocole standardisé et optimisé pour détecter les TNT entre les kératinocytes épidermiques et les fibroblastesdermiques 22, en utilisant une coloration par immunofluorescence combinée à une microscopie confocale inversée.

Comparé aux approches alternatives de détection TNT, ce protocole offre un équilibre pratique entre sensibilité et accessibilité. L’imagerie des cellules vivantes peut capturer la dynamique des TNT mais est limitée par la phototoxicité et la courte durée de vie desTNTs 1,23. La microscopie électronique fournit des détails ultrastructuraux mais ne parvient souvent pas à préserver de longues étendues de TNT et n’est pas pratique pour l’analyse de routine des cellules primairesde la peau 24,25. Les systèmes de nanotubes basés sur des reporters permettent le suivi en temps réel mais nécessitent une manipulation génétique, généralement inefficace dans les kératinocytes primaires et lesfibroblastes 24,26. En revanche, le protocole actuel utilise l’immunofluorescence standard et la microscopie confocale, permettant la détection reproductible de TNT à travers des cultures cellulaires cutanées préparées indépendamment tout en maintenant la compatibilité avec les cellules primaires fragiles.

Cette méthode est particulièrement adaptée à l’analyse d’échantillons fixes où la composition cytosquelettique et la prévalence du TNT sont d’intérêt. Comme les TNT sont très fragiles, les étapes de fixation et de manipulation restent des limites clés, et l’approche ne peut pas capturer la dynamique TNT en temps réel. Néanmoins, pour les laboratoires travaillant avec des cellules humaines primaires, ce flux de travail standardisé offre un moyen accessible et cohérent de visualiser les TNT et soutient des études en aval de leurs fonctions potentielles en ingénierie et régénération tissulaire.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Protocole

Toutes les cellules cutanées utilisées dans cette étude étaient auparavant des cellules primaires congelées, isolées à partir de tissus cutanés humains obtenus comme échantillons de prépuce jetés lors de procédures de circoncision, et ont été complètementdé-définies 22. La collecte d’échantillons de peau humaine a été réalisée au Département d’urologie de l’Hôpital Populaire affilié à l’Université de Ningbo, et le protocole d’étude a été approuvé par le comité d’éthique institutionnel (Protocole n° 2024104 ; date d’approbation : 30 octobre 2024).

1. Identification des TNT dans les kératinocytes épidermiques et fibroblastes dermiques humains, primaires

  1. Préparation de la solution
    1. Préparez la solution fixative 1 (200 μL) en ajoutant 4 % de PFA (100 μL), 2,5 % de glutaraldéhyde (4 μL), 1 M HEPES (40 μL) et 1x PBS (56 μL). Préparez frais et préchauffez à 37 °C avant utilisation.
    2. Préparez la solution fixative 2 (200 μL) en ajoutant 8 % de PFA (100 μL), 1 M HEPES (0,4 μL), 1x PBS (99,6 μL). Préparez frais et préchauffez à 37 °C avant utilisation.
    3. Préparez la solution fixative 3 (200 μL) en ajoutant 8 % de PFA (100 μL), 2,5 % de glutaraldéhyde (4 μL), 1x PBS (96 μL). Préparez frais et préchauffez à 37 °C avant utilisation.
  2. Culture cellulaire
    1. Dégelez et cultivez des kératinocytes épidermiques humains et des fibroblastes dermiques dans des plats de 60 mm en utilisant le milieu de croissance approprié. Compléter les cultures de kératinocytes avec Y-27632 à une concentration finale de 5 μM lors de la réanimation. Maintenir les cultures à 37 °C dans un incubateur humidifié jusqu’à ce que les cellules atteignent une confluence de ~80 %.
    2. Retirez le milieu et lavez brièvement les cellules avec 1 mL de PBS 1x (utilisé pour maintenir le pH physiologique et l’osmolarité pendant le lavage). Aspirez le PBS.
    3. Ajoutez 1 mL de trypsine-EDTA à 0,05 %, répartissez uniformément, puis incubez à 37 °C pendant 1,5 à 2,5 minutes.
    4. Resuspendez doucement les cellules en pipettant. Ajoutez 2 mL de milieu de croissance, transférez dans un tube de 15 mL, puis centrifugez à 200 x g pendant 5 minutes à température ambiante.
    5. Jetez le surnageant et resuspendez la boule dans 1 à 2 mL de médium. Comptez les cellules à l’aide d’un compteur automatique.
    6. Semez 12 000 fibroblastes dermiques ou 20 000 kératinocytes dans chaque puits d’une lame à chambre à 8 puits dans un volume final de 400 μL. Après le semis, secouez bien la chambre pour répartir les cellules uniformément. Incuber pendant ~24 heures à 37 °C.
    7. Après environ 24 heures d’incubation, observez la confluence cellulaire au microscope. Si elle atteint ~80 %, procédez aux étapes de fixation suivantes.
  3. Fixation
    1. Lorsque les cultures atteignent une confluence de ~80 %, ajoutez doucement plusieurs gouttes de solution fixative 1 directement dans le puits de chambre pour préfixer les cellules. Incubez pendant 4 minutes à température ambiante. Assurez-vous que le fixateur se répartit uniformément sans perturber les cellules.
      ATTENTION : Manipulez prudemment pour éviter la perturbation des TNT. Comme les solutions fixatrices contiennent des composants toxiques comme le PFA et le glutaraldéhyde, portez toujours des gants de protection, des vêtements de protection et un masque, et manipulez-les dans une hotte à fumée. Veillez à bien vous laver les mains après. Collectez séparément les déchets fixateurs de PFA et de glutaraldéhyde dans des contenants identifiés pour leur élimination de produits chimiques dangereux.
    2. Aspirez le préfixateur et remplacez-le par 140 μL de solution fixative fraîche 1, en veillant à ce que tout le puits soit couvert. Incubez pendant 15 minutes à 37 °C.
    3. Retirez la solution fixative 1 et ajoutez 140 μL de solution fixative 2. Incubez pendant 15 minutes à 37 °C. Assurez-vous que la solution couvre entièrement les cellules pour maintenir une fixation uniforme.
    4. Retirez le fixateur, puis ajoutez 140 μL de 100 mM de NH₄Cl pour tremper les aldéhydes résiduels. Incubez pendant 10 à 30 minutes à température ambiante.
    5. Rincez les échantillons 3 fois avec 1 PBS pendant 30 secondes chacun à température ambiante, en pipotant doucement le long de la paroi de la chambre pour éviter d’emporter les cellules ou de casser les TNT.
  4. Coloration membranaire et cytosquelettique
    1. Incuber les cellules avec 140 μL de 1:300 (v/v) de WGA (Agglutinine germinale de blé)-Alexa Fluor, qui marque les glycoprotéines de la membrane plasmique pour visualiser les TNT dérivés de la membrane, dans 1x PBS pendant 20 minutes dans l’obscurité à température ambiante.
      REMARQUE : Les étapes suivantes doivent être réalisées dans un environnement sombre.
    2. Laver 3 fois avec 1 PBS (30 s chacun). Incuber avec 140 μL de conjugué de phalloïdine dilué à 1:250 (v/v) dans 1 % de BSA pendant 30 minutes dans l’obscurité à température ambiante.
    3. Laver 3 fois avec 1 PBS (30 s chacun). Incubez avec 140 μL de solution DAPI pendant 5 minutes à température ambiante dans le noir.
    4. Laver 3 fois avec 1× PBS. Ajoutez 2 à 3 gouttes de substrat de montage, faites couver pendant 20 minutes à température ambiante, et conservez au moins 20 minutes à 4 °C dans le noir jusqu’à l’imagerie.
  5. Imagerie
    1. Acquiescez des images à l’aide d’un microscope confocal inversé avec un objectif 40x. Sélectionnez des champs aléatoires et collectez des piles Z (10 à 20 couches) du bas au haut des cellules. Les paramètres spécifiques du microscope utilisés pour l’acquisition d’images sont listés ci-dessous :
      Microscope laser confocal à balayage : ZEISS LSM 900
      Lignes laser : Voie 1 (561 nm, 4,0 %), Piste 2 (488 nm, 16,0 %), Voie 3 (405 nm, 60,0 %)
      Gain du détecteur : 525 V
      Taille du pas Z : 20 sections optiques (profondeur totale : 5,32 μm)

2. Co-culture des cellules épidermiques et dermiques

  1. Préparez les kératinocytes et les fibroblastes comme aux étapes 1.2.1-1.2.5.
  2. Semez 10 000 kératinocytes et 6 000 fibroblastes par puits de chambre dans 400 μL de milieu. Après le semis, secouez bien la chambre pour répartir les cellules uniformément. Couver pendant 24 heures à 37 °C.
  3. Après environ 24 heures d’incubation, observez la confluence cellulaire au microscope. Si elle atteint ~80 %, procédez aux étapes de fixation suivantes.
  4. Fixez et colorez les membranes comme décrit aux étapes 1.3-1.4.
  5. Perméabiliser les cellules avec 0,1 % de Triton X-100, pour permettre l’accès des anticorps aux cibles intracellulaires, pendant 3 minutes à température ambiante, puis laver 3 fois avec 1 PBS.
    REMARQUE : Le Triton X-100 à 0,1 % doit être préparé fraîchement avant utilisation.
    ATTENTION : Le Triton X-100, nuisible à la vie aquatique, doit également être éliminé comme déchets chimiques et jamais versé dans le drain.
  6. Bloquez avec 140 μL de 2 % de BSA dans le PBS pour réduire la liaison des anticorps non spécifiques pendant 20 minutes à température ambiante.
    REMARQUE : 2 % de BSA doivent être préparés fraîchement avant utilisation.
  7. Incubez toute la nuit à 4 °C avec un anticorps anti-cytokératine 5 dilué à 1:200 (v/v) dans un dosage de 2 % de BSA.
  8. Laver 3 fois avec 1 PBS, puis incuber avec un anticorps secondaire conjugué Alexa Fluor 594 pendant 1 à 2 heures à température ambiante dans le noir.
  9. Laver 3 fois avec 1× PBS. Colorez les noyaux avec DAPI et image comme aux étapes 1.4.5-1.5.2.

3. Identification des composants du cytosquelette des TNT

  1. Culture cellulaire
    1. Cultivez et fixez les cellules comme aux étapes 1.2-1.3. Perméabiliser avec du Triton X-100 à 0,1 % pendant 3 minutes à température ambiante, puis laver avec 1x PBS.
    2. Bloc avec 2 % de BSA pendant 20 minutes à température ambiante. Incubez toute la nuit à 4 °C avec un anticorps anti-α-tubuline.
    3. Laver 3 fois avec 1 PBS et incuber avec un anticorps secondaire conjugué à Alexa Fluor pendant 1 à 2 heures à température ambiante dans le noir.
      REMARQUE : Les étapes suivantes doivent être réalisées dans un environnement sombre.
    4. Laver 3 fois avec 1x PBS. Étiquetez la F-actine avec de la phalloïdine et l’image comme aux étapes 1.4.3-1.5
  2. Co-culture des cellules
    1. Préparez les co-cultures comme dans les étapes 2.1-2.2. Corrigez avec une solution fixative 3 pendant 15 minutes à température ambiante.
    2. Remplacez par 140 μL de 100 mM de NH4Cl et faites éclore pendant 10 à 30 minutes à température ambiante. Laver 3 fois avec 1x PBS.
    3. D’abord, identifier les cellules épidermiques en effectuant la perméabilisation, le blocage et l’immunocoloration CK5 exactement comme décrit aux étapes 2.4-2.8.
    4. Ensuite, effectuez une immunocoloration α-tubuline en suivant les étapes 3.1.2-3.1.4.
    5. Enfin, colorez la F-actine avec de la phalloïdine et procédez à l’imagerie comme décrit aux étapes 1.4.2-1.5.2.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Résultats

Grâce à ce protocole standardisé, des nanotubes tunneliers (TNT) ont été identifiés avec succès dans des cellules de peau humaine, tant en culture unique qu’en co-culture. Pour valider la spécificité des anticorps, des colorations témoins positives et négatives ont été effectuées pour tous les anticorps avant les analyses expérimentales, comme le montrent les figures supplémentaires 1, 2 supplémentaires, 3 et 4 supplémentaires. Des images représentatives...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Discussion

Une étape cruciale de ce protocole est la préservation des TNT lors de la fixation et de la coloration, car ces structures sont extrêmement fragiles et facilement perturbables. Une manipulation douce lors de la fixation, un timing approprié et l’utilisation de fixateurs frais sont essentiels pour maintenir l’intégrité du TNT. L’utilisation de l’imagerie confocale Z-stack est tout aussi importante pour distinguer les TNT suspendus au-dessus du substrat des filopodies ou autres protubéranc...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun intérêt financier concurrent à déclarer.

Remerciements

Ce projet a été financé par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (Subvention n° 82273554). Les auteurs reconnaissent le laboratoire d’ingénierie des biomatériaux et de la régénération tissulaire de l’hôpital de stomatologie de Ningbo pour son soutien continu et remercient les membres actuels et anciens de l’équipe pour leurs précieuses discussions. Les auteurs remercient également l’enseignant Feng Li du Centre de recherche et d’expérimentation du Collège médical de Hangzhou pour son aide généreuse et son soutien solide facilitant l’accès au microscope confocal.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Tube de 15 mLKIRGENKG2611Stérile, sans RNase/Dnase et sans pyrogène
37 & deg ; Incubateur CThermo Scientific51032877L’incubateur à CO2 à 37 degrés offre un environnement in vitro idéal.
Traceur d’actine rouge-RhodamineBeyotimeC2207sLa sonde Red-Rhodamine Actin-Tracker est une phalloïdine marquée avec le colorant fluorescent Rhodamine, avec une longueur d’onde d’excitation maximale de 540 nm et une longueur d’onde d’émission maximale de 565 nm.
Conjugué Alexa Fluor de l’agglutinine germinale du blé (WGA)Sondes moléculairesW11261  ; Alexa Fluor 488 Conjugué
Anticorps anti-alpha tubulineAbcamab7291L’anticorps anti-alpha tubuline - Loading Control (ab7291) est un anticorps monoclonal de souris détectant l’alpha tubuline. Adapté aux humains, souris, rats.
Anticorps anti-cytokératine 5   ;Abcamab52635Anticorps anti-cytokératine 5 - Marqueur du cytosquelette (ab52635) est un anticorps monoclonal de lapin détectant la cytokératine 5. Adapté aux humains, souris, rats.
Aqua-Poly/MountPolysciences18606Milieu de montage soluble dans l’eau et non fluorescent, formulé pour monter des sections à partir de solutions aqueuses. Utile pour les techniques immunofluorescentes car elles améliorent et conservent les colorations fluorescentes.
Compteur automatique de cellulesCountstarIC1000Compteur de cellules automatisé pour un comptage rapide et précis
Centrifugeuse de laboratoireBIORIDGETD5Centrifugeuse de laboratoire pour une séparation rapide et efficace des échantillons en laboratoire
Armoire de sécurité biologiqueThermo Scientific1379L’Armoire de Sécurité Biologique est un dispositif de confinement stérile qui protège les opérateurs, les échantillons et les environnements contre les risques biologiques en filtrant les agents pathogènes en suspension dans l’air et en empêchant la contamination croisée lors des travaux microbiologiques.
Albumine sérique bovine (BSA)YOBIBIOU5010-10gL’AESB est une globuline contenue dans le sérum bovin contenant 583 résidus d’acides aminés avec un poids moléculaire de 66,430 kDa et un point isoélectrique de 4,7
Plat de culture cellulaire (60X15 mm)eppendorf30701119Traitement en culture tissulaire stérile, exempt de pyrogènes détectables, RNase et DNase, ADN.
Chambre Cellvis Slide-8CellvisC8-1.5H-NConçu pour l’imagerie haute résolution telle que la microscopie confocale.
Solution de coloration DAPIBeyotimeC1006-10 mLLa solution de coloration DAPI convient à la coloration nucléaire de toutes les cellules et tissus courants.
IgG Anti-Souris Chèvre & H & L (Alexa Fluor 405)  ;Abcamab175660IgG Anti-Souris Chèvre & H & L (Alexa Fluor 405) est un anticorps secondaire avec une longueur d’onde d’absorption maximale de 401 nm et une longueur d’onde d’émission maximale de 421 nm.
IgG Anti-Lapin de Chèvre & L conjugué à Alexa Fluor 405Abcamab175652IgG Anti-Lapin de Chèvre & L (Alexa Fluor 405) est un anticorps secondaire avec une longueur d’onde d’absorption maximale de 401 nm et une longueur d’onde d’émission maximale de 421 nm.
IgG Anti-Lapin de Chèvre & L conjugué à Alexa Fluor 594AbcamAB150080IgG H et IgG anti-lapins des chèvres L (Alexa Fluor 594) est un anticorps secondaire avec une longueur d’onde d’absorption maximale de 590 nm et une longueur d’onde d’émission maximale de 617 nm.
Microscope à fluorescence confocale inverséeLeicaTCS SP8 XLe microscope confocal à balayage laser Leica SP8 X offre une imagerie à haute résolution inégalée grâce à une détection de fluorescence avancée et des capacités d’analyse de cellules vivantes.
Microscope à fluorescence confocale inverséeAndorBC43L’Andor BC43 est un microscope confocal compact et à haute vitesse, offrant une imagerie 10 fois plus rapide que les systèmes traditionnels, avec une capacité d’imagerie 2D/3D en un clic
NH4Cl  ;MedChemExpressHY-Y1269  ;Le chlorure d’ammonium comme composé polaire pour réguler le pH.
Conjugués de phaloïdines OregonTM488Technologies de vieO7466Couleur : Vert. Plage de longueurs d’onde d’excitation : 496/520.
Solution physiologique tamponnée au phosphate (PBS)Viva Cell BiosciencesC3582-0500Sa fonction est de maintenir le pH du milieu dans la plage physiologique et de maintenir l’équilibre de la pression osmotique à l’intérieur et à l’extérieur de la cellule.
Triton-X 100SolarbioT8200-100mlC’est un tensioactif non ionique polyvalent utilisé pour restaurer les composants de la membrane dans des conditions de dénaturation douces.
Solution Trypsine-EDTAGIBCO25300054En raison de sa force digestive, la trypsine est largement utilisée pour la dissociation cellulaire, le passage de culture cellulaire de routine et la dissociation tissulaire primaire.
Y-27632MedChemExpressHY-10071Y-27632 est un inhibiteur ATP-compétitif actif par voie orale de ROCK-I et ROCK-II

Références

  1. Austefjord, M. W., Gerdes, H. H., Wang, X. Tunneling nanotubes: Diversity in morphology and structure. Commun Integr Biol. 7 (1), e27934(2014).
  2. Liu, Z., Sun, Y., Qi, Z., Cao, L., Ding, S. Mitochondrial transfer/transplantation: an emerging therapeutic approach for multiple diseases. Cell Biosci. 12 (1), 66(2022).
  3. Yang, F., et al. Tunneling Nanotube-Mediated Mitochondrial Transfer Rescues Nucleus Pulposus Cells from Mitochondrial Dysfunction and Apoptosis. Oxid Med Cell Longev. 2022, 3613319(2022).
  4. Yang, C., et al. Mitochondria transfer from early stages of erythroblasts to their macrophage niche via tunnelling nanotubes. Br J Haematol. 193 (6), 1260-1274 (2021).
  5. Rustom, A., Saffrich, R., Markovic, I., Walther, P., Gerdes, H. H. Nanotubular highways for intercellular organelle transport. Science. 303 (5660), 1007-1010 (2004).
  6. Alarcon-Martinez, L., et al. Pericyte dysfunction and loss of interpericyte tunneling nanotubes promote neurovascular deficits in glaucoma. Proc Natl Acad Sci U S A. 119 (7), 2110329119(2022).
  7. Zhu, C., Shi, Y., You, J. Immune Cell Connection by Tunneling Nanotubes: The Impact of Intercellular Cross-Talk on the Immune Response and Its Therapeutic Applications. Mol Pharm. 18 (3), 772-786 (2021).
  8. Zhang, F., et al. TFAM-Mediated mitochondrial transfer of MSCs improved the permeability barrier in sepsis-associated acute lung injury. Apoptosis. 28 (7-8), 1048-1059 (2023).
  9. Jiang, D., et al. Mitochondrial transfer of mesenchymal stem cells effectively protects corneal epithelial cells from mitochondrial damage. Cell Death Dis. 7 (11), e2467(2016).
  10. Zheng, Y., et al. Tunneling nanotubes mediate KRas transport: Inducing tumor heterogeneity and altering cellular membrane mechanical properties. Acta Biomater. 185, 312-322 (2024).
  11. Dilsizoglu Senol, A., et al. α-Synuclein fibrils subvert lysosome structure and function for the propagation of protein misfolding between cells through tunneling nanotubes. PLoS Biol. 19 (7), e3001287(2021).
  12. Scheiblich, H., et al. Microglia rescue neurons from aggregate-induced neuronal dysfunction and death through tunneling nanotubes. Neuron. 112 (18), 3106-3125.e8 (2024).
  13. Solimando, A. G., et al. Tunneling nanotubes between bone marrow stromal cells support transmitophagy and resistance to apoptosis in myeloma. Blood Cancer J. 15 (1), 3(2025).
  14. Korenkova, O., et al. Tunneling nanotubes enable intercellular transfer in zebrafish embryos. Dev Cell. 60 (4), 524-534 (2025).
  15. Ma, L., et al. Dynamic three-dimensional culture enhances tunneling nanotubes-mediated mitochondrial transfer in mesenchymal stromal cells to accelerate wound healing. J Nanobiotechnol. 23 (1), 559(2025).
  16. Sahinbegovic, H., et al. Intercellular Mitochondrial Transfer in the Tumor Microenvironment. Cancers (Basel). 12 (7), 12071787(2020).
  17. Gurke, S., Barroso, J. F., Gerdes, H. H. The art of cellular communication: tunneling nanotubes bridge the divide. Histochem Cell Biol. 129 (5), 539-550 (2008).
  18. Kobielak, K., Pasolli, H. A., Alonso, L., Polak, L., Fuchs, E. Defining BMP functions in the hair follicle by conditional ablation of BMP receptor IA. J Cell Biol. 163 (3), 609-623 (2003).
  19. Nowak, J. A., Polak, L., Pasolli, H. A., Fuchs, E. Hair follicle stem cells are specified and function in early skin morphogenesis. Cell Stem Cell. 3 (1), 33-43 (2008).
  20. Woo, W. M., Zhen, H. H., Oro, A. E. Shh maintains dermal papilla identity and hair morphogenesis via a Noggin-Shh regulatory loop. Genes Dev. 26 (11), 1235-1246 (2012).
  21. Sáenz-de-Santa-María, I., Henderson, J. M., Pepe, A., Zurzolo, C. Identification and Characterization of Tunneling Nanotubes for Intercellular Trafficking. Curr Protoc. 3 (11), e939(2023).
  22. Liu, Z., et al. A Simplified and Efficient Method to Isolate Primary Human Keratinocytes from Adult Skin Tissue. J Vis Exp. (138), e57784(2018).
  23. Dupont, M., Souriant, S., Lugo-Villarino, G., Maridonneau-Parini, I., Vérollet, C. Tunneling Nanotubes: Intimate Communication between Myeloid Cells. Front Immunol. 9, 43(2018).
  24. Gerdes, H. H., Rustom, A., Wang, X. Tunneling nanotubes, an emerging intercellular communication route in development. Mech Dev. 130 (6-8), 381-387 (2013).
  25. Sartori-Rupp, A., et al. Correlative cryo-electron microscopy reveals the structure of TNTs in neuronal cells. Nat Commun. 10 (1), 342(2019).
  26. Dagar, S., Pathak, D., Oza, H. V., Mylavarapu, S. V. S. Tunneling nanotubes and related structures: molecular mechanisms of formation and function. Biochem J. 478 (22), 3977-3998 (2021).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Réimpressions et autorisations

Demander l’autorisation de réutiliser le texte ou les figures de cet article JoVE

Demander une autorisation

Mots-clés

Coculture de k ratinocytes et de fibroblastesmarquage de l actine Fagglutinine du germe de blmicroscopie confocalefixation douceimmunomarquage de l alpha tubulinecommunication entre les cellules cutan es

Articles connexes