Polyacrylamide ZrOH hydrogels pour l’échantillonnage spatialement résolu des carboxylates exsudés de racines poussant dans le sol

Summary

Dans ce protocole, nous détaillons l’utilisation d’hydrogels d’hydrogels d’hydroxyde de zirconium de polyacrylamide (hydrogels ZrOH) comme méthode non destructive et in situ pour échantillonner des carboxyles exsudés par les racines à partir de racines intactes à différents stades de développement des cultures. Il décrit également une cartographie localisée et une quantification ultérieure de ces carboxylates à l’aide de la chromatographie ionique par spectrométrie de masse (IC-MS).

Abstract

L’échantillonnage et la quantification fiable des exsudats racinaires à partir de racines végétales non perturbées restent difficiles. Nous avons également développé une méthode non destructive pour l’échantillonnage, la cartographie 2D et la quantification de sept carboxylates (aconités, citrates, fumarate, lactate, malate, oxalate, succinate) exsudés à partir de racines cultivées dans des rhizobox. La méthode décrite ici utilise des hydrogels d’hydroxyde de polyacrylamide de zirconium (hydrogels ZrOH) qui absorbent tous les carboxylates testés et peuvent être élués avec une efficacité allant de 95,3 % ± 3,12 % à 111 % ± 1,99 %. Les hydrogels ZrOH ont une grande capacité de liaison pour les carboxylates, jusqu’à 1,82 μmol ^cm-2, selon le pH de la solution et les espèces de carboxylates, une concentration supérieure à celle habituellement disponible dans la rhizosphère. De plus, les carboxylates liés sur les hydrogels ZrOH restent stables et peuvent être stockés pendant plusieurs semaines à 4 °C avant analyse. Pour l’application, les plantes sont cultivées dans des rhizoboîtes remplies de sol qui permettent un accès facile avec un minimum de perturbation du système racinaire. Pour échantillonner les carboxylates libérés par les racines, les hydrogels ZrOH sont appliqués soigneusement sur la région d’intérêt pendant 24 heures. Après récupération des hydrogels ZrOH, ils sont découpés à des fins cartographiques, et les morceaux de gel sont élués pour une analyse carboxylate ultérieure (par exemple, via chromatographie ionique - spectrométrie de masse). Nos résultats indiquent que les hydrogels ZrOH sont efficaces pour capturer et déterminer les concentrations de carboxylates dans la rhizosphère. La nouveauté de cette méthode réside dans sa capacité à échantillonner les exsudats racinaires de racines de plantes cultivées en sol intactes, ainsi que dans la possibilité d’un échantillonnage à résolution temporelle, comparée aux méthodes traditionnelles (approche hybride sol-hydroponique) qui sont souvent destructrices et ne permettent qu’un échantillonnage unique. Surtout, elle permet la génération d’images 2D quantitatives, à haute résolution et à l’échelle millimétrique, facilitant la visualisation de l’exsudation carboxylate le long de l’axe raciculaire et de sa distribution spatiale dans la rhizosphère. De plus, cette méthode facilite l’échantillonnage des exsudats racinaires à différents stades de croissance durant le cycle de croissance.

Introduction

Les racines des plantes exsudent divers composés dans la rhizosphère, façonnant leurs propriétés physiques, chimiques et^{biologiques 1}. Lorsque les plantes sont exposées à des conditions de stress abiotiques et biotiques, l’exsudation des racines est particulièrement déclenchée. Les exsudats radicaux peuvent en effet influencer la disponibilité et la mobilisation des nutriments/métaux, les communautés et l’activité microbiennes, la stabilité des agrégats du sol, ainsi que les défenses des plantes contre les agents pathogènes^{directement ou indirectement 1,2,3}. Parmi les exsudats radicaux les plus importants figurent les carboxyles en raison de leur rôle dans la solubilisation des nutriments (y compris le phosphore (P), le fer (Fe), le cuivre (Cu) et le zinc (Zn)), la tolérance aux métaux lourds et le renforcement des micro-organismes bénéfiques dans la rhizosphère 2,3,4,5.

Notamment, les carboxylates exsudés incluent le citrate, le lactate, l’oxalate, le malate, le succinate et^{le fumarate 6,7,8}. Par exemple, le citrate joue un rôle essentiel dans l’acquisition de P en mobilisant le P lié au Fe ou aux oxydes d’aluminium (Al) (hydr)^{oxydes 7,9}. Cependant, l’échantillonnage et la quantification précis des exsudats racinaires des plantes cultivées en sol reste un défi expérimental, principalement en raison de la difficulté à accéder physiquement aux systèmes racinaires non perturbés du sol et à obtenir des échantillons d’exsudats^{racinaires 10,11}. De plus, les composés exsudés subissent rapidement une dégradation microbienne (en quelques minutes à quelques heures)¹² et s’adsorvent fortement aux surfaces minérales du^sol. Un autre défi dans les études d’exsudation racinaire est de surveiller l’exsudation au fil du temps, car la plupart des méthodes de collecte perturbent les racines ou nécessitent la récolte des plantes cultivées en sol, rendant difficile l’évaluation à nouveau de la même^{racine 1,11}. Par conséquent, un échantillonnage précis, une quantification et un suivi précis des exsudats racinaires nécessitent une technique qui capture la variation spatiale et facilite l’échantillonnage répété lors de la croissance^{des plantes 11}.

Dans la présente étude, nous présentons une méthode non destructive in situ initialement développée pour le citrate par Tiziani et ^al.12, qui a maintenant été affinée et appliquée pour l’échantillonnage, la localisation spatiale précise et la quantification de six carboxylates supplémentaires (aconite, fumarate, lactate, malate, oxalate et succinate) exsudés à partir de racines intactes cultivées dans le sol dans des rhizoboxes. La méthode utilise des hydrogels polyacrylamides à base d’hydroxyde de zirconium (hydrogels ZrOH) pour échantillonner les exsudats^{radicaires 13}. Les hydrogels ZrOH présentent une forte capacité de liaison aux anions (y compris les carboxylates) qui peuvent être facilement^élués 12,13,14. Les hydrogels ZrOH (1) permettent d’échantillonner les carboxylates racinaires des racines des plantes cultivées en sol en plaçant simplement l’hydrogel sur le système racinaire avec une perturbation minimale, (2) offrent une protection efficace des carboxylates liés contre la minéralisation microbienne pendant au moins 6 semaines, (3) la distribution spatiale des carboxylates dans la rhizosphère est préservée lors de la liaison au gel, et (4) permettent une cartographie 2D à l’échelle millimétrique des carboxyles ¹².

Les méthodes existantes pour l’échantillonnage des exsudats racinaires sont classées en techniques à base de sol provenant de plantes cultivées en sol (c’est-à-dire lavage des racines ou hybrides sol-hydroponie, dispositifs collecteurs d’exsudats sol-racine (SOIL-REC), microventouses, papier filtrant/feuilles d’agar, pièges à exsudation et technique RHIZOtest) ou méthodes d’échantillonnage hydroponique des exsudats. Le lavage des racines ou l’approche hybride sol-hydroponie implique un retrait soigneux de la plante entière, un lavage du système racinaire, puis son immersion dans la solution d’échantillonnage pour collecter les exsudats^{radicaux 15}. C’est la méthode la plus utilisée pour échantillonner les exsudats des plantes cultivées en sol en raison de sa simplicité. Cependant, l’extraction des racines présente un risque de perte des poils racinaires et des racines plus fines. De plus, un nettoyage approfondi des racines est nécessaire, ce qui peut endommager les racines, compromettre la qualité et la quantité des exsudats racinaires, et empêcher un échantillonnage à résolution^{temporelle 8,11}. La méthode SOIL-REC consiste à cultiver des plantes dans un système de rhizobox spécialement conçu avec des racines croisant entre deux mailles de nylon poreuses (≤ 30 μm) et à collecter les exsudats racinaires à l’aide d’un outil de collecte d’exsudats^{radicaux 16,17}. Cette approche préserve le système racinaire, minimise la contamination du sol et permet une collecte répétée d’exsudats radicaux. Cependant, il présente une configuration complexe (avec seulement peu de répliquages), une dilution plus élevée des exsudats provenant de volumes plus importants utilisés pour l’échantillonnage, et nécessite encore une optimisation, car sa réplicabilité est difficile, et il existe d’énormes variations entre les répliques⁸.

L’application de petits morceaux de résines, de feuilles de gel d’agar ou de papier filtre capables d’équilibrer avec la solution environnante ou d’adsorber des exsudats sur les segments racinaires d’intérêt de racines intactes accessibles en terre (c’est-à-dire à l’aide de rhizoboboxes ou fenêtres racinaires^)18,19. Cette méthode permet un échantillonnage temporel et une mesure partielle de la composition localisée des exsudats, bien que la résolution spatiale soit faible. En revanche, elle est sensible aux artefacts de minéralisation microbienne et difficile à manipuler. De même, les pièges à exsudats sont utilisés pour échantillonner les exsudats racinaires de segments racinaires individuels, où une seule racine est piégée dans des chambres latérales horizontales, avec des anneaux en plexiglas scellés contenant la solution d’échantillonnage, positionnés^{localement 8}. La méthode est applicable aussi bien aux racines hydroponiques qu’aux racines cultivées en sol et permet un échantillonnage^{localisé 12}. Cependant, de faibles volumes sont collectés, l’échantillonnage à résolution temporelle est presque impossible, et l’isolement des racines individuelles est susceptible de subir un stress mécanique, ce qui pourrait affecter le métabolisme racinaire et l’exsudation⁸. Des microventouses sont utilisées pour collecter la solution de sol dans la rhizosphère, permettant un échantillonnage in situ à partir de racines cultivées^{en sol 20}. Cependant, de petits volumes sont collectés, l’échantillonnage est partiellement résolu dans le temps, et les exsudats sont sujets à l’adsorption et à la dégradation^{microbienne 16}. La technique du test RHIZOtest consiste à cultiver les racines hydroponiquement dans de petits cylindres avec le fond recouvert d’un maillage de nylon de 30 μm, puis à les transférer sur un disque de sol, permettant l’échange de solutés entre la racine et le sol ^8,21,22. Les exsudats sont collectés en immergeant le tapis racinaire dans une solution d’échantillonnage. Cette méthode maintient le contact avec les racines et le sol mais utilise des conditions de croissance artificielles. Elle est limitée aux expériences de courte durée et ne permet pas d’échantillonnage à résolution temporelle. Parmi ces méthodes, seules les résines, feuilles de gel d’agar, papier filtre, pièges d’exsudation et microventouses peuvent être utilisés pour déterminer les motifs d’exsudation spatiales.

Les méthodes d’échantillonnage hydroponique des exsudats englobent l’hydroponie et les techniques semi-hydroponiques. L’hydroponie est une méthode fréquemment utilisée et simple pour collecter les exsudats racinaires, dans laquelle les plantes sont cultivées dans une solution nutritive, qui est ensuite remplacée par une solution d’échantillonnage (H₂O,_{CaSO 4},_{CaCl 2}, micropur) pour obtenir des échantillons d’exsudats^15,23. La méthode est simple et impose un stress mécanique minimal aux racines. Elle est très reproductible et stérile si nécessaire, ce qui augmente la qualité des exsudats racinaires et permet un échantillonnage à résolution^{temporelle 5,16}. Néanmoins, c’est un système hautement artificiel qui peut modifier la physiologie des plantes, la morphologie (par exemple, le développement des poils racinaires) et les processus d’exsudation^{des racines 6,15}. En semi-hydroponie, les plantes sont cultivées sur des perles de verre, du sable ou de la vermiculite avec une solution nutritive en percolation continue, et les exsudats sont collectés dans la solution^{de percolation 8,18}. Cette approche est légèrement moins artificielle comparée à l’hydroponie et permet un échantillonnage temporel. Cependant, le système est presque entièrement saturé en eau et nécessite donc des plantes tolérantes à des conditions partiellement anaérobies.

Comparée aux approches alternatives, la méthode hydrogel ZrOH présente plusieurs avantages. Les hydrogels ZrOH permettent de prélever des exsudats racinaires en culture en sol (proches des conditions naturelles) avec un minimum de perturbation du système racinaire, un échantillonnage déterminé dans le temps durant le cycle de vie de la plante, et une collecte d’exsudats racinaires pendant plus de 24 heures est possible grâce à une dégradation microbienne réduite et à une forte capacité de liaison^{carboxylate 12}. De plus, aucun biocide (par exemple micropur,_{NaN 3}) n’est nécessaire pour prélever ou conserver les hydrogels, qui ont un effet potentiel sur l’instrument analytique à long terme et interfèrent avec l’analyse chimique. Cela s’explique par le fait que les carboxylates sont chimiquement liés à l’hydrogel ZrOH. De plus, les échantillons peuvent être stockés plusieurs semaines à mois avant l’analyse, et de nombreux échantillons peuvent donc être prélevés à partir d’un même ensemble^{expérimental 12}, ce qui peut être attribué aux propriétés antimicrobiennes du Zr dans l’hydrogel^24,25. De plus, les hydrogels ZrOH permettent une cartographie en résolution millimétrique 2D des composés exsudés et autres anions dans la rhizosphère, avec la possibilité d’échantillonner l’ensemble du système^racinaire 12,14,26. Les hydrogels ZrOH occupent moins d’espace de stockage au réfrigérateur (4 °C) comparé aux grands volumes requis par les méthodes classiques, généralement conservées au congélateur (-20 °C). La principale limite est l’habitude de produire des hydrogels ZrOH de haute qualité avec peu ou pas de bulles d’air, ainsi que le fait que les rhizoboboxes restent des systèmes d’environnement de culture artificiels. Une autre limitation est que la méthode n’a été développée que pour sept carboxylates (aconite, citrate, fumarate, lactate, malate, succinate et oxalate⁾¹², sulfonamides (sulfadiazine, sulfamétazine, sulfachloropyridazine et clindamycine⁾²⁷, et anions inorganiques (sulfures et oxyanions de P, V-vanadium, As-arsenic, Se-sélénium, Mo-molybdène, Sb-antimomoine^)14,26,28,29. L’hydrogel ZrOH a également été utilisé en combinaison avec un réactif particulaire en suspension – acide iminodiacétique pour l’échantillonnage in situ et la cartographie des cations (Al, Fe, Ca-calcium, Mg-magnésium, Mn-manganèse, Ni-Nickel et Zn-Zinc) dans la rhizosphère 28,29,30.

Ici, nous proposons une méthode à base d’hydrogel ZrOH permettant un échantillonnage in situ par le temps et spatialement résolu des carboxylates à partir de systèmes racinaires cultivés en sol. Nous fournissons une description détaillée de la manière de réaliser une expérience sur la boîte à rhizo, incluant l’échantillonnage et la cartographie 2D des exsudats racinaires à l’aide de la technique hydrogel ZrOH. Elle couvre la préparation de l’hydrogel, le remplissage du rhizobox, la culture des plantes, l’application, la récupération et la découpe de l’hydrogel, l’élution des carboxylates à partir de l’hydrogel et l’analyse, suivie de la génération d’images 2D. De plus, elle fournit des notes sur les étapes critiques, telles que l’analyse des carboxylates utilisant la chromatographie ionique par spectrométrie de masse (IC-MS).

Protocol

1. Préparation de l’hydrogel ZrOH

REMARQUE : Un environnement propre et des matériaux sont nécessaires pour la préparation du gel afin d’éviter toute contamination. N’utilisez que de l’eau de laboratoire de qualité I (≤18 MΩ·cm) lors de la préparation des solutions, du rinçage du gel et de l’hydratation pour assurer la qualité. Assurez-vous que les contenants de déchets toxiques (liquides et solides) sont déjà placés dans la hotte avant de commencer la préparation à l’hydrogel. Préchauffez le four à environ 42─45 °C pendant 1 h avant de commencer la préparation des gels. Les détails sur les matériaux et produits chimiques sont listés dans le tableau des matériaux.

1. Préparation de l’assemblage du verre
   1. Préparez un bain acide à 10 % (p/v) de HNO₃ en ajoutant 153,8 mL de 65 % de HNO₃ à 846,2 mL d’eau de laboratoire de qualité I dans une hotte à fumée.
   2. Faites tremper les plaques en verre (6,1 x 17 cm), les pinces à épiler, les entretoises en U en Téflon (0,25 mm ou 0,4 mm) et les clips en plastique dans le bain d’acide pendant au moins 4 heures.
   3. Retirez les plaques en verre, les pinces à épiler, les pinces en plastique et les entretoises en téflon du bain d’acide puis lavez au moins trois fois avec de l’eau de laboratoire de qualité I. Laissez-les ensuite sécher à l’air libre dans un épais à écoulement laminaire ou propre.
      REMARQUE : Les plaques de verre doivent être préparées le jour même que la préparation du gel et éviter de les sécher avec du papier pour minimiser la contamination.
   4. Placez l’entretoise en forme de « U » sur la plaque de verre sèche, ajoutez la seconde, et fixez-les ensemble à l’aide de clipses. Décalez les plaques de verre d’environ ~1 mm pour faciliter le pipetage (voir Figure 1A).
   5. Placez l’assemblage de la plaque de verre sur un papier plastique propre sous le capot du film avant de couler la solution gelée.
2. Préparation du gel de^{polyacrylamide 31}
   1. Solution gélifique : Préparez une solution gélifique de 100 mL en mélangeant 15 mL de gel réticulant Diffusive Gradients in Thin Films (DGT) avec 47,5 mL d’eau de laboratoire de qualité I dans un flacon en plastique propre, puis ajoutez 37,5 mL de solution d’acrylamide (40 %). Remuez soigneusement le mélange lors de l’ajout de chaque solution. La solution gélifiante peut être conservée au réfrigérateur (4 °C) pendant au moins trois mois.
      REMARQUE : Veillez à pipeter/peser les quantités correctes de chaque solution et n’utilisez que la solution d’acrylamide sans bis-acrylamide, car cela produit des gels mous lorsqu’il est placé dans un tampon d’acide 2-(N-morpholino)-éthanassulfonique (MES).
   2. Préparez une solution de persulfate d’ammonium (APS) à 10 % (p/v) en dissolvant 0,1 g d’APS dans 1 g de_H2O. Préparez la solution fraîche chaque jour et assurez-vous qu’elle est complètement dissoute avant utilisation.
   3. Préparez un cocktail en gel en mélangeant une solution de gel de 4 mL avec 28 μL de 10 % d’APS, puis ajoutez 10 μL de 99 % N,N,N’N'-Tétraméthylénadiamine (TEMED) dans des fioles en plastique propres. Mélangez après avoir ajouté chaque solution. La solution peut être préparée jusqu’à 3 gels car le mélange polymérise rapidement. Le volume d’un cocktail peut être ajusté en fonction de la taille des plaques et des entretoises à utiliser.
      REMARQUE : Évitez les bulles et la mousse lors du mélange des différents réactifs.
   4. Faites lentement pipette le mélange de gel entre l’ensemble de la plaque de verre par le centre, comme montré dans les Figures 1B, C²⁶. En cas de bulles d’air, retirez-les en inclinant doucement l’ensemble de verre ou en frappant les plaques de verre avec un stylo.
      REMARQUE : Pour obtenir des gels sans bulles, évitez d’utiliser des plaques en verre rayées et conservez-les dans un bain d’acide après utilisation, en les lavant seulement avant la prochaine utilisation plutôt que dans des sacs de polyéthylène. Utilisez une pipette de 1 mL ou 5 mL avec une petite pointe pour couler le gel et ajoutez le cocktail de gel lentement depuis le centre afin qu’il s’étale uniformément tout en inclinant les plaques à un angle de 45°.
   5. Placez l’ensemble dans le four préchauffé et maintenez la température à 42─46 °C pendant au moins 1 h pour garantir que le gel dure complètement (aucune goutte de liquide).
   6. Faites doucement lever l’ensemble à l’aide d’une lame de rasoir propre et sans rouille depuis les coins et lavez les gels des plaques de verre à l’aide d’eau de laboratoire de qualité I dans une bouteille de lavage (figure 1D–F). Pour faciliter le retrait du gel, faites-le tremper quelques minutes dans de l’eau puis lavez-le dans un bécher de 1-L contenant de l’eau de laboratoire de qualité I.
      REMARQUE : Évitez de tirer le gel avec une pince au cas où il collerait à la plaque, cela pourrait entraîner une déformation du gel. Après polymérisation, les bulles apparentes se trouvent généralement entre le gel et la plaque de verre plutôt qu’à l’intérieur du gel lui-même, qui devient clair une fois la plaque retirée.
   7. Changez l’eau au moins 3 à 4 fois dans les 24 heures suivant l’hydratation (de préférence à des intervalles de 2 heures après la préparation) pour éliminer les produits chimiques de polymérisation restants. En remplaçant l’eau à plusieurs reprises pendant l’hydratation, les impuretés comme les réactifs non réactifs sont diffusées, et le pH est réduit, empêchant ainsi l’accumulation de charges dans le gel.
   8. Conservez les gels dans de l’eau de laboratoire de qualité I (pour une courte durée d’environ 24 heures) ou 0,01 mol de ^L-1 NaCl ou_{NaNO 3} au réfrigérateur (4 °C) si les feuilles de gel ne sont pas immédiatement utilisées pour la précipitation ZrOH. Ces gels peuvent être conservés dans le NaCl jusqu’à 1 mois avant la précipitation.
      REMARQUE : Nous recommandons de précipiter les gels immédiatement après la polymérisation afin de minimiser la contamination qui pourrait être introduite lors du lavage.
3. Précipitations des gels ZrOH¹⁴
   1. Dissoudre 3,22 g d’octahydrate d’oxyde de dichlorure de zirconium (ZrOCl_{2,8H 2}O) dans 40 mL d’eau de laboratoire de qualité I dans un bécher en plastique de 250 mL.
   2. Placez jusqu’à 4 feuilles de gel et remplissez jusqu’à 100 mL. Sinon, dissoudez 1,66 g de ZrOCl_{2,8H 2}O dans 20 mL d’eau de laboratoire de qualité I, mettez 2 gels et remplissez jusqu’à 50 mL.
   3. Faites tremper les feuilles de gel pendant au moins 2 heures pour assurer une répartition uniforme du Zr dans les gels.
   4. Transférez chaque gel dans 100 mL d’acide éthanosulfonique (MES) 0,05 mol ^L-1 2-(N-morpholino)-éthanassulfurique (MES) tamponné à pH 6,7 (pH ajusté avec 1 mol ^L-1 NaOH) pour la précipitation. Remuez doucement le gel avec une pince à épiler pendant les 30 à 60 premiers s afin d’obtenir une précipitation homogène.
   5. Secouez doucement sur un shaker à assiettes à ≤100 tr/min pendant 40 minutes pour une précipitation complète de Zr(OH)₄ dans le gel.
      REMARQUE : Une vitesse de secouage plus lente est préférée pour éviter que les gels ne collent les uns aux autres.
   6. Placez les gels dans de l’eau de laboratoire de qualité I dans un bécher de 1─2 L pendant 24 heures pour retirer ^{les ions} Cl- et changez l’eau au moins 3 fois tous les^{intervalles de 2 h 32}. Un retrait complet des ions Cl^- peut être vérifié en mesurant la conductivité de la solution de rinçage ou en effectuant un test au chlorure.
   7. Conserver le gel dans 0,03 mol ^L-1 _{NaNO 3} ou NaCl, mais le NaCl est préféré pour les expériences sur le sol car le nitrate améliore rapidement l’activité microbienne du sol et constitue également un nutriment majeur^{pour les plantes 13,32}.
   8. Les hydrogels ZrOH ont été testés jusqu’à 60 semaines (conservés au réfrigérateur à 4 °C) et ont montré qu’ils conservaient leurs caractéristiques et leurs bonnes performances (±10 % des valeurs cibles⁾³².
4. Découpe sur gel
   1. Nettoyez la plaque de plexiglas non rayée, la pince à épiler et une lame de rasoir tranchante et sans rouille. En l’absence de plaque en plexiglas, toute plaque de verre épaisse et solide peut être utilisée.
   2. Humidifier la plaque en plexiglas avec de l’eau de laboratoire de qualité I pour aider à étaler les feuilles d’hydrogel ZrOH.
   3. Étalez la feuille d’hydrogel ZrOH sur la plaque de plexiglas à l’aide d’une pince à épiler, tout en veillant à ce qu’elle soit bien placée sans bulles. Identifiez les zones avec des trous dans les feuilles ; ces zones doivent être évitées lors de la coupe.
   4. Découpez précisément les feuilles d’hydrogel ZrOH avec une lame de rasoir tranchante à la taille souhaitée. Retirer l’eau de la plaque après la découpe permet de bien voir les sections découpées.
      REMARQUE : Pour faciliter l’identification des côtés lors de la cartographie 2D, nous recommandons de découper des morceaux d’hydrogel ZrOH en trapèze à angle droit, le côté le plus long étant situé en haut à gauche.
   5. Conservez les hydrogels ZrOH dans de l’eau de laboratoire de qualité I (pour un stockage à court terme et juste avant l’application du gel) ou dans 0,03 mol ^L-1 NaNO₃/NaCl pour un stockage à long terme (>24 h).

2. Mise en place de l’expérience Rhizobox

REMARQUE : Les plantes sont cultivées dans des rhizoboîtes remplies de terre, dont la conception varie. Nous recommandons d’utiliser des rhizoboîtes équipées d’un ou plusieurs trous au fond ou à l’arrière pour faciliter l’arrosage et assurer une répartition uniforme de l’eau (voir Figure supplémentaire 1). Les détails sur les matériaux et les produits chimiques sont listés dans le Tableau des matériaux.

1. Détermination du remplissage du Rhizobox et de la capacité de retenue^{d’eau 26}
   1. Tamisez le sol séché à l’air à l’air à l’aide d’un tamis de 2 mm et homogénéisez le sol. Nous recommandons d’utiliser un sol à texture moyenne, mais un sol sablonneux ou argileux peut également être utilisé, à condition que des techniques de manipulation spécifiques soient employées (par exemple, type rhizobox, remplissage, ouverture et arrosage).
   2. Peser tous les composants de la boîte à rhizos (vide) avec les pinces et le papier plastique et noter le poids (voir Figure supplémentaire 2C). Ajouter 2 à 3 boîtes à rhizobos supplémentaires au nombre requis pour déterminer la capacité de retenue d’eau (WHC).
   3. Estimez la masse de sol sec nécessaire pour remplir le rhizobox. En général, le rhizobox est rempli jusqu’à 2 cm sous le sommet. La densité globale recommandée est d’environ 1,0 à 1,4 g ^cm-3.
   4. Selon le type de rhizobox et la commodité de sa manipulation, il faut remplir soigneusement le rhizobox avec le sol sec. Pendant et après le remplissage, le sol peut être nivelé à l’aide d’une plaque plate sans le compacter. Un sol légèrement humidifié peut également être utilisé pour remplir le rhizobox, maintenant la structure du sol, notamment pour les sols à texture fine ou argileux lourds (voir Wagner et ^al.26 pour une description détaillée).
   5. Sinon, si la boîte à rhizos est remplie par le dessus, fixez le papier aluminium plastique sur la boîte à rhizos, couvrez-la avec la plaque avant, puis clampez (voir Figure supplémentaire 2A–D).
   6. Pour plus de commodité, installez une membrane nuclépore pendant le remplissage et assurez-vous qu’elle soit à plat sur la surface. Une membrane nuclépore est nécessaire lors de l’échantillonnage des exsudats racinaires.
   7. Notez le poids des rhizoboîtes remplies de terre avec les pinces. Calculez la masse de terre sèche (m_{sol sec}) pour chaque rhizoboîte en soustrayant le poids des rhizoboîtes vides de celles remplies de terre, et notez le poids.
   8. La capacité de retenue d’eau est déterminée en saturant d’abord les rhizoboîtes avec de l’eau déionisée, puis en les laissant s’écouler pendant ~8 heures. Peser les rhizoboîtes et calculer la masse d’eau (_{m w}) en soustrayant le poids des rhizoboîtes remplies de sol enregistré à l’étape 2.1.7 du poids actuel. Puis déterminer le WHC (g ^g-1) en divisant m_w par_{m sol sec}, le résultat est un rapport.
      REMARQUE : N’utilisez pas de rhizoboîtes utilisées pour la détermination du WHC pour la cartographie réelle, car la saturation en eau peut entraîner une anaérobie et donc des artefacts rédox.
   9. La teneur en eau optimale de la plupart des plantes pendant la croissance doit être maintenue à 50 %─60 % de WHC (c’est-à-dire facteur WHC, f_WHC = 0,5─0,6), selon le type de sol et l’espèce de plante. Estimez la quantité d’eau à ajouter (m_{w addition}) à chaque rhizobox comme suit : m_{w add} = WHC x f_{WHC x m sol sec}.
   10. Arrosez la rhizobox avant de planter avec un_{mw add}. Si l’arrosage est fait par les trous, ajoutez 5 à 10 mL d’eau à la surface.
   11. Notez la masse des rhizoboiles arrosées, nécessaires à l’arrosage des plantes pendant leur croissance.
2. Culture et gestion des plantes^12,26
   1. Stérilisez les graines avant la germination ou la plantation. Une pratique courante consiste à les placer dans de l’éthanol à 70 % pendant 3 minutes, puis dans 1 % de NaClO pendant 15 minutes pour éviter la croissance fongique. Ensuite, rincez les graines à l’eau déionisée (environ 6 à 7 fois).
   2. Pré-germer les graines entre des papiers filtrants ou des rouleaux de germination humidifiés à l’eau ou à 0,05 mmol L⁻¹ _{CaSO 4} jusqu’à ce que la radicule émerge.
   3. Transférez un plant dans chaque rhizobox, placez-les près de la plaque avant, couvrez-les avec un peu de terre, puis ajoutez un peu d’eau.
   4. Enveloppez les rhizoboîtes dans du papier aluminium pour éviter la réduction photochimique dans la rhizosphère, prévenir la croissance des algues et d’autres micro-organismes photosynthétiques, ainsi que pour éviter de solliciter les racines lorsqu’elles sont exposées à la lumière. Sinon, des plaques frontales noires qui ne laissent pas passer la lumière sont disponibles et peuvent remplacer le feuille d’aluminium.
   5. Placez les rhizoboîtes sur un support pour les incliner dans la chambre de croissance ou la serre avec une température, une humidité relative et une intensité lumineuse contrôlées. Nous recommandons une inclinaison de 25°─35°.
   6. Arrosez les rhizoboîtes gravimétriquement au moins 2 à 3 fois par semaine, selon les besoins des plantes. Cela se fait en pesant les rhizobos, en ajoutant de l’eau pour compenser la différence par rapport au poids enregistré à l’étape 1.2.11. Cependant, lorsque la biomasse de la plante est significative et que la demande en eau augmente, la biomasse doit être prise en compte et le volume d’arrosage ajusté en conséquence.
   7. Des pratiques spécifiques de gestion des cultures (par exemple, la fertilisation) sont réalisées selon le dispositif expérimental, les caractéristiques du sol, les espèces végétales cultivées et les besoins courants de lutte contre les maladies et les ravageurs lors de la croissance des plantes.
   8. La période de croissance et l’échantillonnage des exsudats racinaires dépendent en grande partie de la taille des rhizobois, des espèces végétales et des objectifs de l’étude.

3. Échantillonnage par exsudat de racines^12,26

REMARQUE : Nous fournissons ici des détails sur l’échantillonnage non destructif des exsudats radicaux. Assurez-vous que tous les matériaux nécessaires sont préparés avant l’échantillonnage et que les blancs expérimentaux sont inclus lors de l’échantillonnage. Les détails sur les matériaux et les produits chimiques sont listés dans le tableau des matériaux.

1. Amenez lentement la teneur en eau des rhizoboîtes à 90 % à 90 % de WHC (80 % pour les cultures très sensibles au stress oxygène) un jour ou au moins 2 heures avant l’échantillonnage. Cela peut être réalisé avec précision en calculant d’abord la quantité d’eau à ajouter (m_{w add}) à l’étape 2.1.9 en utilisant 90 %─95 % de WHC, puis en recalculant le poids total du rhizobox, du sol humide et une estimation du poids de la plante. À l’aide d’un bilan, ajoutez de l’eau déionisée jusqu’à ce que le rhizobox atteigne le poids recalculé.
2. Déroulez la feuille d’aluminium de la boîte à rhizo, identifiez et dessinez la région d’intérêt sur la plaque avant. Cette étape n’est requise que si seuls les segments racinaires ou les jeunes plants doivent être échantillonnés.
3. Découpez un papier plastique et de l’hydrogel ZrOH (voir l’étape 1.3) dans les dimensions spécifiées selon la région d’intérêt et la taille du rhizobox. Si la membrane nucléoporeque n’a pas été installée lors du remplissage, découpez-la aux dimensions souhaitées, légèrement plus grandes que l’hydrogel ZrOH.
4. Placez les rhizoboîtes sur un support plat avec la plaque avant amovible orientée vers le haut et ouvrez-les soigneusement (voir Figure 2A). Retirez lentement le papier aluminium plastique tout en veillant à ce que les racines et le sol ne soient pas dérangés.
5. Placez une règle sur la zone d’intérêt et capturez des images haute résolution, nécessaires pour le traitement ultérieur des données. Une règle sert de référence pour une détermination précise de la taille directement à partir de l’image lors du traitement, surtout si de nombreuses rhizobobos doivent être échantillonnées.
6. Ajouter une petite quantité d’eau à la zone racinaire cible jusqu’à ce qu’un film d’eau mince apparaisse à la surface (voir Figure 2B). Une teneur en humidité plus élevée (préférable 90 % à 95 % de WHC ou 80 % pour les cultures très sensibles au stress oxygène) du sol facilite un bon contact sol-gel lors de l’échantillonnage. Une teneur en humidité plus élevée est nécessaire pour assurer un flux constant de molécules sur l’hydrogel.
7. Placez la membrane nuclépore prédécoupée directement sur la surface du sol/région racinaire d’intérêt et assurez-vous qu’elle soit à plat à l’interface sol-racine (voir Figure 2C).
8. Placez l’hydrogel ZrOH directement et aussi plat que possible sur la membrane nuclépore dans la région d’intérêt et prenez une photo avec la règle placée sur le côté gauche de l’hydrogel ZrOH (voir Figure 2D). La règle peut aider à déterminer la taille de l’hydrogel ZrOH et, en cas de modification des propriétés lors de l’échantillonnage, la zone échantillonnée, ainsi qu’identifier les côtés lors d’un stockage prolongé (>1 an).
9. Protégez l’hydrogel ZrOH de la plaque avant en plaçant un papier aluminium plastique sur l’hydrogel ZrOH (voir Figure 2D).
10. Fermez doucement la boîte à rhizos pour réduire le mouvement de l’hydrogel ZrOH. Un mouvement minimal de l’hydrogel ZrOH lors de la fermeture de la boîte à rhizos peut également être obtenu en fixant le sandwich en gel (membrane nuclépore + hydrogel ZrOH + feuille plastique) sur une plaque avant propre de la boîte à rhizobox avec du ruban isolant en vinyle, comme décrit par Wagner et^{al. 26}.
11. Enveloppez à nouveau la rhizoboîte dans du papier aluminien et remettez-la dans la chambre de croissance/serre pendant 24 heures. Les exsudats racinaires peuvent être collectés pour des périodes plus longues ou plus courtes, à condition que le gel ne sèche pas, et selon le montage expérimental et les objectifs de l’étude.
12. Après la période d’application, ouvrez doucement la boîte à rhizo, retirez soigneusement le ruban et la membrane, puis récupérez l’hydrogel. Placez l’hydrogel dans un sac hermétique stérile, ajoutez quelques gouttes d’eau avant de fermer, puis conservez au réfrigérateur (4 °C) jusqu’à l’analyse. Conservez les gels vierges de manière similaire à un témoin. Pour la cartographie 2D, soulevez l’hydrogel ZrOH avec une feuille plastique et marquez le dessus.
13. Retirez les racines et déterminez les paramètres morphologiques de la racine, leur poids frais et leur poids sec pour la normalisation des données exsudées si aucune expérience de résolution temporelle n’est menée.
14. Fermez la rhizobox et replacez-la dans la chambre climatique ou la serre si des études à résolution temporelle sont réalisées.

4. Élution et mesure des carboxylates¹²

REMARQUE : De l’eau de laboratoire fraîche de qualité I et des normes analytiques de haute pureté sont nécessaires pour préparer les blancs et les étalons. En tant qu’assurance qualité, des normes certifiées de contrôle qualité doivent être utilisées. Assurez-vous que les solutions (échantillons et étalons) sont exemptes de particules en filtrant les échantillons à travers des filtres en nylon de 0,2 μm ou 0,45 μm avant l’analyse afin d’éviter que les tubes ne se bouchent. Les détails sur les matériaux et les produits chimiques sont listés dans le tableau des matériaux.

1. Retirez les hydrogels ZrOH chargés et vierges du réfrigérateur, mesurez les dimensions à l’aide d’une règle, puis calculez le volume de chacun en utilisant une épaisseur de 0,4 mm pour un espaceur de 0,25 mm et 0,64 pour un entretoise de 0,4 mm. Pour la cartographie 2D, découpez les hydrogels ZrOH à la taille souhaitée à l’aide d’une lame de rasoir propre. Gardez à l’esprit que la limite inférieure est d’environ 2 x 2 mm en raison des difficultés à couper les petites pièces et à manipuler les volumes d’élution appropriés.
   REMARQUE : Au lieu d’une règle, utilisez du papier millimétré (papier millimétré millimétrique) d’un côté de la plaque de plexiglas utilisée pour la découpe, facilitant ainsi la découpe des hydrogels ZrOH en morceaux presque parfaits. L’épaisseur des hydrogels ZrOH a été confirmée à l’aide d’un étrier vernier.
2. Placez les hydrogels ZrOH ou les morceaux d’hydrogel ZrOH dans des fioles en plastique, éluez-les en ajoutant 0,5 mol ^L-1 NaOH selon le rapport 1 mL eluent pour 0,196^{cm 3} hydrogel ZrOH et secouez sur un vibreur à assiettes pendant 24 heures à 150 tr/min.
3. Si le volume d’élution est faible, pour une très petite pièce d’hydrogel ZrOH (par exemple 2 x 2 mm), ajoutez alors de l’eau de qualité I de laboratoire en poids pour atteindre 45-60 μL, selon le volume minimal nécessaire pour la méthode analytique utilisée pour la quantification des carboxylates (par exemple, IC-MS nécessite au moins 45 μL d’échantillon pour l’autoéchantillonneur, selon l’instrument). Notez la quantité exacte d’eau ajoutée pour porter le volume à 45-60 μL, car cela sera nécessaire pour le calcul du facteur de dilution et de la concentration réelle.
4. Filtrez les échantillons (filtres nylon 0,2 μm ou 0,45 μm) et transférez-les dans des flacons. Nous recommandons d’utiliser des fioles en plastique IC de 1,5 mL car elles peuvent être congelées sans se casser. Des fioles de 330 μL peuvent également être utilisées pour des volumes plus petits, mais il faut veiller à ne pas avoir de bulles d’air.
5. Quantifier les carboxyles dans la solution d’élution par la méthode analytique préférée (par exemple, IC-MS, HPLC). Nous recommandons leur séparation en utilisant des circuits intégrés couplés à la détection de MS. Alternativement, la chromatographie liquide haute ou ultra-performance (HPLC ou UHPLC) peut être utilisée en combinaison avec divers détecteurs, y compris des détecteurs avancés de MS (par exemple, temps de vol ou Orbitrap) ou des détecteurs spectrophotométriques.
6. À la fin de la mesure, les échantillons, ainsi que les standards, peuvent être conservés au congélateur. Nous recommandons de stocker toutes les solutions contenant des carboxylates à -20 °C pendant une période maximale d’un an. Pour les périodes de stockage supérieures à 1 an, de nouveaux standards peuvent être préparés et mesurés en tant que contrôle qualité.
7. Calculer la quantité totale de chaque carboxylate dans le volume total d’éluate (c’est-à-dire volume de NaOH + volume hydrogel + eau ajoutée) et normaliser par poids racinaire ou surface radiculaire et multiplier par les facteurs d’efficacité d’élution : 0,94 pour l’aconité, 1,00 pour le citrate, 0,90 pour le fumarate, 1,02 pour le lactate, 1,05 pour le malate, 0,91 pour l’oxalate et 1,00 pour le succinate (voir Tableau Supplémentaire 1). Veillez à ce que les facteurs de dilution soient pris en compte, s’il y en a eu lors de l’élution et de la mesure.

5. Cartographie 2D

REMARQUE : Il n’existe pas de logiciel spécifique pour créer des images 2D des données d’exsudation. La cartographie peut être réalisée avec Microsoft Excel et Python.

1. Insérez les données obtenues à l’étape 4.7 de chaque morceau de gel dans sa cellule correspondante à l’intérieur de la grille 2D (lignes x colonnes). La grille est générée sur les photos prises à partir des racines lors de l’échantillonnage (voir étape 4.1).
2. Définissez la taille des grilles et vérifiez que les données correspondent.
3. Sélectionnez l’échelle des couleurs et spécifiez les codes de couleur représentant les valeurs les plus basses et les plus élevées.
4. Spécifiez la plage de données numériques pour la légende afin de garantir qu’elle correspond fidèlement à l’échelle sélectionnée.
5. Créez une carte thermique et assurez-vous qu’elle n’a ni étiquettes ni lignes de grille. La carte thermique peut être facilement créée dans R Software à l’aide de l’exemple de script R fourni dans le fichier supplémentaire 1.
6. Traiter l’image et la positionner à côté de la photographie des racines obtenues lors de l’échantillonnage afin de pouvoir interpréter la distribution spatiale des carboxylates.
   REMARQUE : Aujourd’hui, la cartographie peut également être réalisée à l’aide d’outils d’intelligence artificielle. La procédure est simple : il suffit de copier-coller la grille numérique d’Excel dans le chat, puis de demander une carte thermique avec les dimensions de gel et l’échelle de couleur désirées pour la légende. Gardez à l’esprit que le résultat n’est pas toujours parfait dès la première tentative, mais répéter le processus donne généralement des résultats précis. Cette approche offre l’avantage d’être nettement plus rapide que les méthodes manuelles.

Results

La méthode de l’hydrogel ZrOH a été initialement développée pour échantillonner le citrate à partir de racines végétales cultivées en sol et a été utilisée avec succès pour résoudre la distribution spatiale de l’exsudation¹¹. Avant d’adopter cette méthode pour d’autres carboxylates, nous avons caractérisé les hydrogels ZrOH afin de garantir qu’ils soient également adaptés à une utilisation avec d’autres carboxylates (voir Tableau Supplémentaire 1). De plus, nous avons élué et analysé des hydrogels ZrOH chargés stockés issus d’une expérience rhizobox menée en 2019. Les hydrogels ZrOH peuvent occuper 100 % de la quantité chargée en 5 h (~0,2 μmol, 10 mL) pour l’aconité, le citrate, le fumarate, le lactate, le malate, l’oxalate et le succinate en utilisant les mêmes paramètres d’élution établis par Tiziani et ^al.12 (1 mL, 0,5 mol ^L-1 NaOH). Les hydrogels ZrOH peuvent se lier jusqu’à 3,29 μmol ^cm-2 ± 0,40 μmol ^cm-2 de carboxylates (voir Tableau Supplémentaire 1), bien plus élevées que les concentrations (souvent dans la plage nmol) généralement trouvées dans la rhizosphère. De plus, les hydrogels ZrOH chargés en carboxylate restent stables et peuvent être stockés pendant plusieurs semaines avant analyse, minimisant ainsi la dégradation microbienne pendant et après l’échantillonnage.

Les résultats de la Figure 3 présentent une visualisation 2D de la distribution spatiale de l’exsudation du citrate le long d’une racine grappe d’une plante Lupinus albus L (lupin) cultivée en sol dans un sol déficient en P. La carte comprend 48 mesures individuelles réalisées sur 5 blocs de gel de 2 mm, dans lesquels le gel ZrOH a été sectionné en août 2025 après un échantillonnage de citrate en août 2019. Il est clair que les hydrogels ZrOH ont effectivement absorbé le citrate exsudé, avec des résultats quantifiables même sur un petit gel (0,10^cm2), sans besoin de préconcentration de l’éluat. Les taux d’exsudation les plus élevés de citrate ont été observés dans les régions racinaires en grappe (jusqu’à 2,8 nmol ^cm-2 gel ^h-1), ce qui correspond à 67,2 nmol ^cm-2 gel jour ¹, tandis que les taux les plus faibles ont été observés uniquement sur les morceaux de gel en contact avec le sol. Les racines grappes mesuraient entre 0,2 mm et 15,6 mm, avec une longueur totale de 250 mm. Ces résultats confirment l’adéquation des hydrogels pour un échantillonnage de carboxylate libéré par les racines pendant 24 heures. Les hydrogels ZrOH ont également pu lier d’autres carboxylates, tels que le lactate, le fumarate, le malate et l’oxalate, en plus du citrate (Tableau 1). La détection de la plupart des carboxylates provenant des hydrogels ZrOH, stockés à 4 °C pendant 6 ans, suggère une dégradation minimale des carboxylates. Cependant, des expériences sont en cours pour recueillir beaucoup plus d’informations sur les sept carboxylates testés provenant de différentes espèces végétales.

Figure 1 : Étapes critiques de la préparation du gel de polyacrylamide. (A) Alignement de l’ensemble de la plaque de verre avec un décalage de ~1 mm. (B) Moulage du gel et (C) étalage uniforme de la solution geléfique dans la plaque à partir du centre de la plaque. (D) Levier de la plaque de verre à l’aide d’une lame de rasoir depuis le coin. (E) Imbiber les gels pour les détacher de la plaque de verre. (F) Rincer le gel dans un bécher. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Échantillonnage d’exsudat racinaire sur un segment du système racinaire végétal cultivé dans un rhizobox à l’aide d’hydrogels ZrOH. (A) Ouvrir le rhizobox après avoir retiré la plaque avant et le plastique. (B) Mouiller approprié l’interface sol-racine à l’aide d’eau déionisée dans une bouteille de lave. (C) Membrane de gravure de piste du nuclépore fixée à une interface sol humide-racine. (D) Rhizobox avec un hydrogel ZrOH appliqué sur la région d’intérêt, recouvert d’un papier plastique pour la protection du gel contre la plaque avant. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Échantillonnage d’exsudat racinaire à l’aide d’hydrogel ZrOH et image 2D à l’échelle millimétrique de l’exudation du citrate. (A) Photo de l’hydrogel ZrOH superposé sur la région racinaire d’intérêt lors de l’échantillonnage pour générer des grilles utilisées pour la cartographie. (B) Image 2D à l’échelle millimétrique montrant la distribution du taux d’exudation du citrate (nmol ^cm–2 gel h^–1) une racine blanche de Lupinus albus L. (lupin) en grappe cultivée dans un sol pauvre en phosphore. Chaque grille représente une pièce de gel de 5 x 2 mm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Usine	Traitement	Aconitate	Citrate	Fumarate	Lactate	Malate	Oxalate	Succinate
	sol mg P kg-1	NMOL CM-2 H-1
Lupin	50		0.02	0.21	0.15		0.06
Lupin	250		0.02	0.4	0.17	0.02	0.2
Lupin	250		0.05	0.31	0.09	0.01	0.19
Lupin	0		0.03	0.21	0.15	0.02	0.1
Rice (DJ123)	250		0.01	0.24	0.04	0.02	0.1
Rice (DJ123)	250		0.01	0.39	0.12		0.1
Rice (Nerica4)	50		0.01	0.24	0.35		0.09

Tableau 1 : Taux d’exsudation d’aconité, citrate, fumarate, lactate, malate, oxalate et succinate des plantes Lupinus albus L. (lupin) et Oryza sativa L. (riz) cultivées en sol soumis à 0, 50 et 250 mg de P ^kg-1 . LOQ est la limite de quantification

Tableau complémentaire 1 : Paramètres d’élution de NaOH (1 mL, 0,5 mol ^L-1) et capacité de l’hydrogel ZrOH pour sept carboxylates. Les données correspondent aux moyennes ± écarts-types de la moyenne (n = 4 pour l’efficacité d’élution et la capacité des carboxylates individuels et n = 40 pour le mélange carboxylate). Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 1 : Représentation schématique de la rhizobox recommandée pour faciliter l’arrosage. La rhizobox se compose d’un cadre de rhizobox équipé de trous d’eau espacés uniformément au fond et à l’arrière pour faciliter une distribution uniforme de l’eau pendant l’arrosage, ainsi que d’une plaque frontale transparente amovible pour surveiller la croissance des racines pendant l’expérience. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 2 : Assemblage du Rhizobox et procédé de remplissage du sol. (A) Couvrir les trous à l’arrière du cadre du rhizobox avec du ruban adhésif. (B) Fixer une membrane nuclépore, puis appliquer du papier plastique à l’avant ou sur le côté ouvert du cadre du Rhizobox (assurez-vous qu’il soit suffisamment serré et plat). (C) Placez la plaque avant et serrez le rhizobox. (D) Remplissez le rhizobox en l’inclinant vers l’avant afin que les particules fines tombent sur la surface amovible pour obtenir une surface lisse, comme sur la photo. (E) Sinon, remplir le cadre du rhizobox couvert (A) par le côté ouvert, le niveler avec la plaque amovible, puis le recouvrir d’une membrane nucléopore, d’un papier plastique et de la plaque avant. (F) Installation finale du Rhizobox, arrosé et planté. Une procédure alternative de remplissage est présentée dans Wagner et al. (2020). Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 1 : Le fichier inclut des détails sur le script R utilisé pour générer une carte thermique. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

La méthode d’échantillonnage carboxylate décrite ici utilise des hydrogels ZrOH, pour lesquels une bonne préparation et manipulation du gel sont essentielles. Pour manipuler les hydrogels ZrOH, nous recommandons de les garder humides avec quelques gouttes d’eau de qualité laboratoire. Lors de la préparation, il est important de couler le gel rapidement après la préparation du mélange gel (étape 1.1.3) et de s’assurer qu’aucune bulle ne se forme entre les plaques de verre. Les bulles situées au centre de l’hydrogel ZrOH sont particulièrement critiques, car elles peuvent interférer avec l’échantillonnage. En revanche, les bulles sur les bords peuvent être éliminées en coupant le gel avant application. De plus, les carboxyles libérés par la racine se lient au ZrOH précipité dans les hydrogels, rendant une répartition uniforme du Zr lors des précipitations essentielle. Une distribution inégale du Zr dans le gel peut entraîner une diffusion latérale des carboxylates, ce qui déforme leur répartition spatiale et compromet la fiabilité de la localisation 2D²⁶. Une distribution uniforme du Zr peut être réalisée en immergeant les gels de polyacrylamide dans une solution_{ZrOCl 2}·_{8H 2O}pendant plus de 2 h dans un bécher plus large et en plaçant moins de^{gels 12} (étape 1.2.3). De plus, la distribution du Zr peut être vérifiée par microscopie électronique à balayage (SEM, S-3400N II, Hitachi, Japon) comme recommandé par Guan et al.14, qui ont développé les hydrogels ZrOH. Cependant, le MEB n’est pas envisageable comme procédure standard pour de gros échantillons.

Une autre étape cruciale concerne le remplissage du rhizobox, l’application de la membrane nuclépore et l’arrosage avant l’application du gel pour le prélèvement carboxylé. Une attention particulière doit être portée lors du remplissage et de la manipulation des sols sablonneux ou argileux pour garantir une surface uniformement lisse, essentielle au bon contact avec le gel tout en maintenant des conditions bien drainées. Une surface lisse est également essentielle pour une bonne fixation de la membrane nuclépore. Il est crucial d’établir un bon contact entre la racine et l’hydrogel ZrOH en veillant à ce que la membrane du nuclépore adhère correctement à la surface du sol avec un minimum de bulles d’air. Avant l’application du gel ZrOH, il est également crucial de bien saturer le sol afin que l’hydrogel puisse être solidement fixé, plat et humide pour préserver son intégrité lors de l’échantillonnage. Lors de la découpe du gel pour la cartographie carboxylate 2D, obtenir des coupes millimétriques peut être difficile ; nous recommandons donc de ne pas descendre en dessous d’une résolution de 2 x 2 mm. De plus, puisque les gels rétrécissent à la séchage, il est essentiel de les garder humides après l’échantillonnage pour préserver leur intégrité (étape 3.12). La méthode actuelle a été adaptée de Tiziani et ^al.12 qui recommandaient l’utilisation de_{NaN 3} comme inhibiteur microbien pour prévenir la dégradation des carboxylates. Dans ce protocole, nous n’utilisons aucun inhibiteur microbien, couramment utilisé pour échantillonner les exsudats racinaires (_{NaN 3} ou micropur, un matériau à base d’AgCl₃)²³, en raison de leur interférence avec les méthodes analytiques et de leurs effets potentiels sur le système IC-MS.

À ce jour, la méthode a été validée uniquement pour sept carboxylates (aconité, citrate, fumarate, lactate, malate, oxalate, succinate), tandis que l’exsudôme radiculaire comprend un mélange complexe de composés (par exemple, phénoliques, acides aminés, glucides et carboxylates). Ces autres composés importants ne sont actuellement pas pris en compte dans la méthode, et les hydrogels ZrOH n’ont pas été caractérisés pour leur échantillonnage. La présence d’autres oxyanions dans le sol (tels que phosphate, nitrate) peut éventuellement affecter l’absorption, la capacité et l’élution des carboxylates, ainsi que la quantification des carboxylates sur IC ou HPLC. De plus, l’échantillonnage de très grands systèmes racinaires entiers de plantes plus grandes (par exemple, arbres ou arbustes) peut être très difficile en raison des difficultés à produire de très gros hydrogels ZrOH (>30 cm). Cela pose cependant problème dans toutes les techniques actuelles d’échantillonnage^{d’exsudats 8}. Une autre limitation est l’utilisation des rhizoboboxes. Bien que la croissance des plantes dans les rhizobos soit beaucoup plus réaliste que dans les systèmes^{hydroponiques 8}, elle reste un système artificiel, avec un espace tridimensionnel limité pour le développement^{racinaire 33}. De plus, l’échantillonnage se fait sur une surface 2D, ce qui pourrait théoriquement entraîner la perte de carboxyles exsudés dans d’autres directions non en contact avec les gels. Cependant, cette limitation pourrait être atténuée par la diffusion, une capacité de liaison plus élevée des hydrogels ZrOH pour les carboxylates, et la forte teneur en eau du sol rhizosphere lors de l’application. Cependant, des validations supplémentaires sont nécessaires pour déterminer ces aspects.

La méthode hydrogel ZrOH d’échantillonnage des carboxylates libérés des racines offre plusieurs avantages par rapport aux méthodes couramment utilisées (c’est-à-dire les approches hybrides sol-hydroponie et hydroponiques). Cette approche novatrice permet un échantillonnage in situ des carboxylates de systèmes racinaires non perturbés en sol, un échantillonnage à résolution temporelle (Santner, Mühlbacher et al., données non publiées) et une cartographie 2D à l’échelle millimétrique. De plus, les hydrogels ZrOH peuvent être utilisés sur les racines pendant au moins 24^{h 12}. De plus, un échantillonnage répété du même segment racinaire sur des périodes plus longues devrait être possible. Cette méthode est beaucoup mieux développée et caractérisée que des méthodes similaires, telles que l’application de papiers^{filtrants 8}. Un prélèvement prolongé est possible avec les hydrogels ZrOH en raison d’une forte capacité de gel pour les carboxylates, par exemple la plus faible à 0,44 μmol ^cm-2 ± 0,04 μmol cm⁻² pour le malate à la plus haute de 1,66 μmol ^cm-2 ± 0,10 μmol cm⁻² pour le succinate à pH 4,00 avec un total de 3,29 μmol ^cm-2 ± 0,40 μmol cm⁻² lorsque les carboxyles sont mélangés (voir Tableau Supplémentaire 1). Omettre l’étape de lavage des racines (qui prend généralement 20 à 30 minutes par plante) dans la méthode hybride sol-hydroponie réduit significativement les dommages au système racinaire et le biais associé, ce qui donne des données plus réalistes et représentatives.

Notamment, les hydrogels ZrOH chargés ne nécessitent pas de conditions de stockage particulières, seulement une réfrigération, et nous n’avons pas trouvé de préconcentration nécessaire après élution dans nos applications jusqu’à présent. Les hydrogels ZrOH lient également d’autres anions, qui sont élués dans les mêmes conditions et peuvent être analysés par IC^14,34. Cela permet de relier l’exsudation carboxylate à la distribution spatiale des nutriments dans la rhizosphère²⁹.

En conclusion, cette nouvelle approche d’échantillonnage des carboxylates libérés des racines constitue une étape fondamentale pour la recherche sur la rhizosphère. Puisque les carboxylates jouent un rôle crucial dans la mobilisation et l’acquisition des nutriments des plantes (par exemple, P, Fe)^35,36, ainsi que dans le recrutement de micro-organismes bénéfiques, cette méthode pourrait être utilisée pour cribler les variétés des caractéristiques racinaires et la sélection des plantes.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Éthanol	Sigma-Aldrich		70%
Acide oxalique	Sigma-Aldrich	194131-250G	98%
acide trans-aconitique	Sigma-Aldrich	122750-25G	98%
Octahydrate d’oxyde de dichlorure de zirconium (ZrOCl2 & times 8H2O, 98 %)	Thermo Scientific	A12342.22	98%
Acide citrique	Sigma-Aldrich	C83155-500G	99%
Nitrate de sodium	VWR Chemicals	Lot n° : 19H224150	100%
Acide nitrique (HNO 3)	Sigma-Aldrich	CAS-No. : 7697-37-2	>65 % pour l’analyse EMSURE® ; Reag. Ph Eur, ISO
Acide fumarique	Sigma-Aldrich	240745-100G	>99 %
Hydroxyde de sodium	Sigma-Aldrich	S8045-500G	&ge ; 98%
Persulfate d’ammonium (APS_(NH4)2S2O8)	Thermo Scientific	201531000	&ge ; 98,0 %, extra pure, pour l’électrophorèse
Acide succinique	Sigma-Aldrich	S3674-100G	&ge ; 99%
Tampon d’acide 2-(N-morpholino)-éthanassulfurique (MES)	Sigma-Aldrich	M8250-250G	&ge ; 99.5%
Chlorure de sodium	Sigma-Aldrich	71376-1KG	&ge ; 99.5%
Réticulateur	DGT Research Ltd (Lancaster, Royaume-Uni)	NA	2 %, dérivée de l’agarose
Vibrateur à plaques ou horizontal			Any  ;
Chromatographie ionique ou IC-MS	Thermo Fischer Scientific	NA	Toute chromatographie liquide haute ou ultra-performance (HPLC ou UHPLC) peut être utilisée en combinaison avec divers détecteurs, y compris des détecteurs avancés de MS (par exemple, le temps de vol ou Orbitrap) ou des détecteurs spectrophotométriques
Mesure de pH			N’importe quelle électrode de pH de laboratoire peut être utilisée
Four	Relieur	NA	Tout petit four qui maintient une température précise peut être utilisé, de préférence un plus petit.
Nylon filters_13 mm 0,45 & micro ; M	Technologie de filtres GVS	Lot n° : 7135431	Des filtres en nylon plus grands peuvent aussi être utilisés, mais les plus petits sont préférés car le volume éluat est faible.
Dihydrate de sulfate de calcium	Sigma-Aldrich	C3771-1KG /CAS-No. : 10101-41-4	CaSO4 peut également être utilisé.
Solution d’acrylamide, 40 %	G-Biosciences	786-508	N’utilisez pas la solution d’acrylamide mélangée avec  ; Bis-acrylamide. Composé toxique qui doit être manipulé avec précaution dans une hotte à fumée.
Rhizoboxes	https://www.rhizosphere.com/	NA	Nos rhizoboxes sont fabriquées sur mesure selon le design du Rhizosphere.com
Kit de flacon en polypropylène, 1,5 mL	Thermo Scientific	79812	Les fioles en plastique IC sont préférées car elles peuvent être congelées sans se casser. 330 & micro ; L peut aussi être utilisé, mais il faut veiller à ce qu’il n’y ait pas de bulles d’air
Acide cis-aconitique	Thermo Scientific	A16010.06	Tech. 85 %
N,N,N',N'- tétraméthyléthylénediamine (TEMED)	Sigma-Aldrich	Lot n° : BCBN1173V	Composé toxique qui doit être manipulé avec précaution
Fioles PP de 250 mL	Sarstedt	Numéro de lot : 2406082
Feuille d’aluminium	Supermarché local	NA
Beakers_1 L/ 2 L
Pinces	Entrepôt local	NA
Plaque de verre (6,1 x 17 x 0,4 cm)	Entrepôt local	NA
L-(-)-Acide malique	Sigma-Aldrich	M6413-25G
Norme lactate pour la CI	Sigma-Aldrich	07096-100ML
Banc d’écoulement laminaire
Acide L-lactique anhydre	Thermo Scientific	L13242.14
Gravure de piste du nuclépore Membrane_0.2 & micro ; m	Cytiva	Lot n° : A29983896
Papier aluminium / sacs plastiques	Entrepôt local	NA
Pinces en plastique	Semadeni	602
Plaque en plexiglas	Entrepôt local	NA
Fioles PP de 30 mL	Spa d’Aptaca	Lot n° : 250552
PTFE spacer_0,25/0,4 mm  ;	https://www.krishplasticindustries.com/teflon-sheet.html
Lames de rasoir	Entrepôt local	NA
Souverain	Librairie locale	NA
Hypochlorite de sodium (NaClO)	Réactifs CARLO ERBA	Numéro de code : 7681-52-9
Syringes_1 mL	HENKE SASS WOLF (HENKE-JET)	Lot n° : 22A17C8
Ruban isolant en vinyle	Entrepôt local	NA