Ce protocole expérimental offre une méthode stable, rentable et efficace qui combine le knockdown de l’ARNnc avec des tests formant des colonies afin de quantifier l’effet de l’ARNnc sur la prolifération cellulaire de l’ostéosarcome.
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Article de méthode
Essai de formation de colonie détectant la capacité proliflective des cellules d’ostéosarcome à élimination d’ARNCn
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Dans cet article
Résumé
Résumé
L’expression aberrante des ARN longs non codants (lncRNA) influence profondément la prolifération cellulaire des cellules ostéosarcome, suggérant qu’ils pourraient servir de cibles thérapeutiques potentielles. Cependant, les études fonctionnelles des ARNnc restent largement théoriques et limitées à quelques validations. Les tests de formation de colonies, qui reflètent spécifiquement le destin final de la prolifération des cellules individuelles, sont considérés comme la référence pour évaluer le potentiel prolifératif à long terme. Ici, ce protocole a établi un protocole expérimental fiable utilisant des tests de formation de colonies dans des cellules à élimination d’ARNnN pour évaluer l’effet de l’ARNnc sur la capacité proliflective des cellules d’ostéosarcome. Ce protocole expérimental fournit un test stable, rentable et efficace pour évaluer les effets régulateurs de l’ARNnc sur la prolifération cellulaire de l’ostéosarcome. Cette approche convient non seulement à la recherche sur les cellules d’ostéosarcome, mais sert également d’outil réalisable pour la capacité proliflective cellulaire régulée par l’ARNnc dans d’autres tumeurs. Cette étude comprenait un protocole de détection détaillé du knockdown de lncRNA et des tests de formation de colonies, avec un exemple du knockdown du gène hôte de petit ARN nucléolaire 6 (SNHG6) dans les cellules ostéosarcoma (143B). Les résultats expérimentaux ont confirmé une suppression efficace de l’expression de SNHG6, accompagnée d’une réduction marquée à la fois du nombre et de la taille des colonies. Ces résultats suggèrent que le SNHG6 est essentiel pour maintenir le potentiel prolifératif à long terme des cellules d’ostéosarcome (143B).
Introduction
Les ARN longs non codants (lncRNA), définis comme des transcrits plus longs que 200 nucléotides sans potentiel codant pour les protéines, sont devenus des régulateurs importants de divers processus biologiques ces dernièresannées 1,2. Ils jouent un rôle crucial dans l’initiation et le développement de divers cancers, notamment l’ostéosarcome, le cancer de la prostate et le cancer dupoumon 3,4,5. Dans l’ostéosarcome, des preuves accumulées suggèrent qu’une expression anormale d’ARN long non codant (ARNnc) a une influence profonde sur la prolifération cellulaire. Par exemple, le silence de l’ARNnc POU3F3 a considérablement supprimé la prolifération et favorisé l’apoptose des cellules ostéosarcomiques (MG63 et U2OS)6. De même, la réduction de l’ARN lncRNA HOXA-AS3 a réduit la formation de colonies et inhibé la croissance dans les cellules U2OS et SW13537. Étant donné que la prolifération incontrôlée est une caractéristique de la biologie du cancer et un facteur déterminant majeur des stratégies thérapeutiques, l’élucidation de la prolifération cellulaire régulée par lncRNA dans les tumeurs, en particulier dans l’ostéosarcome, demeure d’une grande importance et nécessité.
Bien que plusieurs approches existent pour évaluer la prolifération cellulaire, chacune comporte des limites inhérentes. Les tests colorimétriques ou métaboliques, tels que CCK-8 et MTT, sont pratiques, rapides et à haut débit. Cependant, ils fournissent principalement des relevés à court terme et sont facilement confondus par les fluctuations métaboliques, et présentent des risques supplémentaires d’interférences optiques ou photochimiques dues aux réactifsutilisés 8. Les méthodes basées sur la synthèse de l’ADN, y compris l’incorporation de BrdU et d’EdU, offrent une plus grande spécificité tout en se limitant à des analyses instantanées de l’entrée en phase S sans refléter les résultats prolifératifsà long terme 9,10. De même, l’immunocoloration pour des marqueurs de prolifération tels que Ki-67 n’indique qu’une activité instantanée du cycle cellulaire et ne prédit pas la capacitéclonogénique 10. Les systèmes de surveillance en temps réel, tels que RTCA, permettent une analyse continue de la courbe de croissance avec une grande reproductibilité, mais leur coût élevé et leur restriction à l’évaluation à court ou moyen terme réduisent leurpraticité 11. En revanche, le test clonogène capture de manière unique la capacité d’une seule cellule à subir une prolifération illimitée et à former des colonies visibles, reflétant ainsi directement son destin ultime. Bien qu’il soit laborieux et chronophage, le test clonogène reste la référence pour évaluer le potentiel prolifératif à long terme, offrant des informations inaccessibles par des tests à court terme ou parsubstitution.
Ici, cet article inclut un protocole de détection détaillé pour les tests de knockdown de lncRNA et de formation de colonies, avec un exemple de knockdown de SNHG6 dans des cellules d’ostéosarcome 143B. Cette approche est applicable non seulement à la recherche sur l’ostéosarcome, mais sert également d’outil réalisable pour étudier la prolifération médiée par lncRNA dans d’autres tumeurs.
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Protocole
Les réactifs et l’équipement utilisés sont listés dans le tableau des matériaux.
1. Transfection plasmidique
- Semez 5 × 105 cellules 143B par bol de culture de 10 cm (au total deux vases), cultivez les cellules dans un milieu complet (DMEM + FBS à 10 %) à 37 °C dans un incubateur à 5 % de CO2 .
- Préparez les réactifs de transfection 24 heures plus tard, incluant les plasmides (shNC et shSNHG6), PEI et Opti-MEM.
REMARQUE : Vortex et assurez-vous que tout est équilibré à température ambiante avant utilisation. - Retirez quatre tubes microcentrifuges de 1,5 mL, étiquetez les plasmides (shNC et shSNHG6) et PEI (deux tubes) à l’aide d’un stylo marqueur.
- Ajoutez 500 μL d’Opti-MEM à chaque tube.
- Ajoutez 10 μg de plasmides au tube plasmidique (shNC ou shSNHG6) et ajoutez 30 μL de PEI (1 μg/μL) à chaque tube PEI.
- Mélangez doucement de haut en bas, faites couver à température ambiante pendant 5 minutes.
- Mélangez le tube plasmidique et le tube PEI, mélangez doucement, puis faites couver le mélange à température ambiante pendant 20 minutes.
- Retirez 143 cellules B de l’incubateur et aspirez doucement le milieu de culture. Ajoutez 7 mL de médium sans sérum à chaque plat. Étiquetez les antennes pour indiquer les plasmides à ajouter (143B shNC ou 143B shSNHG6).
- Ajoutez le mélange de transfection préparé goutte à goutte dans le plat de culture correspondant.
REMARQUE : Ajoutez le mélange lentement, en utilisant une pipette en mouvement circulaire, et distribuez-le uniformément du bord extérieur vers le centre du plat. Incuber à 37 °C dans un incubateur avec 5 % de CO2. - Jetez le surnageant 8 à 12 heures plus tard, et ajoutez 10 mL de milieu DMEM complet à chaque bol de culture de 10 cm. Incubez les cellules à 37 °C dans un incubateur à 5 % de CO2 .
- Observer au microscope à fluorescence à 72 h après que le surnageant a été rejeté et remplacé par un milieu DMEM complet.
2. Essai de formation de la colonie
- Retirez le milieu de la cuvette de culture de 10 cm (shNC et shSNHG6), ajoutez 1,5 mL de trypsine-EDTA pour digérer les cellules, pipetez doucement pour les détacher, puis ajoutez 5 mL de milieu complet pour terminer la digestion.
- Transférez la suspension de la cellule dans un tube microcentrifuge de 15 mL.
- Retirez 20 μL de suspension cellulaire et comptez les numéros de cellules.
REMARQUE : Le comptage des cellules doit être effectué plusieurs fois afin de garantir que les nombres de cellules dans le groupe shNC et le groupe shSNHG6 sont cohérents. Ici, nous collectons 3 × 10cellules 5 pour la vérification RT-PCR de l’efficacité de détonation du SNHG6. - Semez 2 × 103 cellules par puits dans une plaque à 6 puits. Ajoutez un milieu DMEM complet à un volume final de 2 mL et cultivez les cellules à 37 °C dans un incubateur à 5 % de CO2 .
REMARQUE : Remplacez le substrat par un nouveau médium DMEM complet tous les deux jours. - Surveillez la formation des colonies quotidiennement.
REMARQUE : Interrompez la culture lorsque la plupart des colonies du groupe témoin (shNC) contiennent ≥50 cellules, ou après 10 à 14 jours d’incubation, selon ce qui arrive en premier. - Retirez des cellules de l’incubateur et jetez le surnageant.
- Lavez les cellules deux fois avec 1 mL de PBS par puits, puis jetez le PBS après chaque lavage.
- Fixez les cellules avec 1 mL de solution à 10 % de formol pendant 15 minutes, puis jetez la solution à 10 % de formol.
- Lavez les cellules deux fois avec 1 mL de PBS par puits, puis jetez le PBS après chaque lavage.
- Colorez les cellules avec 1 mL de solution colorante au violet cristallin à 0,5 % pendant 10 à 30 minutes, puis jetez la solution colorante.
- Lavez doucement les cellules avec de l’eau du robinet qui coule lentement.
- Séchez les cellules à température ambiante.
- Capturez des images avec un appareil photo.
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Résultats
Pour évaluer l’effet de l’ARNncRNA6 SNHG6 sur la capacité proliflective des cellules d’ostéosarcome, nous avons mis en place avec succès un système de knockdown médié par plasmides et réalisé des tests de formation de colonies. Le flux de travail expérimental comprenait la transfection plasmidique de cellules 143B et un test de formation de colonies (Figure 1).
L’efficacité de transfection des cellules 143B a été confirmée par mic...
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Discussion
Cibler thérapeutiquement les ARNlnc associés au cancer, en plus de tirer parti de leur utilité diagnostique en tant que biomarqueurs, représente une approche émergente dans la gestion du cancer. Définir le rôle des ARNnc dans la pathogenèse de l’ostéosarcome est crucial pour faire progresser son diagnostic, sa thérapie et son pronostic.
Des étapes cruciales doivent être suivies pour assurer le succès de ce test. Premièrement, établir une suspension unicellulai...
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Ce travail a été soutenu par des subventions de la National Nature Science Foundation (82174408, 82374477, 82474535 et 82205145).
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| 1,5 mL MICROTUBES | Merck | AXYMCT150C | |
| Formaline tamponnée neutre à 10 % | VICTREX | 5205000 | |
| 100 - 1000 &mu ; L Pointes Graduées Bleues Étendues | Shanghai BioScience Co., Ltd | BS10401ML | |
| Laboratoire de vaisselles de culture cellulaire de 100 mm | Wuxi NEST Biotechnology Co., Ltd | 704001 | |
| 143B | ATCC | ATCC CRL-8303TM | |
| Tube centrifuge de 15 mL | Shanghai BioScience Co., Ltd | BL2002150 | |
| Plaque de culture cellulaire à 6 puits | Wuxi NEST Biotechnology Co., Ltd | 703001 | |
| Incubateur CO2 | Thermo Fisher Technology (China)Co., Ltd. | 300583057 | |
| Crystal Violet | TCI Shanghai | C0428 | |
| Médium DMEM | WISENT CORPORATION | 319-005-CL | |
| Eppendorf Research plus | Eppendorf | 3123000233 | |
| FBS - Qualité supérieure | WISENT CORPORATION | 086-150 | |
| Stylo de marque | Zebra Trading (Shenzhen) Co., Ltd. & nbsp ; | YYST5 | |
| Opti-MEM | Gibco | 31985070 | |
| PASTEUR PIPETTE | Labgic | BS-XG-O3L | |
| Tampon PBS (poudre sèche) | Labgic | BL601A | |
| Î.-DU.-É.-É | Polysciences | 24765 | |
| Pointes de pipette | Merck | AXYT200Y | |
| TrypLE Express Enzyme | Gibco | 12604021 | |
| Trypsine/EDTA | Gibco | R001100 |
Références
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- Zhu, J., Mo, Y. Y., Peng, W. X. RNA binding protein-mediated competing endogenous RNA mechanism in cancer. Gene. 963, 149606(2025).
- Zhang, Y., et al. KIAA1429-mediated ZFPM2-AS1 m(6)A modification promotes the proliferation, migration and invasion of osteosarcoma cells. Oncol Lett. 30 (4), 453(2025).
- Oh, M., Kadam, R. N., Charania, Z. S., Somarowthu, S. LncRNA SChLAP1 promotes cancer cell proliferation and invasion via its distinct structural domains and conserved regions. J Mol Biol. 437 (19), 169350(2025).
- Wang, G., et al. TBX5-AS1 induces ER stress and suppresses lung cancer growth and tumor stemness via the miR-494-3p/ATF6 axis. Cell Stress Chaperones. 30 (6), 100113(2025).
- Xu, S., et al. lncRNA POU3F3 promotes osteosarcoma progression through GPX4-modulated ferroptosis by interaction with IGF2BP2 to facilitate NRF2 mRNA stability. Genes Dis. 12 (5), 101439(2025).
- Li, R., et al. LncRNA HOXA-AS3 promotes cell proliferation and invasion via targeting miR-218-5p/FOXP1 axis in osteosarcoma. Sci Rep. 14 (1), 16581(2024).
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- Harris, L., Zalucki, O., Piper, M. BrdU/EdU dual labeling to determine the cell-cycle dynamics of defined cellular subpopulations. J Mol Histol. 49 (3), 229-234 (2018).
- Romar, G. A., Kupper, T. S., Divito, S. J. Research techniques made simple: Techniques to assess cell proliferation. J Invest Dermatol. 136 (1), e1-e7 (2016).
- Stefanowicz-Hajduk, J., Ochocka, J. R. Real-time cell analysis system in cytotoxicity applications: Usefulness and comparison with tetrazolium salt assays. Toxicol Rep. 7, 335-344 (2020).
- Franken, N. A., Rodermond, H. M., Stap, J., Haveman, J., van Bree, C. Clonogenic assay of cells in vitro. Nat Protoc. 1 (5), 2315-2319 (2006).
- Brix, N., Samaga, D., Belka, C., Zitzelsberger, H., Lauber, K. Analysis of clonogenic growth in vitro. Nat Protoc. 16 (11), 4963-4991 (2021).
- Rajendran, V., Jain, M. V. In vitro tumorigenic assay: Colony forming assay for cancer stem cells. Methods Mol Biol. 1692, 89-95 (2018).
- Guzman, C., Bagga, M., Kaur, A., Westermarck, J., Abankwa, D. ColonyArea: An ImageJ plugin to automatically quantify colony formation in clonogenic assays. PLoS One. 9 (3), e92444(2014).
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Réimpressions et autorisations
