Les souris mâles C57BL/6J et BALB/c (mâles, 6-8 semaines, 25-28 g de poids corporel) ont été maintenus dans des conditions spécifiques sans agents pathogènes. Toutes les procédures expérimentales ont été menées conformément aux protocoles approuvés par le Comité d’éthique animale de l’hôpital de Fuwai (Approbation n° : 0108-7-800-ZX(X)-019).
Visualisation et ablation des vaisseaux lymphatiques cardiaques chez la souris
Pour simuler un dysfonctionnement lymphatique cardiaque, les principaux vaisseaux lymphatiques cardiaques ont été ablés par électrocautérage.
Toutes les souris ont été anesthésiées par injection intraperitonéale de tribromoéthanol à 1,25 % à une dose de 0,2 mL pour 10 g de poids corporel et ventilées mécaniquement tout au long de la procédure. Après anesthésie au tribromoéthanol, les souris BALB/c ont subi une intubation endotrachéale à l’aide d’un cathéter de calibre 22 et ont été connectées aux électroélectrocardiogrammes (ECG) (Figure 1A, Figure supplémentaire S1). Dans les paramètres du ventilateur, le ratio respiratoire était fixé à 1:1 ou 1:2, avec un volume de marée de 0,3 mL et un rythme respiratoire de 100 respirations/min. Après avoir connecté le cathéter au ventilateur, l’état de la souris était étroitement surveillé ; L’intubation était considérée comme réussie si la fréquence respiratoire de la souris correspondait à celle du ventilateur, tandis que des taux irréguliers ou une distension abdominale indiquaient une défaillance nécessitant une réintubation. Une thoracotomie a ensuite été pratiquée dans l’espace intercostal gauche 3-4 avec une incision d’environ 1 cm, et un écarteur a été utilisé pour exposer l’ensemble du cœur (Figure 1B). Par la suite, 5 μL de colorant bleu d’Evans ont été injectés intramusculairement dans l’apex cardiaque pour visualiser les vaisseaux lymphatiques, avec une période d’attente d’une minute après l’injection pour permettre une opacification complète (Figure 1C, E ; Figure supplémentaire S2A-B), notant que le bleu d’Evans doit être injecté très lentement. Après visualisation, la localisation des principaux vaisseaux lymphatiques cardiaques a été confirmée en comparant avec les données anatomiques précédemmentrapportées 17,18, et l’ablation a été réalisée à l’aide d’un stylo électrocautéraire réglé à 10 W en mode continu, avec un temps de coagulation d’environ 3 à 7 secondes (Figure 1D,F). L’électrocardiographie (ECG) était surveillée avant et après l’ablation afin de garantir l’absence de lésion vasculaire (Figure 1G,H). Enfin, après une ablation lymphatique majeure, les souris ont été héparinées en préparation d’une prélèvement cardiaque ultérieur par donneur. Une représentation schématique de la procédure chirurgicale est présentée à la Figure 2.
Transplantation hétérotope cardiaque abdominale
La transplantation cardiaque hétérotopique dans la cavité abdominale de souris a été réalisée comme décritprécédemment 19. Un bref protocole est résumé ci-dessous :
Procédure par donneur
Une laparotomie a été réalisée le long de la ligne alba chez des souris BALB/c, et 1 mL de solution physiologique à 50 U/mL à 4 °C a été injecté dans la veine cave inférieure, tandis que l’aorte abdominale a été sectionnée pour induire une héparinisation systémique. Après cela, le cœur a été exposé, et 8-0 Des points de suture étaient utilisés pour ligater la veine cave supérieure gauche et droite, qui étaient ensuite sectionnées à l’extrémité distale des points (Figure 3A,B). Par la suite, l’aorte a été isolée du tissu adipeux environnant et coupée près de l’arc aortique (Figure 3C), et une procédure similaire a été réalisée pour isoler et transecter l’artère pulmonaire (Figure 3D). La veine cave inférieure du segment thoracique a été ligaturée avec 8-0 des sutures et des coupes à l’extrémité distale (Figure 3E), après quoi les veines pulmonaires ont été ligaturées et transsectées à l’aide de sutures tressées en soie 7-0 (Figure 3F). Enfin, le cœur du donneur excisé a été conservé dans une solution physiologique à 4 °C pour une transplantation ultérieure, tous les cœurs étant conservés pendant la même durée d’environ 30 minutes afin d’assurer la cohérence expérimentale.
Procédure du receveur
Anesthésiez les souris receveuses de C57BL/6J en préparation d’une transplantation de cœur abdominal. Une laparotomie a été réalisée le long de la ligne alba pour exposer l’aorte abdominale et la veine cave inférieure de la souris receveuse (Figure 4A). Après avoir ligaturé les vaisseaux des branches dorsales de la veine cave inférieure avec des sutures en nylon 10-0, des pinces vasculaires ont été utilisées pour obstruer le flux sanguin à travers l’aorte abdominale et la veine cave inférieure (Figure 4B). Par la suite, une fenêtre a été créée dans l’aorte abdominale et la veine cave inférieure de la souris recevrice, et le sang a été purgé des vaisseaux avec du sérum d’héparine. À l’aide de sutures en nylon 11-0, une anastomose latérale a été réalisée pour relier l’artère pulmonaire du cœur donneur à la veine cave inférieure du receveur et l’aorte du cœur donneur à l’aorte abdominale du receveur (Figure 4C-E). Enfin, les pinces vasculaires ont été libérées pour rétablir le flux sanguin vers la souris receveuse (Figure 4F).
Conception expérimentale
Groupe expérimental : Les vaisseaux lymphatiques cardiaques chez les souris BALB/c ont été visualisés à l’aide d’un colorant bleu Evans et ablés avec un stylo électrocautérique. Les cœurs de souris BALB/c avec vaisseaux lymphatiques ablés ont été transplantés dans des souris C57BL/6J.
Groupe témoin : Les vaisseaux lymphatiques cardiaques chez les souris BALB/c ont été visualisés à l’aide d’un colorant Evans Blue, mais aucune ablation n’a été réalisée. Les cœurs des souris BALB/c ont été transplantés dans des souris C57BL/6J.
Dans cette étude, la taille de l’échantillon a été standardisée à travers tous les groupes expérimentaux et les moments temporels, avec n=5 souris par groupe pour les tests réalisés 24 heures après la transplantation cardiaque, n=5 par groupe pour les tests 7 jours après la transplantation, et n=5 par groupe pour l’observation du temps de survie des greffons cardiaques.
Les cœurs de donneurs prélevés ont été conservés dans une solution salée glacée à 4 °C pendant 30 minutes avant la transplantation cardiaque. Les cœurs de donneurs expérimentaux et du groupe témoin ont été maintenus en solution saline pendant la même durée.
La durée du battement des greffons cardiaques était évaluée quotidiennement par palpation dans les deux groupes (n=5 par groupe).
Évaluation histologique et évaluation du rejet parenchymateux (PR)
Les échantillons de tissu myocarde ont subi une fixation à 10 % de formol pendant 48 heures, suivie d’une déshydratation par une série éthanol graduée (70 %, 80 %, 95 %, 100 %), un dégagement du xylène, un plongement par paraffine et un coupe microtome (4 μm), avec des sections résultantes colorées à l’aide d’hématoxyline et d’éosine (H&E). Le rejet du greffon a été évalué à l’aide du score PR pour la transplantation cardiaque, et le degré de la lésion du greffon a été évalué de manièreaveugle 20.
Examen échocardiographique
La fonction cardiaque a été évaluée à l’aide du système d’échographie (transducteur sonde 40 MHz 550). Les souris étaient placées en position allongée sur une plateforme animale rotative à 360 degrés. Après l’ablation des poils abdominaux, la fonction cardiaque a été évaluée sous anesthésie isoflurane à 1,0 %. La fraction d’éjection (FE) de la greffe cardiaque a été mesurée par échocardiographie en mode M.
Détection des marqueurs de lésions myocardiques
L’étendue des lésions tissulaires myocardiques a été évaluée en mesurant l’expression d’enzymes spécifiques aux cardiomyocytes dans le sérum. Les niveaux de troponine I (cTnI) cardiaque ont été analysés selon les instructions du fabricant.
Plaque western
À 24 heures après la transplantation cardiaque, le tissu myocarde des principales régions des vaisseaux lymphatiques des greffes cardiaques a été prélevé, tant dans les groupes témoin qu’expérimental. Conformément auprotocole 21 décrit précédemment, l’expression des marqueurs associés aux vaisseaux lymphatiques a été analysée. Les tissus cardiaques ont été soigneusement lysés dans un tampon de lyse RIPA contenant des inhibiteurs de protéases (phénylméthane sulfonylefluorure). Avant la dénaturation thermique, la concentration en protéines était déterminée à l’aide d’un kit BCA et ajustée à une concentration uniforme. La protéine totale de chaque groupe était séparée via SDS-PAGE puis transférée sur une membrane PVDF. La membrane PVDF a été bloquée avec 5 % de lait écrémé (température ambiante pendant 1 à 2 heures) puis incubée toute la nuit à 4 °C avec les anticorps primaires respectifs. Le lendemain, la membrane a été traitée avec un anticorps secondaire (anti-lapin, 1:1000) à température ambiante pendant 30 minutes. Les bandes membranaires ont été incubées avec une solution ECL (1-2 mL) et exposées pour capturer les images.
Les anticorps utilisés étaient les suivants : anticorps polyclonal LYVE1 (1:500), anticorps contre la podoplanine (1:500) et récepteur anti-VEGF 3 (1:50).
Analyse statistique
Tous les résultats sont exprimés en moyenne ± erreur standard de moyenne (MEB). Lors de la comparaison entre deux groupes, des analyses statistiques ont été réalisées à l’aide du test t de Student ou du test Wilcoxon de somme des rangs, selon la répartition des données et les caractéristiques. La signification statistique a été définie comme p < 0,05.