Effets thérapeutiques des granules antispasmodiques de Gualou Guizhi sur la spasticité et la panoptose dans un modèle rat de lésions de la moelle épinière

Résumé

Cette étude évalue les effets des granules antispasmodiques Gualou Guizhi (GLGZ) sur la spasticité induite par une lésion de la moelle épinière (LME) à l’aide de méthodes comportementales, biomécaniques, d’imagerie et histologiques, et explore les mécanismes liés à la PANoptose.

Résumé

La spasticité musculaire après une lésion de la moelle épinière (LME) affecte gravement la qualité de vie, avec des traitements efficaces limités. Les granules antispasmodiques Gualou Guizhi (GLGZ), une formulation de médecine traditionnelle chinoise (MTC) développée par l’hôpital, peuvent soulager les spasmes. Cette étude visait à évaluer l’efficacité du GLGZ dans la spasticité induite par les LME et son association avec la panoptose (une nouvelle mort cellulaire programmée impliquant l’apoptose, la nécroptose et la pyroptose).

Des rats mâles de Sprague-Dawley pesant entre 180 et 200 g ont été utilisés. L’EMEL a été induite par la méthode de la chute de poids d’Allen. Les rats modèles réussis ont été assignés au hasard à un groupe modèle ou à l’un des groupes de dose GLGZ : élevé, moyen ou faible. Les rats fictifs ont subi une laminectomie sans lésion de la moelle épinière. Les interventions ont duré 4 semaines. Après l’intervention, la fonction motrice des membres a été évaluée à l’aide de l’échelle de Basso-Beattie-Bresnahan (BBB). La raideur du muscle fémoral a été évaluée par élastographie par ondes de cisaillement par échographie (SWE), tandis que l’intégrité de la moelle épinière a été déterminée par imagerie par résonance magnétique (IRM). Des colorations hématoxyline-éosine (HE), Nissl et Luxol en bleu rapide ont été réalisées pour observer des altérations histopathologiques. La coloration par immunofluorescence multiplex a été utilisée pour marquer la protéine en forme de particules associée à l’apoptose contenant un CARD (ASC, vert), une Caspase-8 (orange) et la kinase sérine/protéine thréonine interagissant récepteur 3 (RIPK3, jaune) afin d’évaluer la PANoptose.

GLGZ a amélioré les scores BBB selon la dose : sham (21,00 ± 0,00), modèle (5,8 ± 1,1), haute dose (10,6 ± 1,3), moyenne dose (8,5 ± 1,2), faible dose (7,1 ± 1,0). Le SWE a montré une raideur musculaire réduite : modèle (6,68 ± 0,74 m/s), dose élevée (2,19 ± 0,36 m/s, P < 0,001), dose moyenne (3,04 ± 0,45 m/s, P = 0,002), faible dose (4,08 ± 0,65 m/s, P = 0,031) par rapport au modèle. Comparé au groupe modèle (3,65 ± 1,03 mm²), GLGZ a réduit de façon dépendante de la dose la taille des lésions de la moelle épinière dans tous les groupes de dosage (tous P < 0,05), (1,33 ± 0,79 mm² à forte dose, 1,94 ± 0,67 mm² à dose moyenne, 2,50 ± 0,79 mm² à faible dose. L’histologie a révélé que le GLGZ préservait les neurones et favorisait la réparation de la myéline. GLGZ a réduit de façon dépendante de la dose l’ASC, la Caspase-8 et l’expression de RIPK3.

Introduction

Le spasme musculaire est une complication fréquente des lésions de la moelle épinière (LME), affectant gravement la qualité de vie des patients. Son processus pathologique comprend une lésion mécanique initiale, une inflammation secondaire, le stress oxydatif, l’apoptose et une régénération nerveuse altérée, entre autres ^1,2. Les traitements actuels (décompression chirurgicale, pharmacothérapie, rééducation) ont une efficacité limitée, les médicaments à long terme provoquant des effets secondaires comme^{la résistance aux médicaments 3}. Par conséquent, il est essentiel d’explorer de nouveaux mécanismes et traitements.

Des études récentes ont identifié la panoptose, une mort cellulaire programmée qui intègre l’apoptose (dépendante de la caspase), la nécroptose (dépendante de RIPK3/MLKL) et la pyroptose (dépendante de la caspase-8/GSDMD)⁴ comme un mécanisme pathologique clé de la lésion secondaire dans les LME. Une activation anormale de (ASC, caspase-8 et RIPK3) induit une perte neuronale et la formation de cicatrices gliales, aggravant la spasticité⁵. Cibler la panoptose s’est ainsi imposé comme une stratégie prometteuse pour interrompre la cascade de blessures secondaires^{de LME 4}.

La médecine traditionnelle chinoise (MTC) a attiré l’attention pour les maladies neurologiques en raison d’effets multi-cibles (par exemple, anti-inflammatoires, stress antioxydant)⁶. Les granules antispasmodiques Gualou Guizhi (GLGZ) sont dérivés du Synopsis of the Golden Chamber de Zhang Zhongjing et optimisés comme préparation^{hospitalière 7}. Ses composants comprennent Trichosanthes kirilowii (Tianhuafen), Cinnamomum cassia (Guizhi), Paeonia lactiflora (Baishao), Glycyrrhiza uralensis (Gancao), jujube et^{ginger 8}. Des études préliminaires ont montré que le GLGZ soulage les spasmes après une lésion du système nerveux central en régulant les neurotransmetteurs et en inhibant l’inflammation⁹. Cependant, ses effets sur la spasticité induite par la LME et son association potentielle avec la PANoptose restent incertains.

Contrairement aux médicaments conventionnels à cible unique, la nature multicomposante du GLGZ s’inscrit dans le réseau pathologique complexe de la LME — traitant simultanément inflammation, perte neuronale, dommages à la myéline et potentiellement la panoptose. Cette étude émet l’hypothèse que le GLGZ atténue la spasticité musculaire chez les rats LME en favorisant la réparation pathologique de la moelle épinière (réduction de l’inflammation, préservation des neurones, réparation de la myéline) et en inhibant la panoptose. En vérifiant cette hypothèse, nous visons à fournir des preuves expérimentales que le GLGZ est une thérapie prometteuse qui intègre le soulagement des symptômes et la réparation pathologique centrale de la LME.

Protocole

Modélisation animale
Cette étude a été approuvée par le comité d’éthique du deuxième hôpital affilié de l’Université de médecine traditionnelle chinoise du Fujian (Approbation n° FJPSPH-IAEC2024114) et menée conformément aux directives de bien-être animal. Les rats mâles de Sprague-Dawley pesant entre 180 et 200 g étaient hébergés dans des conditions contrôlées à 22-26°C et avec une humidité de 40-70 %. L’ICE a été induite par la méthode Allen de perte^{de poids 10} : anesthésie inhalée d’isoflurane à 3-4 %, incision médiane à T10, exposition des segments T9-T11, laminectomie (dure-mère intacte) et impact (pointe de 2 mm, vitesse de 0,5 m/s, profondeur de 1,3 mm, durée de 1 s). Les rats fictifs subissaient une laminectomie sans impact. Critères d’inclusion : score BBB < 8 à 24 heures après l’opération ; Critères d’exclusion : infection, transection de la moelle épinière. Soins postopératoires : analgésie (buprénorphine, 0,1 mg/kg de s.c., tous les 12 heures pendant 3 jours), expression vésicale (tous les 6 heures pendant 1 semaine) et soins stériles des plaies. Les rats modèles réussis ont été assignés aléatoirement à un groupe modèle, et aux groupes GLGZ à haute dose (2,32 g/kg, n = 10), moyenne (1,16 g/kg, n = 10), à faible dose (0,58 g/kg, n = 10).

Analyse de la fonction motrice
La partition de Basso, Beattie et Bresnahan (BBB) a été réalisée à l’aveugle. Les rats ont été observés en champ ouvert pendant 5 minutes, notant les mouvements articulaires des membres postérieurs, leur portée, leur allure et leur coordination.

Élastographie par ondes de cisaillement pour mesurer la raideur du droit fémoral
Un système d’échographie Doppler avec une sonde à réseau linéaire (18L6) a été utilisé. Les rats étaient placés en position couchée latérale (muscles détendus). L’EA était réalisée avec la sonde positionnée à un angle de 90° par rapport au muscle, à une profondeur de 1 à 2 cm. La région d’intérêt (ROI) a été fixée à 0,5 × 0,5 cm, et dix images ont été acquises par mesure. La valeur finale de rigidité représentait la moyenne de trois mesures valides. La vitesse des ondes de cisaillement (SWV) a été enregistrée ; Le contrôle qualité vert indiquait des images^{valides 11}.

Examen IRM
L’IRM a été réalisée à l’aide d’un scanner 7.0T avec une séquence de graisses supprimée pondérée T2 et une bobine spécifique à l’animal. Les paramètres d’acquisition étaient les suivants : temps de répétition (TR) 3 800 ms, temps d’écho (TE) 72 ms, épaisseur de tranche 1 mm, taille du voxel 0,1 × 0,1 × 1 mm, matrice 256 × 256, champ de vision (FOV) 25,6 × 25,6 mm, quatre moyennes de signal et verrouillage respiratoire. La surface de la lésion a été mesurée à l’aide d’un logiciel de traitement d’image.

Coloration histologique
La coloration HE a été réalisée par déparaffinisation séquentielle, réhydratation, coloration à l’hématoxyline pendant 5 minutes, rinçage à l’eau courante, différenciation à 1 % d’acide chlorhydrique-éthanol pendant 30 secondes, coloration à l’éosine pendant 2 minutes, déshydratation, nettoyage et montage. À titre de point de contrôle visuel, des sections colorées montraient des noyaux bleus et un cytoplasme rouge.

La coloration Nissl a été réalisée par déparaffinisation, réhydratation, incubation dans du bleu de toluidine à 0,1 % à 50-60 °C pendant 30 minutes, suivie d’un rinçage à l’eau distillée, de la différenciation de l’éthanol, de la déshydratation, du dégagement et du montage. À titre de contrôle visuel, des corps de Nissl bleu foncé ont été clairement observés dans le groupe simulé.

La coloration Luxol fast blue-cresyl violet a été réalisée par déparaffinisation, réhydratation, incubation dans Luxol fast blue à 60 °C pendant 2 heures, rinçage à 95 % d’éthanol, différenciation dans carbonate de lithium pendant 30 s, suivie d’une différenciation à 70 % d’éthanol, contre-coloration crèsyl violette pendant 10 minutes, déshydratation, déminage et montage. La concentration active de la crèsylle violette était de 0,1 %. À titre de contrôle visuel, une myéline bleu foncé a été observée dans le groupe simulé.

La coloration par immunofluorescence multiplex a été réalisée en commençant par la déparaffinisation, la réhydratation et la récupération d’antigènes à l’aide d’un tampon de citrate (pH 6,0) à 95 °C pendant 20 minutes. Les coupes ont été traitées avec du peroxyde d’hydrogène à 3 % pendant 10 minutes, suivies d’un blocage à 5 % de BSA à 37 °C pendant 1 heure. Les anticorps primaires ont été incubés toute la nuit à 4 °C (ASC : 1:500 ; Caspase-8 : 1:400 ; RIPK3 : 1:500). Après lavage avec PBS-T (0,1 % Tween-20, 3 x 5 min), des sections ont été incubées avec des anticorps secondaires marqués par HRP (1:1000) à 37 °C pendant 1 heure. Un marquage au fluorochrome a ensuite été appliqué : YTR520 Plus pour l’ASC, TYR570 Plus pour Caspase8, et TYR690 Plus pour RIPK3 (30 min), suivi d’une coloration nucléaire DAPI pendant 5 minutes. Des lames étaient montées, et l’imagerie réalisée à l’aide d’un microscope à fluorescence réglé à une exposition de 500 ms, gain de 1,0, grossissement ×200, avec des ensembles de filtres correspondant aux fluorochromes respectifs.

Pour le xylène et l’éthanol, toutes les opérations étaient effectuées dans une hotte de fumée, et des gants et lunettes de protection étaient portés pendant l’utilisation. Pour les réactifs colorants, le contact direct avec la peau était strictement évité. Tous les réactifs de déchets étaient éliminés dans des conteneurs désignés pour déchets dangereux. Pour les matériaux biologiques, une stérilisation complète à l’autoclave a été réalisée avant l’élimination finale afin d’éviter une contamination biologique potentielle.

Analyse statistique
ANOVA unidirectionnelle avec test post-hoc LSD a été utilisée pour les comparaisons de groupes. P < 0,05 était considéré comme statistiquement significatif.

Résultats

Score BBB
Le score BBB du groupe fictif était de 21,00 ± 0,00, nettement supérieur à celui du modèle (5,8 ± 1,1, P < 0,001). Les scores BBB ont augmenté dépendamment de la dose du GLGZ : dose élevée (10,6 ± 1,3, P < 0,001), dose moyenne (8,5 ± 1,2, P = 0,003), faible dose (7,1 ± 1,0, P = 0,028) vs modèle (Figure 1).

Analyse de l’élastographie par ondes de cisaillement de la raideur du droit fémoral

Discussion

Cette étude a évalué de manière systématique les effets améliorateurs du GLGZ sur la spasticité musculaire chez les rats atteints de LME et a exploré sa relation avec la neuroprotection et la PANoptose. Les résultats ont indiqué que GLGZ pouvait améliorer les scores BBB et réduire la raideur musculaire chez les rats LM de manière dépendante de la dose. L’étude a également révélé que le mécanisme d’action du GLGZ pourrait être lié à la neuroprotection, à la réparation de la myéline et à l...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Éthanol anhydre   ;	240403A1  ;		Déshydratation
Éthanol anhydre   ;	241101A1		Coloration
agent de revêtement du film atténué par antifluorescence (contenant DAPI) et nbsp ;	MA0221  ;		; Coloration par immunofluorescence
Anticorps ASC	Bs-6741R		Analyse PANoptose (1:300)
Anticorps de caspase-8	13423-1-AP		Analyse de la PANoptose (1:400)
Microscope à fluorescence   ;	NIKON		ECLIPSECi-L  ;
Scanner numérique de diapositives en verre entièrement automatique	; GCell-60		Scanner à diapositives
Kit hématoxyline-éosine	R23718		Coloration hématoxyline-éosine (HE)
Logiciels d’analyse d’images	NIH		ImageJ 1,53k
Luxol Fast Blue	R23193		Coloration Luxol Fast Blue-Cresyl Violet
Scanner IRM	Bruker		7.0T
Kit de coloration à fluorescence multiple   ;	240522		; Coloration par immunofluorescence
Kit de coloration des myéloïdes	; G3245  ;		Coloration myéloïde   ;
Neutre   ; balsam  ;	; MB9899  ;		Montage après teinture
Kit de teinture Nissl	R23093  ;		Coloration Nissl
Anticorps RIPK3	Bs-3551R		Analyse de la PANoptose (1:400)
SPSS 22.0			logiciel d’analyse statistique & nbsp ;
Rats Sprague-Dawley & nbsp ;	Société de biotechnologie Hangyi à Fuzhou
Acide tartrique, tripolyphosphate de sodium	10019418		Coloration
Système d’échographie	SIEMENS Acuson & nbsp ;		Sonde à réseau linéaire (18L6)
Xylène	240904A2		Coloration