Article de méthode

Visualisation en temps réel de l’impact des milieux nutritifs sur le développement de biofilms de Pseudomonas aeruginosa à l’aide d’un système microfluidique

DOI :

10.3791/69997

⸱

15 mai 2026

 ,  , 
1School of Mechanical, Aerospace and Civil Engineering, University of Sheffield, 2School of Chemical, Materials and Biological Engineering, University of Sheffield

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce protocole évalue l’influence des compositions de milieux nutritifs riches (TSB) et minimales (FAB) sur le développement des biofilms de Pseudomonas aeruginosa PAO1 et PA14 dans un environnement d’écoulement à régime stationnaire dans un microcanal.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La bactérie pathogène Pseudomonas aeruginosa est une cause majeure de nombreuses infections nosocomiales, et sa résistance antimicrobienne croissante en fait une menace importante pour la santé publique. Cet article présente un protocole complet détaillant l’utilisation d’un système microfluidique pour la visualisation et la quantification en temps réel du développement de biofilms dans deux souches clés de P. aeruginosa , PAO1 et PA14. La méthode utilise des plaques microcanaux optiquement transparentes et multicanaux pour soumettre les cultures bactériennes à un flux continu et constant de mieux, y compris le bouillon de soja tryptique (TSB) ou le bouillon anaérobie minimal méticuleux modifié (FAB) avec des concentrations de carbone variables, imitant ainsi les conditions des environnements cliniques. Sur une période de 24 heures, l’imagerie automatisée en temps réel capture la croissance et la maturation des biofilms sous forme de couverture superficielle, d’épaisseur et de rugosité de surface du biofilm de manière hautement reproductible. L’objectif expérimental est d’utiliser les résultats pour démontrer que la formation de biofilms pour les deux souches est significativement influencée par des changements dans la composition du milieu nutritif. L’objectif de ce protocole visualisé est de fournir une méthode permettant aux chercheurs d’étudier la dynamique des biofilms dans des conditions de flux laminaire stable, et les connaissances obtenues pourraient être exploitées pour développer des stratégies alternatives non antimicrobiennes afin d’éradiquer les biofilms précoces de P. aeruginosa dans des contextes nosocomiaux.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L’objectif de cette méthode est d’observer l’impact de deux milieux culturels différents, à savoir le bouillon de soja tryptique (TSB) et le bouillon anaérobie minimal méticuleux modifié (FAB), sur la croissance du biofilm de deux souches de Pseudomonas aeruginosa , à savoir PAO1 et PA14. Bien que P. aeruginosa PAO1 et PA14 soient toutes deux des souches de référence en laboratoire courantes, la souche PA14 infecte une plus grande proportion d’hôtes, des plantes auxinvertébrés 1. Le bouillon nutritif TSB est un milieu de culture polyvalent contenant 2,5 g/L de glucose comme source de carbone et peut cultiver une large gamme de bactéries grâce à sa composition de caséine et de peptones de soja pour l’azote organique et une source naturelle de sucre, ainsi que du chlorure de sodium pour maintenir l’équilibreosmotique 2. Le milieu minimal de la FAB, en revanche, est formulé avec des concentrations minimales (réduction de 50 fois) d’une seule source de carbone, à des niveaux de 0,05 g/L afin d’explorer les besoins de croissance des bactéries anaérobies. Les déformations PAO1 et PA14 ont toutes deux été exposées à un écoulement laminaire unidirectionnel, entraînant une contrainte de cisaillement de paroi basse de 0,01 Pa. Cette valeur de contrainte de cisaillement est souvent présente dans les zones colonisées par P. aeruginosa, y compris les bronches des patients atteints de mucoviscidose et le tractus gastro-intestinal. La croissance du biofilm a été mesurée sur une période de 24 heures en évaluant en temps réel le pourcentage de couverture de surface du biofilm, l’épaisseur et la moyenne arithmétique de la rugosité de la surface.

Les biofilms de P. aeruginosa sont responsables d’un pourcentage significatif d’infections nosocomiales et constituent une cause majeure de décès chez les personnes atteintes de mucoviscidose 3,4,5. Des recherches antérieures sur l’impact des niveaux de sources de carbone sur le développement de biofilms bactériens ont négligé le rôle crucial de l’écoulement hydrodynamique lors du développement du biofilm, utilisé des valeurs de contrainte de cisaillement qui ne sont pas représentatives des sites d’infection par P. aeruginosa, ou n’ont mené que des analyses cinétiques et morphologiques de biofilmspost-expérience 6,7. Ces limitations sont abordées dans cette méthode en utilisant l’imagerie en temps réel du développement de biofilms, dans des conditions de flux stationnaire au sein d’un canal microfluidique qui reproduit étroitement les environnements physiologiques des patients atteints de mucoviscidose.

Cette méthode offre des avantages significatifs par rapport aux techniques alternatives utilisées pour étudier le développement du biofilm. L’application d’imagerie en temps réel pendant la période de croissance du biofilm de 24 heures garantit que le biofilm en développement n’est pas perturbé, car aucun séchage ou modification chimique n’est nécessaire, évitant ainsi des modifications de sa composition et obtenant des résultats plus représentatifs que les méthodes nécessitant la manipulationde l’échantillon 8. De plus, en appliquant des conditions d’écoulement hydrodynamique stable et en variant les concentrations de carbone sur une grande amplitude, cette procédure reproduit plus précisément les environnements physiologiques présents sur les sites d’infections nosocomiales à P. aeruginosa. Cela en fait une méthode plus représentative que celles utilisant des tests statiques, tels que les plaques micro-titrage à 96 puits ou les coupons, qui ne capturent pas l’impact critique de l’écoulement des fluides sur le développementdu biofilm 9,10,11.

Le dispositif microfluidique utilisé a été spécifiquement choisi car ses dimensions sont similaires à certaines parties du poumon, telles que les bronchioles etles bronches 12. De plus, les infections à P. aeruginosa constituent une préoccupation majeure pour les patients souffrant de brûlures graves, où les niveaux de glucose peuvent fluctuer significativement par rapport à la plagenormale du patient de 13,14.

Bien que ce protocole utilise spécifiquement deux souches de P. aeruginosa, la méthode est également applicable à l’étude du développement précoce d’autres bactéries responsables d’infections ou colonisant des zones dans des conditions similaires. De plus, d’autres compositions de milieux nutritifs ainsi que les conditions d’écoulement (par exemple, écoulements pulsatiles et oscillants, ou valeurs de cisaillement de paroi plus élevées) pourraient également être étudiés selon la même méthodologie.

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Protocole

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Nettoyage de la verrerie

  1. Immergez deux bouteilles en verre de 200 mL destinées au substrat et à l’agar, ainsi que trois bouteilles en verre de 1 L dans un bain à 10 % d’acide chlorhydrique (HCl) pendant environ 5 minutes à température ambiante.
    ATTENTION : L’acide chlorhydrique est corrosif. Effectuer toute la manipulation de l’acide dans une hotte chimique tout en portant un équipement de protection individuelle approprié (blouse de laboratoire, gants et protection oculaire).
  2. Ensuite, retirez la verrerie du bain de HCl et rincez deux fois avec de l’eau du robinet et une fois avec de l’eau distillée (dH 2O).

2. Préparation du média du bouillon de soja tryptique

  1. Préparez la solution TSB, pesez 6 g/200 mL de poudre TSB à l’aide d’un bateau de pesée propre, et une balance de précision.
    REMARQUE : La composition de la poudre de TSB utilisée est la suivante : dextrose (2,5 g∙L-1), phosphate de dipotassium (2,5 g∙L-1), digestion pancréatique de la caséine (17 g∙L-1), digestion papaïque de la farine de soja (3,0 g∙L-1) et chlorure de sodium (5,0 g∙L-1).
  2. Mesurez 200 mL de dH2Oà l’aide d’un cylindre mesureur et versez-les dans l’une des bouteilles en verre déjà nettoyées.
  3. Ajoutez les 6 g de TSB dans la bouteille en verre propre contenant les 200 mL de dH2O, refermez la bouteille hermétiquement et mélangez pendant environ 2 minutes pour dissoudre la poudre, créant ainsi le substrat de solution TSB.
  4. Solution de substrat TSB autoclave pendant 15 à 20 minutes à une température de 121 °C et une pression de 1,5 atm, pour stériliser la solution.
    NOTE : (POINT DE PAUSE) La solution de TSB peut être stockée à température ambiante (environ 20 °C) entre deux utilisations et utilisée pour de futures expériences.

3. Préparation minutieuse du bouillon anaérobie

  1. Préparez la solution FAB de métaux traces de substrat.
    1. Utilisez des bateaux de pesée séparés et propres et une spatule, ainsi qu’une balance de précision pour les masses comprises entre 0,5 et 210 g, et une balance analytique pour les masses comprises entre 0,001 et 0,5 g. Mesurez les composants suivants et leurs quantités : CaSO4,2H 2O(200 mg∙L-1), FeSO4,7H 2O (200 mg∙L-1), MnSO4. H2O (20 mg∙L-1), CuSO 4,5H2O (20 mg∙L-1), ZnSO4,7H 2O (20 mg∙L-1), CoSO4,7H 2O (10 mg∙L-1), NaMoO4. H2 O(10 mg∙L-1), etH 3BO3 (5 mg∙L-1)7,9.
    2. Ajoutez chacun des composants dans une bouteille en verre nettoyée de 1 L contenant 1 L de dH2Oet mélangez soigneusement avec ledH 2O.
    3. Ajoutez 1 mL du mélange à chacune des deux bouteilles en verre stérilisée restantes de 1 L avec 1 L de dH2Oet mélangez soigneusement.
  2. Préparez 20 mM de FAB complétés en citrate de sodium pour des cultures nocturnes
    1. Mesurez les composants suivants et leurs quantités à l’aide de bateaux de pesage propres séparés et d’une spatule, une balance de précision pour la pesée de masses comprises entre 0,5 et 200 g et une balance analytique pour la pesée de masses comprises entre 0,001 et 0,5 g : citrate de sodium (20 mM), (NH4)2SO4 (2 g∙L-1), Na2HPO 4,2H 2O (6 g∙L-1), KH2PO4 (3 g∙L-1), NaCl (3 g∙L-1), MgCl2 (93 mg∙L-1) et CaCl2 (11 mg∙L-1)7,9.
    2. Ajoutez tous les composants dans l’une des bouteilles en verre stérilisé restantes de 1 L contenant 1 L de dH2Oavec 1 mL de solution métallique trace.
    3. Mélangez soigneusement.
  3. Préparez 0,3 mM de FAB complété en glucose pour la croissance du biofilm.
    1. Remplacez les 20 mM de citrate de sodium par 0,3 mM de glucose. Utilisez les mêmes composants et masses énumérés à l’étape 3.2.1.
    2. Dans la bouteille en verre de 1 L nettoyée restante, ajoutez les composants de glucose FAB à 0,3 mM à 1 mL dedH 2Oavec 1 mL de solution de métal trace et mélangez bien.
  4. Autoclave pendant 15 à 20 minutes à une température de vapeur de 121 °C et une pression de 1,5 atm, pour stériliser le milieu.
    NOTE : (POINT DE PAUSE) La solution de médium de fabrication peut être stockée à température ambiante (environ 20 °C) entre deux utilisations et utilisée pour de futures expériences.

4. Préparation de l’agar TSB

  1. Mesurez 8 g/200 mL d’agar TS à l’aide de la balance de précision et des bateaux de pesée lavés et de la spatule.
  2. Mesurez 1 g/200 mL d’agar de qualité bactériologique, sur un bateau de pesée séparé, en utilisant la même balance de précision.
  3. À l’aide d’un cylindre mesureur, mesurez 200 mL de dH2O et versez-les dans la bouteille en verre finale déjà nettoyée.
  4. Verser les deux composants de l’agar dans les 200 mL dedH 2Oet bien mélanger.
  5. Autoclave pendant 15 à 20 minutes à une température de 121 °C et une pression de 1,5 atm, pour stériliser le milieu.
    NOTE : (POINT DE PAUSE) L’agar TSB peut être stockée à température ambiante (environ 20 °C) entre deux utilisations et nécessite une réchauffe avant d’être utilisée dans de futures expériences.

5. Culture de la boîte de Petri par Pseudomonas Aeruginosa

  1. Faites fondre l’agar au micro-ondes pendant environ 5 minutes, ou jusqu’à ce que la solution soit liquide.
  2. Ouvrez et désinfectez une surface d’armoire de sécurité de classe II avec une solution d’éthanol à 70 %, prête à l’emploi. Suivez toutes les étapes ci-dessous dans cette section au sein de ce cabinet de sécurité de classe II.
  3. Mesurez 25 mL de solution d’agar dans un flacon de 50 mL, versez-le dans une boîte de Petri de 90 mm, puis attendez que l’agar prenne.
  4. Récupérer les stocks congelés de P. aeruginosa PAO1 et PA14 du congélateur à -80 °C. Placez les stocks dans l’incubateur à 37 °C pendant environ 5 minutes, ou jusqu’à ce que le contenu soit complètement décongelé.
  5. Trempez la boucle d’inoculation à l’intérieur de l’un ou l’autre des stocks décongelés de P. aeruginosa et étalez l’échantillon sur l’agar.
  6. Répétez l’étape 5,5 pour l’autre souche de P. aeruginosa , créant ainsi deux cultures distinctes de plaques de Petri de P. aeruginosa , l’une avec la souche PAO1 et l’autre avec la souche PA14.
  7. Étiquetez chaque boîte de Petri avec la souche de P. aeruginosa , la date de réveil et les initiales, puis placez en incubateur pendant 16 à 18 heures à 37 °C.
    NOTE : (POINT DE PAUSE) LES BOÎTES DE Petri P. aeruginosa PAO1 et PA14 peuvent être stockées à 4 °C pendant une période de stockage allant jusqu’à 4 semaines et être utilisées pour de futures expériences.

6. Stocks de glycérol de Pseudomonas aeruginosa PAO1 et PA14

  1. Ouvrez et désinfectez une armoire de sécurité de classe II pour une utilisation, sélectionnez huit fioles de 50 mL pour contenir les cultures de nuit.
  2. En utilisant le TSB et le milieu FAB citrate de sodium déjà fabriqués (section 3), versez 5 mL de milieu TSB dans quatre des huit flacons et le milieu FAB minimal au citrate de sodium dans les quatre autres.
  3. En utilisant les boîtes de Petri précédemment incubées et une boucle d’inoculation, touchez cinq colonies distinctes dans la boîte de Petri PAO1 de P. aeruginosa et transférez dans l’un des flacons du TSB. Répétez cela pour le milieu FAB au citrate de sodium et pour la boîte de Petri de la souche P. aeruginosa PA14.
  4. Immergez une boucle d’inoculation propre directement dans les quatre flacons restants de TSB et de citrate de sodium pour les milieux FAB, formant ainsi des témoins.
  5. Incubez les huit flacons dans un incubateur secouant pendant 16 à 18 heures à 200 tr/min et 37 °C et marquez clairement.
  6. Récupérez les fioles de culture, assurez-vous que celles inoculées avec P. aeruginosa sont troubles et que celles utilisées comme témoins restent claires.
  7. Centrifugez les quatre fioles inoculées à P. aeruginosa à 4000 × g pendant 5 minutes à 20 °C afin de séparer P . aeruginosa du milieu de culture. Assurez-vous que la centrifugeuse est équilibrée.
  8. Ignorez le surnageant et remettez en suspension la pellete de P. aeruginosa après centrifugation avec 1 mL de solution contenant 15 % de glycérol, 150 μL de glycérol et 850 μL de TSB frais ou de milieux FAB en citrate de sodium.
  9. Transférez les cultures en suspension dans des flacons de 1 mL et placez-les dans le congélateur à -80 °C.
    NOTE : (POINT DE PAUSE) Les stocks de glycérol peuvent être stockés à -80 °C pour un stockage à long terme et utilisés pour de futures expériences.

7. Mesure de la densité optique des cultures nocturnes

  1. Répétez les étapes 6.1 à 6.5, uniquement pour deux fioles de médium TSB, l’une comme témoin et l’autre avec la souche PAO1 P. aeruginosa .
  2. Pipeter 1 mL de milieu TSB dans un flacon spectrophotomètre de 1 mL, dans une armoire de sécurité de classe II, et transférer 0,9 mL de milieu TSB dans le second flacon, en complétant 0,1 mL de culture nocturne.
  3. Réglez le spectrophotomètre à une longueur d’onde lumineuse de 600 nm et, en utilisant le flacon du spectrophotomètre TSB de 1 mL pour calibrer la machine, mesurez la densité optique du flacon de suspension15 de 0,1 mL.
    1. Si l’absorbance mesurée ne marque pas 0,1, recalculez le volume de suspension nécessaire.
      REMARQUE : Le volume de suspension nécessaire pour atteindre une lecture d’absorbance de 0,1 (V1) peut être calculé en utilisant la lecture initiale de 0,1 mL de l’absorbance du flacon de suspension, C1, l’absorption souhaitée à laquelle la suspension est ajustée, C2, et le volume de suspension concentrée nocturne souhaité, V2 :
      C1V1 = C2V2
      Dans l’exemple ci-dessus, si C1 = 3,59, C2 = 0,1 et V2 = 10 mL, le volume de suspension nocturne souhaité serait de 0,279 mL dans une solution de 10 mL.
  4. Mesurez 10 mL de milieu TSB dans un flacon de 50 mL et retirez le même volume de milieu TSB que le volume de suspension nécessaire pour créer une suspension de 10 mL 0,1 OD 600 nm. En utilisant la culture de nuit, ajoutez le volume de suspension calculé et faites un vortex pendant environ 5 secondes pour mélanger.
  5. Transférez 1 mL de la suspension ajustée de 10 mL dans un flacon spectrophotomètre et mesurez à nouveau l’absorbance pour vous assurer qu’elle est de 0,1.
  6. Répétez les 7,1 à 7,5 ci-dessus pour le milieu PA14 et le milieu TSB, ainsi que pour les souches de P. aeruginosa et le milieu FAB au citrate de sodium.

8. Nombre cellulaire viable

  1. TransférezdH 2Odans une boîte de Petri carrée à l’intérieur d’un cabinet de sécurité de classe II et utilisez une pipette multi-canaux pour transférer 180 μL dans les colonnes 2 à 9 d’une plaque de polystyrènetransparente à 96 puits 16.
  2. Transférez la suspension de 10 mL 0,1 OD 600 dans une boîte de Petri carrée séparée et, à l’aide de la pipette multicanal, transférez 200 μL de la suspension dans la colonne 1 de la plaque en polystyrène à 96 puits.
  3. Transférez plus de 20 μL de suspension à l’aide de la pipette multicanal de la colonne 1 de la plaque de polystyrène à 96 puits vers le canal 2, puis transférez 20 μL de suspension diluée du canal 2 au canal 3, puis répétez jusqu’au canal neuf, créant des dilutions de suspension de 10-1 à 10-8.
  4. Transférez 50 mL d’agar TS (section 4 et étape 5.1), dans un armoire de sécurité de classe II à l’aide d’un flacon, dans une boîte de Petri carrée et laissez jusqu’à ce que l’agar devienne trouble.
  5. Transférez 10 μL de chacun des puits le long des colonnes 2 à 9 sur la planche de Petri en agar TS en formation de colonne, à l’aide d’une pipette multicanal, en veillant à ce que les colonnes ne soient pas en contact entre elles.
  6. Incubez l’agar TS pendant 24 heures à 37 °C, après avoir attendu que les dilutions transférées se soient stabilisées.
  7. Calculez les unités formatrices de colonies (UFC) par millilitre (mL) en déterminant si la boîte de Petri est dénombrable (entre 30 et 300 colonies).
  8. Déterminer le facteur de dilution de la suspension de 10 mL utilisée ; dans ce cas, la suspension a été diluée à 1/10 (0,1 OD 600).
  9. Calculez les facteurs de dilution individuels de chaque colonne placée. Il s’agit de la quantité de suspension diluée ajoutée à chaque colonne divisée par le volume total de la colonne après l’ajout de la suspension. Dans le cas de la colonne 2 de la plaque à 96 puits (colonne 1 de la boîte de Petri), 20 μL/200 μL = 1/10.
  10. Calculez le facteur de dilution de la série totale en multipliant les facteurs de dilution individuels de chaque colonne.
    REMARQUE : Dans ce cas, puisque 20 μL ont été transférés de chaque colonne à la suivante, portant le volume total de chaque puits de colonne à 200 μL, chaque dilution individuelle en série était de 1/10. Faisant ainsi la dilution totale de la série 1 × 10-8.
  11. Déterminez le facteur de dilution du placage au fur et à mesure que la dilution est transférée de la plaque à 96 puits vers la boîte de Petri. Pour déterminer l’UFC/mL, divisez le volume de chaque colonne placée (10 μL) par 1 mL. Dans ce cas : figure-protocol-1.
  12. Déterminez le facteur de dilution final en multipliant le facteur de dilution de suspension original (0,1) par le facteur de dilution en série total (1 × 10-8) et le facteur de dilution du placage (figure-protocol-2).
  13. Calculez la CFU∙mL-1 dans l’échantillon original, multipliez la CFU sur la plaque par l’inverse du facteur de dilution final.
    REMARQUE : Dans ce cas, si l’on comptait 200 CFU, cela signifierait effectuer 200 × 1/1 × 10-8, ce qui donnerait la CFU/mL à 2 × 1010 CFU∙mL-17.

9. Installation du système microfluidique et exécution expérimentale

  1. Inoculez 5 mL de bouillon de milieu de culture avec chaque souche de P. aeruginosa pour former une culture nocturne et incubez pendant 16 à 18 heures à 37 °C.
  2. Installez le système microfluidique et le logiciel associé.
    1. Activez les composants du système microfluidique dans l’ordre suivant : alimentation électrique, contrôleur du système microfluidique, caméra CMOS, chauffages d’enceinte, microscope, ordinateur et moniteurs associés.
    2. Activez le logiciel microfluidique et lancez l’interface du module de contrôle en saisissant le code-barres multicanal associé à la plaque multicanal de 48 puits 0–2 Pa, lorsque demandé, trouvé sur le côté de la plaque multicanal.
  3. Installer la procédure d’inoculation multicanal à plateaux de P. aeruginosa .
    1. Ajustez la densité optique de la culture nocturne à 0,1 OD600.
    2. Transférez 50 μL de suspension 0,1 OD 600 dans le puits de sortie de chacun des six canaux en parallèle, à l’intérieur d’un cabinet de sécurité de classe II.
      REMARQUE : Six canaux ont été exécutés en parallèle à la fois pour maximiser la probabilité d’identification anormale des résultats.
    3. Remplacez le couvercle multicanal à 48 puits et transférez-le sur la scène mobile située à l’intérieur de l’incubateur du système et sécurisez-la.
  4. Préparer la procédure d’inoculation multicanal par canal multicanal P. Aeruginosa .
    1. Semez les canaux microfluidiques à l’aide du module de contrôle du système microfluidique en sélectionnant : Colonnes manuelles > 1–4 > Fluide : TSB à 37 °C > Cisaillement Max (Pa) : 0,1 (1 dyne∙cm-2 = 0,1 Pa) et sélectionnez un puits de sortie du diagramme multicanal 0–2 Pa à 48 puits.
    2. Sélectionnez le bouton d’abandon pour arrêter le flux après 2 à 4 secondes et laissez la plaque pendant 30 minutes, afin de s’assurer que les cellules s’attachent au substrat du canal avant de commencer le flux continu.
      REMARQUE : Une durée de 30 minutes permet à la force gravitationnelle d’aider à adhérer la bactérie planctonique P. aeruginosa à la paroi inférieure du canal. Cette période variera selon la bactérie et le type de milieu nutritif.
    3. Retirez la plaque multicanal de l’étage d’incubateur mobile et transférez 1 mL de TSB frais dans le puits d’entrée de chacun des six canaux d’une armoire de sécurité de classe II.
    4. Transférez la plaque multicanal sur la scène mobile à l’intérieur de l’incubateur et fixez-la en place.
  5. Configurez AutoRun.
    1. Assurez-vous que l’écoulement utilisé tout au long des expériences de 24 heures est pertinent pour l’endroit où P. aeruginosa se trouve dans la nature, en passant à la contrainte de cisaillement manuelle > : 0,01 Pa, et en enregistrant le débit volumique (μL⋅h-1) affiché. Assurez-vous que cette valeur, pour la plaque microcanal de 48 puits, soit de 8,2 μL⋅h-1.
    2. Convertir le débit volumique en m3∙s-1, calculer la section transversale du chenal (m2) et déterminer la vitesse d’écoulement à une contrainte de cisaillement hydrodynamique de 0,01 Pa.
      REMARQUE : En utilisant et en réarrangeant l’équation du débit volumique du fluide, la vitesse du fluide à travers le canal peut être calculée :
      figure-protocol-3
      Où U est la vitesse du fluide (m∙s-1) et A est la section microcanale (m2) des canaux dans la plaque multicanal.
    3. Calculez le nombre de Reynolds d’écoulement en utilisant la densité, ρ, et la viscosité dynamique, μ, du milieu TSB, et assurez-vous qu’il se situe dans une plage d’écoulement fluide où l’on trouve des biofilms de P. aeruginosa . Pour une contrainte de cisaillement hydrodynamique de 0,01 Pa, assurez-vous que le nombre de Reynolds soit 0,0117 et 0,0165 pour les milieux TSB et FAB, respectivement. Si vous êtes en dehors de cette plage, vérifiez que les conditions du fluide sont réglées sur TSB.
      figure-protocol-4
      Où Dh est le diamètre hydraulique du microcanal utilisé, obtenu en utilisant :
      figure-protocol-5
      Où, w, et h, représentent la largeur (m) et la hauteur (m) du microcanal utilisé.
    4. Calculer la longueur de développement du fluide pour garantir que l’écoulement du fluide dans la région d’acquisition de l’image est entièrement développé.
      REMARQUE : La longueur de développement d’un fluide laminaire à travers un canal peut être calculée en utilisant le nombre de Reynolds, Re, et le diamètre hydraulique des canaux, Dh :
      Ldev = 0,06ReDh
    5. Configurez l’auto-run : Modifier AutoRun > Protocole Setup > durée : 24 h, avec une répétition de 1 et une contrainte de cisaillement de 0,01 Pa. Sauvegardez le protocole.
    6. Créer une nouvelle séquence dans l’onglet Configuration de la séquence en appliquant le protocole nouvellement créé avec une répétition, aux canaux 1 à 6 et sélectionnez le fluide : TSB à 37 °C. Sauve cette séquence.
  6. Configurez l’acquisition d’images à l’aide de la fenêtre d’acquisition multidimensionnelle .
    1. Sélectionnez Acquisition Multidimensionnelle via le logiciel système, puis le bouton en direct (en bas à gauche de la fenêtre d’Acquisition Multidimensionnelle ). Naviguez sur la scène du microscope pour visualiser les canaux 1 à 6 en utilisant le bouton de vue en direct et les grossissements de la caméra de 5× à 40× sur l’écran tactile du microscope, affichant un canal dans le champ de vision de la caméra à la fois.
    2. Préparez la caméra pour l’acquisition d’images : Acquisition multidimensionnelle > Sauvegarde : sélectionnez un répertoire pour les images à sauvegarder sur > Timelapse : Durée : 24 h, la même durée que l’écoulement hydrodynamique > Intervalle de temps : Temps entre chaque image acquise, réglé à 10 min.
    3. Saisissez les réglages de l’appareil en sélectionnant Longueur d’onde > Éclairage : champ lumineux 50 % appareil photo 50 % : noir et blanc > exposition automatique : chaque acquisition > acquisition : chaque moment > autofocus : jamais.
    4. Déterminez la position des caméras pour capturer les images du biofilm en réglant le grossissement à 20×, produisant un champ de vision avec des dimensions 665,6 μm × 665,6 μm, puis naviguez vers le centre de la zone de vision, où le numéro de canal sera gravé au centre.
    5. Ajoutez la position de la scène pour qu’elle soit capturée par la caméra, allez dans Stage , étiquetez la position, puis sélectionnez le bouton addition pour l’ajouter au répertoire.
      1. Répétez cela pour les points en amont à 0,9984 mm et les points en aval à 3,0016 mm de l’entrée de la région de vision du canal, où la position représente le point central du champ de vision de la caméra.
        REMARQUE : Ces positions d’imagerie ont été sélectionnées pour fournir des représentations de la croissance du biofilm le long de la zone d’observation, tout en garantissant que le flux à l’intérieur est pleinement développé. Cela entraîne trois images acquises pour chaque microcanal, ce qui donne 18 images prises toutes les 10 minutes.
  7. Effectuer une course expérimentale
    1. Dans la fenêtre du module de contrôle système, sélectionnez AutoRun > Run Setup > Sequence : sélectionnez la séquence 0.01 Pa créée, puis sélectionnez démarrer.
    2. Immédiatement après, naviguez jusqu’à la fenêtre d’Acquisition multidimensionnelle > Acquérir. Cela marque le début de l’acquisition des 18 images toutes les 10 minutes de la procédure expérimentale de 24 heures, produisant 2610 images à la fin de l’expérience.
      REMARQUE : La section ci-dessus a été reproduite sur six microcanaux supplémentaires environ 48 heures après l’expérience initiale avec des conditions identiques.

10. Accumulation de la pile Z

  1. À la fin de chaque essai expérimental, sélectionnez trois canaux et obtenez des piles z de trois sections le long d’eux à un grossissement de 40×, en ouvrant la > d’Acquisition Multidimensionnelle Main : décochez toutes les options sauf « Série Z ».
  2. Naviguez vers la série Z après qu’une section d’un canal ait été sélectionnée dans l’Acquisition multidimensionnelle et modifiez > Paramètres interactifs : Inccrémentement : 0,5 et décochez les deux cases.
  3. Utilisez le bouton de mise au point du microscope et faites-le pivoter jusqu’à ce que le biofilm soit flou, puis saisissez la distance z en sélectionnant Régler le dessus sur le courant. Répétez cette procédure, mais en faisant tourner le bouton de mise au point dans la direction opposée et en sélectionnant Régler Bottom To Current. Cela donne au microscope la portée nécessaire pour capturer la pile z.
  4. Sélectionnez un dossier dans la fenêtre Sauvegarde pour sauvegarder la pile z et sélectionnez Acquérir en bas à droite de la fenêtre pour commencer l’acquisition.

11. Analyse d’images et de données post-expérience

  1. Obtenez des données de couverture de surface en pourcentage de biofilm.
    1. Chargez les images acquises dans le logiciel système en choisissant : Outils d’analyse > Examiner les données multidimensionnelles > sélectionner le fichier de base > sélectionner le répertoire : naviguez vers et sélectionnez le dossier contenant les images enregistrées > Vue > longueur d’onde 1, et dans la section carrée centrale affichant horizontalement le nombre d’images acquises, faites un clic droit sur la petite case grise en haut, coin gauche.
    2. Chargez les images de chaque section de canal, une par une, choisissez la position de la scène : sélectionnez la position pour visualiser > Charger l’image. Enregistrez la série d’images en fichier TIFF.
    3. Limitez l’image en sélectionnant Image Seuil > Seuil Automatique pour les objets sombres mettant en valeur le biofilm, puis bordez l’image avec l’outil Région Rectangulaire .
      REMARQUE : Le curseur sur le côté gauche de l’image à seuil peut être déplacé vers le haut ou le bas pour modifier l’intensité du seuil afin de mieux différencier le biofilm de l’arrière-plan. Si l’image comporte des ombres, contournez la section sans, car les ombres ont pu être mises en évidence par défaut, modifiant ainsi les valeurs de mesure.
    4. Obtenez des données sur le pourcentage de couverture de surface du biofilm sur l’image sur l’expérience de 24 heures en sélectionnant les mesures > de région de la > standard MM dans la fenêtre du logiciel système pour générer un tableau des données sur le biofilm mis en évidence à l’intérieur de la bordure rectangulaire, incluant le pourcentage de la zone seuil. Sélectionnez Ouvrir journal pour ouvrir et enregistrer un fichier journal et F9 : Données journalières pour entrer les données dans le fichier journal.
    5. Ouvrez un tableau et, en utilisant les données biofilm sur 24 heures pour chaque section de canal, créez un graphique montrant le pourcentage de couverture de surface du biofilm sur 24 heures.
  2. Obtenir l’épaisseur du biofilm et la rugosité moyenne arithmétique de la surface.
    1. J’ai sauvegardé la pile z sur Fiji (ImageJ) en glissant le fichier sauvegardé dans la barre de configuration Fiji et en convertissant en une image 8 bits : Image > Type > 8 bits.
    2. Augmenter le contraste entre le biofilm et la surface du canal pour éliminer tout bruit indésirable : Image > Ajustez > Luminosité/Contraste.
    3. Seuil de l’image, en fixant la valeur du pixel biofilm à 255 (blanc) et la valeur du pixel de fond à 0 (noir) : Image > Ajustez > seuil.
    4. Définir l’échelle de l’image, analyser > définir l’échelle > la distance en pixels : 2048 > Distance connue : 332,8 > Rapport d’aspect des pixels : 1,0 > Unité de longueur : μm.
      REMARQUE : La distance connue est de 332,8 μm, car l’appareil photo Hamamatsu utilisé a un champ de vision de 2048 × 2048 pixels, chaque pixel ayant une taille de 6,5 μm et les images ayant été prises à un grossissement de 40 ×.
    5. Analysez la pile Z à l’aide d’une macro18 personnalisée (Fichier Supplémentaire 1) qui calcule et somme la surface du biofilm sur chaque tranche de la pile z et utilise les valeurs d’échelle d’entrée pour calculer l’épaisseur de la série, permettant ainsi de trouver le volume. Sinon, on trouve l’épaisseur du biofilm en divisant le volume calculé par la surface de surface.
    6. Obtenez les valeurs arithmétiques moyennes de rugosité de surface du biofilm à partir de chaque série z en téléchargeant le plugin SurfCharJ (et non Fiji) et enregistrez-le dans le dossier plugins .
    7. Téléchargez la pile z sur ImageJ en faisant glisser la pile enregistrée dans la barre de contrôle et en la convertissant en une image 32 bits : Type > image : 32 bits.
    8. Créez un graphique de surface, montrant la variation des valeurs de gris sur la surface de la pile : Analysez > profil de graphique > Plus : Graphique haute résolution. Convertissez le graphique haute résolution en 32 bits.
    9. Obtenez la valeur arithmétique moyenne de rugosité de surface en lançant le plugin SurfCharJ : Plugins > SurfCharJ > Calcul de rugosité : Longueur moyenne d’échantillonnage () : 10.
      REMARQUE : Le plugin SurfCharJ utilise les différentes valeurs grises le long de la surface de la pile z pour calculer la rugosité arithmétique moyenne de la surface. Un tableau contenant les paramètres de rugosité de surface sera produit, le seul paramètre d’intérêt étant la moyenne arithmétique de rugosité de surface, Ra. Les valeurs du tableau devront être converties en micromètre à partir des pixels.

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Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cette section présente les résultats représentatifs lors de l’application de la procédure protocolaire ci-dessus. Toutes les expériences ont été réalisées avec au moins trois réplications biologiques indépendantes, chacune composée de six canaux parallèles, et les données sont présentées en moyenne ± écart-type. Les barres d’erreur dans tous les graphes représentent l’écart-type, telle que définie dans les légendes de figures.

La croissance des déformations

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les nombreuses étapes critiques qui forment collectivement ce protocole permettent une analyse plus complète et précise de la formation du biofilm que les méthodes alternatives plus traditionnelles. Un élément clé est l’utilisation d’une plaque à microcanaux à 48 puits, avec des canaux à l’échelle microscopique de dimensions 350 μm × 70 μm × 4 mm (L × H × L). Ces dimensions reproduisent spécifiquement les conditions de flux et les microenvironnements présents dans les milieux hospitalier...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs tiennent à remercier l’École de génie mécanique, aérospatial et civil (MAC) de l’Université de Sheffield pour son financement.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
(NH4)2SO4Acros Organics7783-20-2Pour un médium FAB modifié
Plaque microcanal 0-2 à 48 puits - couvercle en verreMicrosystèmes cellulaires910-0047-5PackMicrocanaux pour le flux de médias et la croissance du biofilm
avec imagerie en temps réel
-80 ° ; C FreezerThermo Fisher Scientific1.16057E+15Stocker des stocks de glycérol jusqu’à une utilisation ultérieure
Agar, grade bactériologiqueAcros Organics443570010Pour les plaques d’agar - culture des bactéries
Balance analytiqueVWRVWRI611-2297Pour mesurer les composants des milieux utilisés
AutoclavePrieuré4304Pour stériliser la verrerie
BioFlux 1000HTI& L Biosystemshttps://il-biosystems.com/cell- microsystèmes/dispositifs/bioflux-1000ht-
système de cisaillement/  ;		Pour les expériences de flux microcanal et de croissance de biofilms
Module de contrôle BioFluxI& L Biosystemshttps://il-biosystems.com/cell-
microsystèmes/dispositifs/bioflux-1000ht- système-écoulement-cisaillement/  ;		Mettre en place et surveiller le flux de médias et la croissance des biofilms au sein des microcanaux
Logiciel de montage BioFluxI& L Biosystemshttps://il-
biosystems.com/app/uploads/2025/01/Bi oFlux_Overview_.pdf		Mettre en place et surveiller le flux de médias et la croissance des biofilms au sein des microcanaux
CaCl2Fisher Scientific10043-52-4Pour un médium FAB modifié
CaSO4.2H2OChemCruzA1719Pour une solution de métal minimal de 1 L
Plaque en polystyrène clair à 96 puitsCorning, PartenaireCLS7007Pour le nombre de cellules viables
CoSO4.7H2OSigma-Aldrich10026-24-1Pour une solution de métal minimal de 1 L
CuSO4.5H2OHoneywell209198-100GPour une solution de métal minimal de 1 L
Tubes Eppendorf 3810XEppendorf30125150Pour les stocks de glycérol de P. aeruginosa
FeSO4.7H2OVWR International Ltd.284005EPour une solution de métal minimal de 1 L
Fidji (ImageJ)Instituts nationaux de la santéhttps://imagej.net/software/fiji/downloa
ds		Traitement d’image Z-stack
GlucoseSigma-Aldrich50-99-7Pour le FAB Medium modifié au glucose
GlycérolSigma-Aldrich56-81-5Pour les stocks de glycérol de P. aeruginosa
H3BO3Fisher Scientific10043-35-3Pour une solution de métal minimal de 1 L
Hamamatsu Orca-Flash 4.0 Modèle C11440-
42U		HamamatsuC11440-42UPour l’expérience d’imagerie en temps réel pour l’écoulement de microcanaux et la croissance de biofilms
KH2PO4Fisher BioReagents7778-77-04Pour un médium FAB modifié
Spiritueux méthyléSigma-Aldrich2857Pour nettoyer un cabinet de microbiologie avant et après < utilisation de l'>
MgCl2Sigma-AldrichM8266-100GPour un médium FAB modifié
Cabinet de microbiologie classe IIThermo Fisher Scientific42111226Suivre les étapes du protocole sans bactéries
contaminantes, bouillon ou agar
Mini IncubateurLabnet InternationalSN03171014Pour dégeler PAO1 et PA14 après -80 °C ; Congélateur C et
pour la croissance initiale de 24 heures sur plaques d’agar bactérienne
MnSO4. H2OSigma-Aldrich10034-96-5Pour une solution de métal minimal de 1 L
Na2HPO4.2H2OSigma-Aldrich10102-40-6Pour un médium FAB modifié
NaClSigma-AldrichS5886-500GPour un médium FAB modifié
NaMoO4. H2OSigma-Aldrich10102-40-6Pour une solution de métal minimal de 1 L
Balance de précisionVWRVWRI611-2299Pour mesurer les composants des milieux utilisés
Centrifugeuse réfrigéréeHeraeus40289841Séparation de la culture de P. aeruginosa à partir
surnageant pour les stocks de glycérol
Semi-Micro CuvettesAlpha LaboratoriesX72053Pour les mesures de densité optique
Incubateur à secouementINFORS HThttps://infors- ht.com/en/products/incubator- shakers/Multitron - standardPour les cultures nocturnes
Citrate de sodiumSigma-Aldrich71498-250GPour un milieu FAB modifié au citrate de sodium
Anneaux d’inoculation plastique stérilesMicrospécifique15782105Pour P. aeruginosa, l’inoculation PAO1 et PA14 dans les plaques d’agar et les tubes à faucon
Agar de soja tryptique, végétoneMillipore14432-500G-FPour les plaques d’agar - culture des bactéries
Bouillon de soja tryptiqueSigma-AldrichT8907Milieux de culture déshydratés - 6 g/200 mL
Distributeur d’eau de type 1Thermo Fisher ScientificSN42103311Pour l’eau distile
ZnSO4.7H2OFisher Scientific7446-20-0Pour une solution de métal minimal de 1 L

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Grace, A., Sahu, R., Owen, D. R., Dennis, V. A. Pseudomonas aeruginosa reference strains PAO1 and PA14: A genomic, phenotypic, and therapeutic review. Front Microbiol. 13, 1023523(2022).
  2. T8907 Tryptic Soy Broth. , Sigma-Aldrich. Available from: https://www.merckmillipore.com/deepweb/assets/sigmaaldrich/product/documents/275/615/t8907dat.pdf (2018).
  3. Donlan, R. M. Biofilms and device-associated infections. Emerg Infect Dis. 7 (2), 277-281 (2001).
  4. Pseudomonas Aeruginosa - Biofilm Formation, Infections and Treatments. , IntechOpen. (2021).
  5. Tuon, F. F., Dantas, L. R., Suss, P. H., Tasca Ribeiro, V. S. Pathogenesis of the Pseudomonas aeruginosa biofilm: A Review. Pathogens. 11 (3), 300(2022).
  6. She, P., et al. Effects of exogenous glucose on Pseudomonas aeruginosa biofilm formation and antibiotic resistance. MicrobiologyOpen. 8 (12), e933(2019).
  7. Klausen, M., et al. Biofilm formation by Pseudomonas aeruginosa wild type, flagella and type IV pili mutants. Mol Microbiol. 48 (6), 1511-1524 (2003).
  8. Preda, V. G., Săndulescu, O. Communication is the key: biofilms, quorum sensing, formation and prevention. Discoveries (Craiova). 7 (3), e100(2019).
  9. Heydorn, A., et al. Quantification of biofilm structures by the novel computer program COMSTAT. Microbiology (Reading). 146 (Pt 10), 2395-2407 (2000).
  10. Seneviratne, C. J., Yip, J. W. Y., Chang, J. W. W., Zhang, C. F., Samaranayake, L. P. Effect of culture media and nutrients on biofilm growth kinetics of laboratory and clinical strains of Enterococcus faecalis. Arch Oral Biol. 58 (10), 1327-1334 (2013).
  11. Rajewska, M., Maciąg, T., Narajczyk, M., Jafra, S. Carbon source and substrate surface affect biofilm formation by the plant-associated bacterium Pseudomonas donghuensis P482. Int J Mol Sci. 25 (15), 8351(2024).
  12. Goswami, S., Dey, C. COVID-19 and SARS-CoV-2: The Science and Clinical Application of Conventional and Complementary Treatments. , CRC Press. Boca Raton. (2022).
  13. Jeschke, M. G. Clinical review: Glucose control in severely burned patients - current best practice. Crit Care. 17 (4), 232(2013).
  14. Badoiu, S. C., et al. Glucose metabolism in burns—What happens. Int J Mol Sci. 22 (10), 5159(2021).
  15. Wacogne, B., et al. Concentration vs. optical density of ESKAPEE bacteria: A method to determine the optimum measurement wavelength. Sensors. 24 (24), 8160(2024).
  16. Meyer, C. T., et al. A high-throughput and low-waste viability assay for microbes. Nat Microbiol. 8 (12), 2304-2314 (2023).
  17. Allen, T. Serial Dilution Problem Help. , The University of Vermont. Available from: https://www.uvm.edu/~btessman/calc/serhelp.html (2012).
  18. Blog Post: Loading and Measurement of Volumes in 3D Confocal Image Stacks with ImageJ. , VISIKOL. Available from: https://visikol.com/blog/2018/11/29/blog-post-loading-and-measurement-of-volumes-in-3d-confocal-image-stacks-with-imagej/ (2024).
  19. Kasetty, S., Katharios-Lanwermeyer, S., O'Toole, G. A., Nadell, C. D. Differential surface competition and biofilm invasion strategies of Pseudomonas aeruginosa PA14 and PAO1. J Bacteriol. 203 (22), e0026521(2021).
  20. Shen, Y. Role of biofilm roughness and hydrodynamic conditions in Legionella pneumophila adhesion to and detachment from simulated drinking water biofilms. Environ Sci Technol. 49 (7), 4274-4282 (2015).
  21. Sankari, A., Sharma, S. Cystic Fibrosis. , StatPearls Publishing. Treasure Island, FL. (2025).
  22. Cameron, K., Jarvis, K. Urinary Catheterisation for Adults Clinical Guideline. , Available from: https://www.rightdecisions.scot.nhs.uk/media/2210/urinary-catheterisation-adultsfinal.pdf (2022).
  23. IV access improvement project guidelines: choosing catheter sizes. , Children's Hospital of Philadelphia. Available from: https://www.chop.edu/clinical-pathway/iv-access-improvement-project-guidelines-choosing-catheter-sizes (2017).
  24. Casadevall, A., Fang, F. C. Reproducible science. Infect Immun. 78 (12), 4972-4975 (2010).
  25. Sutlief, A. L., et al. Live cell analysis of shear stress on Pseudomonas aeruginosa using an automated higher-throughput microfluidic system. J Vis Exp. (143), e58926(2019).
  26. Shear Flow BioFlux Plates. , Cell Microsystems. Available from: https://cellmicrosystems.com/wp-content/uploads/2024/09/BioFlux-Brochure_v6-Single-page.pdf (2024).
  27. Wijesinghe, G., et al. Influence of laboratory culture media on in vitro growth, adhesion, and biofilm formation of Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus. Med Princ Pract. 28, 28-35 (2019).
  28. Jahid, I. K., Lee, N. -Y., Kim, A., Ha, S. -D. Influence of glucose concentrations on biofilm formation, motility, exoprotease production, and quorum sensing in Aeromonas hydrophila. J Food Prot. 76 (2), 239-247 (2013).
  29. De Plano, L. M., Caratozzolo, M., Conoci, S., Guglielmino, S. P. P., Franco, D. Impact of nutrient starvation on biofilm formation in Pseudomonas aeruginosa: An analysis of growth, adhesion, and spatial distribution. Antibiotics. 13 (10), 987(2024).
  30. Tan, X., et al. Alkaline phosphatase LapA regulates quorum sensing-mediated virulence and biofilm formation in Pseudomonas aeruginosa PAO1 under phosphate depletion stress. Microbiol Spectr. 11 (6), e0206023(2023).
  31. Quan, K., et al. Water in bacterial biofilms: pores and channels, storage and transport functions. Crit Rev Microbiol. 48 (3), 283-302 (2022).
  32. Green, A. S. Modelling of peak-flow wall shear stress in major airways of the lung. J Biomech. 37 (5), 661-667 (2004).
  33. Lee, K., Han, J. Analysis of the urine flow characteristics inside catheters for intermittent catheter selection. Sci Rep. 14, 13273(2024).
  34. Wang, C., et al. Carbon starvation induces the expression of PprB-regulated genes in Pseudomonas aeruginosa. Appl Environ Microbiol. 85 (22), e01705-e01719 (2019).
  35. Sarinas, P. S. A., et al. Inspiratory flow rate and dynamic lung function in cystic fibrosis and chronic obstructive lung diseases. Chest. 114 (4), 988-992 (1998).
  36. Franca, M. J., Valero, D., Liu, X. Turbulence and Rivers. Treatise on Geomorphology. , Elsevier, Academic Press. (2022).
  37. Shroder, J. F. Treatise on Geomorphology. , Elsevier Science & Technology. San Diego. (2022).
  38. Narciso, D. A. C., Pereira, A., Dias, N. O., Melo, L. F., Martins, F. G. Characterization of biofilm structure and properties via processing of 2D optical coherence tomography images in BISCAP. Bioinformatics. 38 (6), 1708-1715 (2022).

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Mots-clés

Flux laminaireQuantification du biofilmCouverture de la surfaceR sistance antimicrobienneInfections nosocomiales
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