Method Article

Impact des différentes méthodes d’extraction sur les profils de bioactivité in vitro de Terfezia claveryi

DOI:

10.3791/69950

⸱

March 20th, 2026

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biophysics, Department of Basic Medical Sciences, Faculty of Medicine, Kirsehir Ahi Evran University, 2Department of Genetics and Bioengineering, Faculty of Engineering and Architecture, Kirsehir Ahi Evran University, 3Department of Physiology, Gulhane Faculty of Medicine, University of Health Sciences, 4Department of Medical Services and Techniques, Medical Laboratory Techniques Program, Vocational School of Health Services, Kirsehir Ahi Evran University, 5Department of Field Crops, Faculty of Agriculture, Kirsehir Ahi Evran University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La bioactivité in vitro des extraits de Terfezia claveryi dépendait de la méthode d’extraction biophysique et de la polarité du solvant. L’extrait d’eau issu de l’extraction assistée par macération (MAE) a présenté l’activité antioxydante la plus forte, tandis que l’extrait d’extraction de Soxhlet (SE) a induit une cytotoxicité accrue dans les cellules SH-SY5Y. Ces résultats démontrent des différences nettes dépendantes de la méthode dans la bioactivité in vitro des extraits de Terfezia claveryi.

Abstract

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Terfezia claveryi est une truffe comestible du désert, traditionnellement consommée dans les régions arides. Ces dernières années, elle a suscité un intérêt scientifique croissant en raison de ses propriétés potentielles antioxydantes, antimicrobiennes et thérapeutiques, suggérant des applications possibles dans les domaines de l’alimentation et de la santé. Cependant, malgré les preuves croissantes de son potentiel biologique, l’influence des différentes stratégies d’extraction sur la récupération des composés bioactifs et le profil de bioactivité in vitro résultant de Terfezia claveryi n’a pas encore été clarifiée dans la littérature. Dans cette étude, la bioactivité in vitro des extraits de Terfezia claveryi obtenus à l’aide de différentes méthodes d’extraction et solvants de polarité variable a été évaluée. Le rendement d’extraction a été déterminé, et les extraits obtenus ont été évalués pour leurs activités antioxydantes, antimicrobiennes, antibiofilms et cytotoxiques à l’aide de systèmes de test établis. La capacité antioxydante a été mesurée à l’aide de tests 2,2-diphényl-1-picrylhydrazyl (DPPH), 2,2′-azino-bis (3-éthylbenzothiazoline-6-sulfonique) (ABTS) et du pouvoir antioxydant réduction ferrique (FRAP), tandis que les effets cytotoxiques ont été étudiés dans les cellules neuroblastomes SH-SY5Y. Le rendement d’extraction variait selon la méthode et la polarité du solvant, le rendement le plus élevé étant obtenu à partir de l’extrait aqueux préparé par la méthode d’extraction assistée par ultrasons (EAU) (18,40 %). Il a été déterminé que l’activité antioxydante présentait des différences significatives selon la méthode d’extraction, et que les extraits aqueux obtenus par la méthode d’extraction assistée par macération (MAE) présentaient un profil riche en composés phénoliques ainsi qu’une capacité de récupération radicale la plus forte. L’analyse LC-MS/MS de cet extrait a révélé la présence de neuf composés phénoliques ; L’acide quinique et l’acide chlorogénique ont été identifiés comme les composants dominants. En revanche, les extraits dérivés de Soxhlet ont induit des effets cytotoxiques plus importants dans les cellules SH-SY5Y. Les réponses antimicrobiennes et antibiofilms ont montré une variation relativement limitée entre les méthodes d’extraction, indiquant une dépendance moindre à la stratégie d’extraction pour ces activités. Dans l’ensemble, ces résultats démontrent que la méthode d’extraction biophysique et la sélection des solvants sont des déterminants critiques du profil bioactif in vitro des extraits de Terfezia claveryi , avec des effets marqués observés pour les activités antioxydantes et cytotoxiques.

Introduction

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L’utilisation de diverses espèces de champignons pour améliorer la santé et prévenir et traiter les maladies remonte àl’Antiquité 1,2,3. Les macrochampignons sont généralement classés en deux groupes : épigées (champignons) et hypogées (truffes). Connue sous le nom de truffe du désert, Terfezia claveryi (T. claveryi) est une espèce de truffe de renommée mondiale et comestible appartenant au genre Terfezia5. T. claveryi est couramment réparti dans les régions arides et semi-arides où les espèces d’hélianthème sont répandues 6,7,8,9,10,11. Ces dernières années, le fardeau mondial des maladies chroniques telles que le cancer et les troubles neurodégénératifs a considérablement augmenté, soulignant le besoin pressant de nouveaux agents thérapeutiques sûrs et efficaces. Selon les rapports de santé mondiale, le cancer reste l’une des principales causes de décès dans le monde, tandis que les maladies neurodégénératives continuent d’augmenter parallèlement à un vieillissement de la population. Compte tenu de ce problème croissant de santé publique, l’étude des produits naturels issus de champignons et de plantes médicinales comme sources potentielles de composés bioactifs est devenue une prioritéimportante de recherche 12.

Parallèlement, l’apparition rapide de la résistance aux antimicrobiens représente une autre menace majeure pour la santé mondiale. La résistance aux médicaments a considérablement réduit l’efficacité des antibiotiques traditionnels, créant un besoin pressant de stratégies antimicrobiennesalternatives 13. Les métabolites secondaires issus de sources naturelles, en particulier les composés phénoliques et polyphénoliques, suscitent un intérêt croissant en raison de leurs mécanismes antimicrobiens variés et de leur faible tendance à développer une résistance14. Le stress oxydatif est un facteur mécaniste fondamental à l’origine de nombreuses maladies chroniques, notamment le cancer, les troubles neurodégénératifs et les syndromes métaboliques. Une production excessive d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) peut finalement perturber l’homéostasie cellulaire en causant des dommages à l’ADN, une peroxydation lipidique et une oxydation des protéines. Dans ce contexte, les antioxydants naturels capables d’éliminer les radicaux libres et de réguler l’équilibre redox sont considérés comme des agents prometteurs pour atténuer les dommages oxydatifs et la progression de la maladie15.

Les truffes sont riches en acides gras insaturés, protéines, minéraux, vitamines, acides aminés, phénoliques et polyphénols, des composants associés à des propriétés antimicrobiennes, antioxydantes etanticancéreuses 16,17,18,19,20,21,22,23,24. Leur capacité antioxydante a été liée à leur efficacité dans l’absorption des radicaux libres 25,26,27. Parmi les espèces de truffes, T. claveryi est particulièrement remarquable en raison de sa structure comestible, de sa valeur économique régionale et de sa richesse rapportée en composés phénoliques23. Malgré les preuves émergentes concernant sa consommation traditionnelle et son activité biologique, des études approfondies explorant comment les stratégies d’extraction influencent sa composition chimique et ses effets biologiques restent limitées.

La récupération de composés biologiquement actifs à partir des truffes est fortement influencée par les paramètres d’extraction, notamment la technique d’extraction appliquée et la polarité du solvant. Les méthodes d’extraction biophysiques telles que l’extraction assistée par ultrasons (EAU), l’extraction assistée par macération (MAE) et l’extraction Soxhlet (SE) présentent des différences significatives en termes d’apport énergétique, d’efficacité d’extraction et de sélectivité pour les composéspolaires 28. Cependant, la plupart des recherches se sont appuyées sur une seule méthode d’extraction ou sur des systèmes solvants limités, et les études qui abordent de manière comparative les effets de ces méthodes sur le profil d’activité biologique in vitro de T. claveryi sont limitées. Par conséquent, cette étude compare systématiquement plusieurs méthodes d’extraction biophysique utilisant des solvants de polarité variable afin d’évaluer les activités biologiques in vitro des extraits de T. claveryi . On a émis l’hypothèse que la méthode d’extraction et la polarité du solvant entraîneraient des différences dépendantes de la méthode dans les activités biologiques. En conséquence, les objectifs de l’étude sont : (i) comparer les rendements d’extraction entre différentes méthodes et solvants, (ii) évaluer la variation dépendante de la méthode dans les activités antioxydantes et cytotoxiques, et (iii) examiner les réponses antimicrobiennes et antibiofilms, en tenant compte de leur sensibilité à la stratégie d’extraction.

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Protocol

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REMARQUE : Le flux de travail expérimental global pour la préparation et l’analyse des extraits de T. claveryi est résumé schématiquement à la Figure 1. Tous les matériaux utilisés dans l’étude sont décrits dans le Tableau des Matériaux.

1. Authentification et préparation des matériaux fongiques

  1. Collecte et traitement du matériel
    REMARQUE : Des truffes T. claveryi fraîches ont été récoltées en mai 2023 sur des terres steppiques et sablonneuses non cultivées (non agricoles) de la province de Kırsehir, en Anatolie centrale, en Turquie. Des prélèvements ont été réalisés à trois endroits distincts : le village de Dedeli (38°54′15,8 » N, 34°06′40,3 » E ; ~1050 m d’altitude), le village de Buyukkayapa (38°53′45,1 » N, 34°19′37,5 » E ; ~1020 m d’altitude), et le village d’Akcaagıl (39°01′39,9 » N, 34°12′39,8 » E ; ~1100 m d’altitude). Les sites de collecte se caractérisent par un climat continental semi-aride, avec des hivers froids, des étés chauds et secs, et une précipitation annuelle moyenne d’environ 380 à 420 mm. Tous les échantillons ont été prélevés pendant la saison naturelle de fructification dans des zones sans activité agricole récente afin de minimiser la contamination anthropique potentielle.
    1. Sélectionnez des truffes propres et intactes, épluchez-les, puis lavez-les trois fois à l’eau distillée.
    2. Découpez les échantillons en petits morceaux et séchez à l’ombre jusqu’à obtenir un poids constant (environ 20 jours).
    3. Pulvériser le matériau séché à l’aide d’un moulin mécanique et passer à travers un tamis de 328 microns (50 mailles).
    4. Conservez les échantillons transformés dans des sacs zip-lock dans un environnement frais, sec et sombre à température ambiante jusqu’à des analyses supplémentaires.
  2. Identification moléculaire de T. claveryi
    1. Isoler l’ADN génomique à partir d’échantillons séchés de T. claveryi pour identification moléculaire.
    2. Évaluez la quantité et la pureté de l’ADN par spectrophotométrie.
    3. Effectuer l’identification des espèces par réaction en chaîne par polymérase (PCR) en amplifiant la région interne des espaceurs transcrits (ITS) à l’aide des amorces universelles ITS1 (5′-TCCGTGTGTGAACCTGCGG-3′) et ITS4 (5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′).
    4. Résoudre les produits d’amplification par PCR par électrophorèse sur un gel d’agarose à 1,5 % préparé dans un tampon TAE 1x et visualisé sous éclairage UV après coloration au bromure d’ethidium.
    5. Purifiez les produits PCR à bande unique selon les instructions dufabricant 29. Soumettez les amplicons purifiés au séquençage de Sanger.
    6. Assemblez les lectures de séquences avant et arrière en séquences consensuelles en utilisant l’algorithme du programme d’assemblage contig (CAP).
    7. L’identité de l’espèce a été confirmée par la comparaison de la séquence ITS consensuelle avec les séquences de référence disponibles dans les bases de données publiques.
      REMARQUE : Un échantillon de T . claveryi a été conservé dans la collection de laboratoire pour référence future. L’identification de l’espèce a été confirmée par une analyse moléculaire basée sur l’ITS (Fichier Supplémentaire 1).

2. Préparation et extraction des matériaux fongiques

  1. Préparation des extraits de T. claveryi
    1. Pèse environ 30 g de poudre séchée de T. claveryi .
    2. Ajoutez 150 mL de solvant (méthanol, acétone, n-hexane, acétate d’éthyle ou eau distillée) pour maintenir un ratio solide/liquide constant sur toutes les méthodes d’extraction.
    3. Utilisez des solvants de qualité analytique pour toutes les procédures d’extraction.
    4. Filtrez chaque extrait sous pression réduite à l’aide de papier filtre de qualité.
    5. Concentrez les filtrats sous pression réduite à 30–45 °C à l’aide d’un évaporateur rotatif.
    6. Lyophilisez (lyophilisez) les extraits concentrés jusqu’à ce qu’un retrait complet du solvant soit réalisé.
    7. Conserver les extraits de brut séchés à −20 °C jusqu’à une analyse approfondie.
      REMARQUE : Appliquer des étapes de traitement post-extraction identiques à tous les échantillons afin d’assurer la cohérence méthodologique et la comparabilité.
  2. Méthodes d’extraction biophysique
    1. Extraction assistée par macération (MAE)
      1. Placez l’échantillon en poudre de T. claveryi dans un récipient d’extraction fermé.
      2. Ajoutez le solvant sélectionné tout en maintenant un ratio solvant/solide constant.
      3. Incubez le mélange à température ambiante dans des conditions sombres pendant 72 heures.
      4. Gardez les contenants fermés pour éviter l’évaporation du solvant.
      5. N’appliquez pas d’agitation externe pendant la période de macérération.
      6. Laissez le mélange se déposer à la fin de la période d’extraction.
      7. Filtrez l’extrait avant le traitement supplémentaire.
    2. Extraction de Soxhlet (SE)
      REMARQUE : Assurez-vous d’une bonne circulation de l’eau dans le condenseur et évitez le chauffage à sec pendant le reflux.
      1. Placez l’échantillon en poudre dans un dé à coudre d’extraction de cellulose.
      2. Placez le dé à coudre à coudre à l’intérieur de la chambre d’extraction Soxhlet reliée à une fiole à fond rond.
      3. Ajoutez le solvant sélectionné à la fiole tout en maintenant un rapport solvant/solide constant.
      4. Chauffez le solvant pour le reflux à l’aide d’un manteau de chauffage contrôlé par thermostat.
      5. Maintenez une extraction continue pendant 24 heures.
      6. Maintenir la température d’extraction au point d’ébullition de chaque solvant (n-hexane : 68,7 °C ; acétate d’éthyle : 77,1 °C ; méthanol : 64,7 °C ; acétone : 56 °C ; eau distillée : 100 °C).
    3. Extraction assistée par échographie (EAU)
      REMARQUE : Surveillez la température en continu pour éviter la surchauffe lors de la sonication.
      1. Placez l’échantillon en poudre de T. claveryi dans le récipient d’extraction.
      2. Ajoutez le solvant sélectionné tout en maintenant un ratio solvant/solide constant.
      3. Sonicez le mélange à une fréquence fixe de 35 kHz et une puissance de sortie de 520 W pendant 25 minutes.
      4. Maintenez la température d’extraction à environ 30 °C.
      5. Ajoutez de la glace toutes les 5 minutes pour maintenir la température entre 25 et 28 °C pendant la sonication.
  3. Efficacité d’extraction
    1. Peser le matériau fongique séché (Wp) avant l’extraction.
    2. Peser l’extrait de brut séché (Wext) après un retrait complet du solvant.
    3. Calculez l’efficacité d’extraction à l’aide de l’équation (1).
      figure-protocol-1(1)
    4. Redissoudre chaque extrait de brut séché dans son solvant respectif pour préparer une solution standard à une concentration standardisée de 10 mg/mL.
    5. Préparez les solutions de stock fraîchement avant chaque expérience de bioactivité in vitro .
      REMARQUE : Standardiser toutes les concentrations d’extraits afin d’assurer un dosage comparable sur les tests de bioactivité ultérieurs.

3. Détermination de l’activité antioxydante

  1. Effectuer une analyse de l’activité antioxydante à l’aide des tests DPPH, ABTS et FRAP.
  2. Préparez cinq concentrations d’extraits différentes, allant de 0,25 à 1,0 mg/mL, à partir de solutions de fonds fraîchement préparées.
  3. Effectuez toutes les mesures en triple exemplaire pour garantir la reproductibilité.
  4. Enregistrez les valeurs d’absorbance spectrophotométriquement à l’aide d’un lecteur de microplaques.
    REMARQUE : Effectuer tous les tests selon les protocoles de la littérature établie avec des modifications mineures.
  5. Activité de récupération radicale DPPH
    REMARQUE : L’activité de récupération radicale DPPH des extraits de T. claveryi a été évaluée selon la méthode décrite dans la littérature, avec des modificationsmineures 30. Protégez la solution DPPH et les mélanges de réaction de l’exposition à la lumière.
    1. Préparez une solution DPPH à 70 % de méthanol.
    2. Ajustez la solution DPPH à une absorbance de 1,00 ± 0,02 à 517 nm.
    3. Pipeter 50 μL d’extrait à différentes concentrations dans un puits de microplaque.
    4. Ajoutez 250 μL de solution DPPH à chaque puits.
    5. Incubez le mélange de réaction dans le noir à température ambiante pendant 30 minutes.
    6. Mesurez l’absorbance à 517 nm à l’aide d’un spectrophotomètre à microplaques.
    7. Utilisez le méthanol comme témoin négatif et l’acide ascorbique comme témoin positif.
    8. Construisez des courbes dose-réponse et calculez les valeurs IC₅₀ pour quantifier l’activité de récupération radicale.
  6. Activité de récupération radicale cationique ABTS
    REMARQUE : Effectuer le test de récupération radicale ABTS selon la méthode décrite dans la littérature, avec des modificationsmineures 31. Préparez la solution radicale ABTS⁺ au moins 16 heures avant l’utilisation et protégez-la de la lumière.
    1. Générez la solution radicale ABTS en incubant le mélange réactionnel dans l’obscurité à température ambiante pendant 16 heures.
    2. Diluez 1 mL de solution d’ABTS avec 80 mL d’éthanol avant l’analyse.
    3. Ajustez l’absorption de la solution ABTS diluée à 0,80 ± 0,02 à 734 nm.
    4. Pipeter 50 μL d’extrait à différentes concentrations dans un puits de microplaque.
    5. Ajoutez 250 μL de solution ABTS à chaque puits.
    6. Faites couver le mélange à température ambiante pendant 10 minutes.
    7. Mesurez l’absorbance à 734 nm à l’aide d’un spectrophotomètre à microplaques.
    8. Construis des courbes dose-réponse et calcules les valeurs IC₅₀.
  7. Essai antioxydant pour réduction ferrique (FRAP)
    REMARQUE : Effectuez le test FRAP selon la méthode proposée dans la littérature, avec des modificationsmineures 32. Préparez le réactif FRAP fraîchement avant utilisation et protégez le mélange de réaction de la lumière.
    1. Préparez le réactif FRAP selon le protocole référencé.
    2. Pipeter 20 μL d’extrait à différentes concentrations dans un puits de microplaques.
    3. Ajoutez 280 μL de réactif FRAP fraîchement préparé.
    4. Incubez le mélange de réaction à température ambiante dans le noir pendant 45 minutes.
    5. Mesurez l’absorbance à 593 nm à l’aide d’un spectrophotomètre à microplaques.
    6. Générez une courbe d’étalonnage en utilisant Trolox comme standard.
    7. Exprimez la capacité antioxydante en mg d’équivalents Trolox (TE) par gramme d’extrait.

4. Analyse de la teneur en phénoliques totale (TPC)

REMARQUE : Déterminer la teneur en phénoliques totale (TPC) des extraits de T. claveryi en utilisant la méthode de Folin–Ciocalteu telle que décrite dans la littérature, avec de légères modifications33. Protégez les mélanges de réaction de la lumière pendant l’incubation. Préparez la solution de carbonate de sodium fraîchement avant utilisation.

  1. Préparez des solutions extraites à une concentration de 1 mg/mL à partir de solutions de bouillon fraîchement préparées.
  2. Pipeter 25 μL d’extrait dans un puits de microplaques, ajouter 75 μL d’eau distillée, puis ajouter 25 μL de réactif Folin–Ciocalteu.
  3. Faites couver le mélange à température ambiante pendant 6 minutes.
  4. Ajoutez 100 μL de solution de carbonate de sodium à 7 % (p/v) dans chaque puits.
  5. Incubez le mélange de réaction à température ambiante dans l’obscurité pendant 90 minutes.
  6. Mesurez l’absorbance à 665 nm à l’aide d’un spectrophotomètre à microplaques.
  7. Préparez une courbe d’étalonnage en utilisant l’acide galoi comme étalon et calculez la teneur phénolique totale, en exprimant les résultats en mg d’équivalents d’acide galoi (GAE) par mL d’extrait.

5. Analyse phytochimique utilisant LC-MS/MS

REMARQUE : Effectuer une analyse LC-MS/MS selon des méthodes chromatographiques précédemment publiées avec des modificationsmineures 34. Filtrez tous les échantillons et phases mobiles à travers des filtres membranaires de 0,22 μm et dégazez les phases mobiles avant l’analyse.

  1. Sélectionnez l’extrait présentant la plus forte teneur totale en phénoliques pour un profilage phytochimique quantitatif.
  2. Effectuer la séparation chromatographique à l’aide d’une colonne C18 en phase inversée maintenue à 30°C.
  3. Préparez la phase mobile composée de (A) 0,1 % d’acide formique dans l’eau déionisée et (B) 0,1 % d’acide formique dans l’acétonitrule, réglez le débit à 0,4 mL/min, ajustez le volume d’injection à 5 μL, et fixez le temps total de fonctionnement à 17 min.
  4. Effectuer la détection par spectrométrie de masse sous des conditions d’ionisation par électropulvérisation (ESI) en utilisant l’azote comme gaz de séchage, de gaine et de nébulisation.
  5. Régler la température du gaz de séchage à 350 °C avec un débit de 12 L/min, régler la température du gaz de gaine à 250 °C avec un débit de 5 L/min, et ajuster la pression du nébuliseur à 55 psi.
  6. Préparez des courbes d’étalonnage externes pour chaque étalon phénolique et quantifiez les analytes à l’aide des courbes d’étalonnage correspondantes.

6. Test d’activité antimicrobienne

REMARQUE : Évaluer l’activité antibactérienne en utilisant la méthode de diffusion des puits d’agar selon les protocoles microbiologiques établis. Effectuer toutes les procédures microbiologiques dans des conditions aseptiques dans une armoire de biosécurité. Stérilisez tous les matériaux avant et après utilisation.

  1. Sélectionnez les souches suivantes pour les tests antimicrobiens : Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Escherichia coli ATCC 25922, Staphylococcus aureus ATCC 25923, Enterococcus faecalis ATCC 29212, Bacillus cereus ATCC 14579, Staphylococcus epidermidis ATCC 12228, Listeria monocytogenes ATCC 19115, Acinetobacter baumannii ATCC 17978, Shigella dysenteriae ATCC 13313, Klebsiella pneumoniae ATCC 13883, et Enterobacter aerogenes ATCC 13048.
  2. Inoculez chaque souche bactérienne dans un bouillon de soja tryptone (TSB) et incubez à la température optimale de croissance jusqu’à atteindre une densité optique OD₆₀₀ = 0,7.
  3. Étalez les cultures bactériennes uniformément sur les plaques d’agar de soja tryptone (TSA) à l’aide d’un écouvillon stérile.
  4. Percer des puits aseptiquement dans l’agar à l’aide d’un foreur en liège stérile.
  5. Ajoutez 100 μL de chaque extrait (100 μg/mL) dans les puits correspondants.
  6. Incubez les plaques à 37 °C pendant 18 heures.
  7. Mesurez les diamètres des zones d’inhibition entourant chaque puits afin d’évaluer l’activité antimicrobienne.
  8. Effectuez toutes les expériences en triple exemplaire et exprimez les résultats en valeurs moyennes.

7. Inhibition du biofilm

REMARQUE : Évaluer l’activité anti-biofilm à l’aide d’un test de coloration violette cristalline par rapport aux souches bactériennes de référence. Effectuer toutes les interventions dans des conditions aseptiques et éviter de perturber les biofilms collés lors des étapes de lavage.

  1. Sélectionnez Escherichia coli ATCC 25922 et Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 comme souches de référence et cultivez-les dans TSB à 37 °C jusqu’à atteindre la phase de croissance logarithmique.
  2. Ajustez les suspensions bactériennes à une densité optique de OD₆₀₀ = 0,132.
  3. Pipettez 100 μL de solutions d’extrait (0,625–10 mg/mL) dans des plaques microtitères stériles en polystyrène à 96 puits, ajoutez 100 μL de suspension bactérienne à chaque puits, puis mélangez délicatement.
  4. Incubez les plaques à 37 °C pendant 24 heures. Utilisez des puits contenant uniquement du TSB comme blancs et des puits contenant des suspensions bactériennes sans extrait comme témoins.
  5. Retirez soigneusement les cellules non adhérentes, lavez les puits deux fois avec de l’eau distillée, puis laissez les plaques sécher à l’air.
  6. Ajoutez 200 μL de solution de violette cristalline à 0,4 % (p/v) dans chaque puits et faites couver pendant 30 minutes.
  7. Enlevez l’excès de tache, rincez les puits deux fois avec de l’eau distillée, et laissez les plaques sécher complètement.
  8. Ajoutez de l’éthanol pour solubiliser le colorant lié et mesurez l’absorption à 595 nm à l’aide d’un lecteur de microplaques.
  9. Calculez l’activité de l’antibiofilm à l’aide de l’équation (2).
    figure-protocol-2(2)

8. Analyse de culture cellulaire et d’activité cytotoxique (test MTT)

REMARQUE : Évaluer les effets cytotoxiques à l’aide du test MTT selon les protocoles standards de viabilité cellulaire. Effectuer toutes les procédures dans des conditions stériles dans un cabinet de biosécurité et préchauffer les milieux et réactifs à 37 °C avant utilisation.

  1. Obtenir la lignée cellulaire de neuroblastome humain SH-SY5Y dans un dépôt cellulaire accrédité et cultiver les cellules dans le milieu Eagle modifié (DMEM) de Dulbecco, complété avec 10 % de sérum fœtal bovin (FBS), 1 % de pénicilline/streptomycine et 1 % de L-glutamine dans25 cm de 2 flasques de culture.
  2. Maintenir les cultures à 37 °C dans une atmosphère humidifiée contenant 5 % deCO2 et faire croître les cellules jusqu’à environ 80 % de confluence.
  3. Détacher les cellules par trypsinisation, les semer en plaques de 96 puits à une densité de 2 × 104 cellules par puits, puis incuber pendant 24 heures pour permettre l’attachement.
  4. Traiter les cellules avec des extraits de T. claveryi à des concentrations de 150, 300, 600, 1200 et 2000 μg/mL et incuber pendant 24 heures.
  5. Retirez le milieu de culture, ajoutez 100 μL de milieu frais contenant 10 μL de solution MTT à chaque puits, puis incubez pendant 4 h à 37 °C.
  6. Aspirez le milieu, dissoudez les cristaux de formazan en ajoutant 100 μL de diméthylsulfoxyde (DMSO) à chaque puits, et mesurez l’absorption à 570 nm à l’aide d’un spectrophotomètre à microplaques.
  7. Effectuez toutes les expériences en triple exemplaire.

figure-protocol-3
Figure 1 : Aperçu schématique du flux de travail expérimental. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

9. Analyse statistique

  1. Effectuer des analyses statistiques à l’aide de logiciels statistiques appropriés et comparer les groupes témoins et de traitement à l’aide du test t de Student ou de l’analyse bidirectionnelle de la variance (ANOVA), selon le cas.
  2. Exprimez toutes les données sous forme de moyenne ± d’erreur standard de la moyenne (SEM).
  3. Définissez la signification statistique à p < 0,05.
  4. Indiquez la signification statistique dans les chiffres à l’aide d’astérisques comme suit : **** pour p < 0,0001, *** pour p < 0,001, ** pour p < 0,01, et * pour p < 0,05, et utiliser « ns » pour indiquer la non-signification.

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Results

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Identification moléculaire de T. claveryi
L’amplification par PCR de la région ITS a été réalisée à l’aide des amorces universelles ITS1 et ITS4 pour l’identification moléculaire de T. claveryi. Les séquences résultantes ont été analysées et comparées aux séquences de référence de la base de données NCBI à l’aide de l’algorithme BLAST, permettant une identification définitive des espèces (fichier supplémentaire 1).

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Discussion

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La présente étude établit une plateforme comparative et standardisée d’extraction–bioactivité pour T. claveryi, démontrant que la stratégie d’extraction est un déterminant décisif à la fois de la composition chimique et de la fonctionnalité biologique. La principale force méthodologique de ce protocole réside dans le contrôle strict des paramètres d’extraction, en particulier le ratio solide-liquide fixe, le volume standardisé de solvant, le traitement post-extraction identique ...

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Disclosures

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Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent. Toutes les données soutenant les résultats de cette étude sont disponibles dans le manuscrit principal et dans les fichiers d’informations complémentaires. Les ensembles de données générés et analysés lors de l’étude en cours sont disponibles auprès de l’auteur correspondant sur demande raisonnable.

Acknowledgements

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Les auteurs ont déclaré que cette étude n’a reçu aucun soutien financier.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Plaques micro-titrées en polystyrène à 96 puitsNest Scientific701001Culture cellulaire / plaques d’essai
ABTS (acide 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonique))Sigma-AldrichA3219Essai de récupération radical cationique
Acétone (qualité analytique)Sigma-Aldrich179124Solvant d’extraction
Acétonitrile (grade LC-MS)Sigma-Aldrich34851Phase mobile organique
Acinetobacter baumanniiATCCManassas, VA, États-UnisATCC 17978
Triple Quad LC-MS/MS avec système UPLC 1290 InfinityAgilent Technologies6460Analyse quantitative
Colonne analytique (C18, 4,6 et fois 100 mm, 3,5 et mu ; m)Technologies Agilent (Zorbax)959990-902Colonne à phase inversée
Standards antioxydants (acide ascorbique / Trolox)Sigma-AldrichA7506 / 238813Contrôles positifs
Analyseurs d’ADN Applied Biosystems 3730xlApplied Biosystems  ;Analyseurs d’ADN 3730xlSystème de séquençage de l’ADN
Biosystèmes appliqués et commerce ; BigDye&trade ; Kit de séquençage de cycle Terminator v3.1Applied Biosystems  ;4337455Kit de séquençage Sanger
Bacillus cereusATCCManassas, VA, États-UnisATCC 14579
Analyse bioinformatique, logiciel BioEdit, algorithme utilisé : assemblage CAP contigIbis BiosciencesNALogiciel d’assemblage de séquences
Dé à coudre d’extraction de celluloseFisherbrand et commerce ;   ;11724043Utilisé pour l’extraction des Soxhlet
Diméthylsulfoxyde (DMSO)Merck102952Solvant
Kit d’isolement ADN (Plant & Plant & Kit d’isolement de l’ADN des champignons (Pologne) )EurX GeneMATRIXE3595Isolation ADN  ;
DPPH (2,2-diphényl-1-picrylhydrazyle)Sigma-AldrichD9132Essai radical de récupération
Eagle Medium modifié de DulbeccoCapricorne,   ;DMEM-HA
Enterobacter aerogenesATCCManassas, VA, États-UnisATCC 13048
Enterococcus faecalisATCCManassas, VA, États-UnisATCC 29212
Escherichia coliATCCManassas, VA, États-UnisATCC 25922
ÉthanolMerck100983Solvant
Acétate d’éthyleMerck109623Solvant d’extraction
Sérum fœtal bovin (FBS)Capricorn ScientificFBS-16A
Kit de séquençage de cycles BigDyeTerminator v3.1ThermoFisher4337455Kit de séquençage
Réactif de Folin-CiocalteuSigma-Aldrich & nbsp ;47641Teneur phénolique totale
Acide formiqueSigma-Aldrich & nbsp ;33015Additif de phase mobile
Acide gauloisCarlo Erba406335Courbe d’étalonnage
Plante MATRIX Génétique & Kit d’isolement de l’ADN fongiqueEurX  ;E3595Kit d’isolation ADN
GraphPad Prism (v9)Visualisation des données et analyse statistiqueN/AAnalyse statistique
Chauffant le manteauÉlectrothermal  ;EME30500Utilisé pour maintenir le reflux des solvants
HighPrep et commerce ; Système de nettoyage PCRMAGBIOAC-60005
GlaceQualité laboratoire&mdash ;Contrôle de la température aux Émirats arabes unis
Klebsiella pneumoniaeATCCManassas, VA, États-UnisATCC 13883
L-glutamineCapricorn ScientificAllemagne
Listeria monocytogenesATCCManassas, VA, États-UnisATCC 19115
LyophiliseurScientzN/ALyophilisation des extraits
Bille magnétique & trait de trait ; système de nettoyage PCR baséMAGBIOAC-60005PCR
MéthanolMerck106009Solvant d’extraction
n-HexaneMerck103701Solvant d’extraction
Pénicilline/StreptomycineCapricorn ScientificAllemagne
Pseudomonas aeruginosaATCCManassas, VA, États-UnisATCC 27853
Papier filtre (n° 541)Cytiva1541-125 VDans le processus de filtration par extraction
Évaporateur rotatifBuchi R10011100V101Élimination des solvants
Shigella dysenteriaeATCCManassas, VA, États-UnisATCC 13313
Carbonate de sodiumMerck106392Analyse phénolique totale
SPECTROstar Nano Microplate Reader  ;BMG LabtechMesures d’absorbance
Staphylococcus aureusATCCManassas, VA, États-UnisATCC 25923
Staphylococcus epidermidisATCCManassas, VA, États-UnisATCC 12228
Logiciel d’analyse statistique (SPSS, v23)Analyse des donnéesNA
Thermo Scientific Nanodrop 2000  ;Thermo Fisher ScientificND-2000
Agar de soja à tryptone (TSA)MerckAllemagne&mdash ;
Bouillon de soja à la tryptone (TSB)MerckAllemagne&mdash ;
Homogénéiseur ultrasoniqueScientzSCIENTZ-650LExtraction assistée par ultrasons

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