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Article de méthode

Spectroscopie de résonance magnétique au phosphore-31 pour les mesures en série de l’énergétique cardiaque lors de la préservation du cœur à température contrôlée

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DOI :

10.3791/70070

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17 mars 2026

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1Division of Cardiac Surgery, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Division of MR Research, Russell H. Morgan Department of Radiology and Radiological Science, Johns Hopkins University School of Medicine, 3Krieger School of Arts and Sciences, Johns Hopkins University, 4Johns Hopkins University School of Medicine, 5Department of Pediatric Cardiac Surgery, Johns Hopkins University School of Medicine

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Dans cet article, nous avons décrit un protocole reproductible et à température contrôlée pour la spectroscopie de résonance magnétique du phosphore-31 ex vivo , permettant une évaluation quantitative et sérieuse de l’énergétique myocardique lors de la préservation des organes.

Résumé

Une préservation fiable des organes est essentielle pour augmenter la disponibilité des donneurs et améliorer les résultats des greffes. Bien que le stockage statique reste la norme pour les cœurs de donneurs, il est nécessaire de disposer de méthodes précises pour surveiller l’énergie myocardique tout au long de la préservation.

La spectroscopie par résonance magnétique au phosphore-31 (31P MRS) permet une mesure directe et dynamique des principaux métabolites énergétiques, notamment la phosphocréatine (PCr), l’adénosine triphosphate (ATP), le phosphate inorganique (Pi) et le pH intracellulaire. Cette technique permet une évaluation longitudinale, quantitative et précise du statut métabolique myocarde lors du stockage ex vivo . Les avantages de la SRM incluent une évaluation dynamique de l’état énergétique et une évaluation globale de l’énergie ventriculaire.

Le protocole commence par la récupération du donneur porc, l’administration de la cardioplégie et la cardiectomie. L’arc aortique est découpé proximalement au tronc brachiocéphalique afin de maximiser la longueur de l’aorte ascendante. Une canule nervurée est fixée dans l’aorte ascendante distale, l’oreillette gauche est marquée, et le cœur est placé dans un récipient cylindrique isolé, pré-rempli de cardioplégie selon la température. Le couvercle se connecte à la canule, suspendant le cœur à l’intérieur, et le récipient est scellé, maintenant une température à moins de 1 °C pendant 1 heure.

Le récipient est placé dans une boîte en polystyrène sur mesure avec une ouverture pour une bobine accordée au phosphore, alignant le centre de la résistance avec le centre du ventricule gauche (VS). Les images de reconnaissance confirment le placement du LV près de la résistance 31P. Le calage B0 assure une excitation uniforme, suivi de l’acquisition d’un spectre MR non localisé de 31P. Le post-traitement identifie les pics spectraux pour calculer les rapports PCr/ATP, les rapports PCr/Pi et le pH intracellulaire.

Dans notre protocole, la 31P IRM est réalisée à des moments en série entre h 0 et 8. Entre les moments temporels, le cœur est stocké dans un dispositif de stockage standard à la température désirée.

31La P MRS nous a permis d’étudier les variations dépendantes du temps liées à la déplétion énergétique et le rôle de la température de stockage dans la mitigation de cette déplétion au fil du temps.

Introduction

La transplantation cardiaque reste le traitement définitif pour certains patients atteints d’insuffisance cardiaqueterminale 1. Cependant, une pénurie persistante d’organes de donneurs adaptés et les limites des stratégies actuelles de préservation constituent des obstacles majeurs à des résultats optimaux et à une disponibilité accrue desgreffes 2,3. Traditionnellement, les cœurs de donneurs sont préservés à l’aide d’un stockage statique à froid, qui est simple et économique, mais susceptible d’épuiser l’énergie subclinique lors d’un transportprolongé 2,4. À mesure que les programmes acceptent de plus en plus des organes à risque élevé et géographiquement éloignés, le besoin d’outils objectifs qui caractérisent l’état métabolique du myocarde pendant la préservation s’installe, plutôt que de se fier uniquement au temps ischémique et à l’inspectionglobale 5,6,7. De plus, le métabolisme myocardique et la tolérance ischémique sont fortement influencés par la température, et un refroidissement insuffisant ainsi qu’une hypothermie excessive peuvent aggraver la déplétion énergétique et les lésions cellulaires pendant le stockage. L’évaluation des cœurs de donneurs à plusieurs températures de conservation cliniquement pertinentes aide donc à identifier les conditions qui maintiennent le mieux la viabilité myocardique surle long terme 3.

Une évaluation précise et dynamique de la bioénergétique myocardique pendant le stockage est essentielle pour améliorer les techniques de préservation et maximiser l’utilisation des organes. Actuellement, la pratique standard repose sur un stockage statique à froid à des températures comprises entre environ 4 et 8 °C 8. Bien que ce protocole ait montré des résultats positifs sur de courtes durées de stockage, un stockage prolongé à cette température peut compromettre l’intégrité du myocarde. Il est donc essentiel de réaliser des mesures sérieuses de l’activité métabolique sur une plage de températures et de durées afin de délimiter les conditions de stockage optimales nécessaires pour assurer la réussite d’une transplantation d’organes. L’évaluation conventionnelle de la lésion de préservation repose souvent sur un examen histologique ou des analyses biochimiques issues de biopsies myocardiques, qui sont invasives, destructrices et ne fournissent que des instantanés régionaux intermittents de l’étattissulaire 9. En revanche, la spectroscopie par résonance magnétique au phosphore-31 (31P MRS) est une modalité puissante et non destructive qui permet la mesure directe et sérielle des principaux métabolites énergétiques, notamment la phosphocréatine (PCr), l’adénosine triphosphate (ATP), le phosphate inorganique (Pi) et le pH intracellulaire, au sein du tissu cardiaqueintact 6,10,11,12. En permettant des mesures répétées dans le même organe sans manipulation supplémentaire des tissus, la RMS 31P fournit des informations globales et longitudinales sur l’état énergétique myocardique, améliorant la précision expérimentale et la reproductibilité par rapport aux approches basées sur biopsie ou à substitutionsérique 6,13.

L’évaluation de la viabilité du greffon cardiaque avec 31P MRS a été examinée par Bernard etal 14. Ici, un protocole détaillé et contrôlé par la température pour la MRS ex vivo 3 Tesla 31P du cœur de porc pendant la conservation est présenté. Cette méthode fournit un cadre pratique pour surveiller l’épuisement des substrats, tester les variables de stockage et valider les interventions de préservation. Le protocole est particulièrement approprié pour les laboratoires qui recherchent des mesures en série du ventricule entier lors d’un stockage statique à froid, telles que des études de conservation dépendante de la température, des lésions ischémie-reperfusion, ou l’optimisation de solutions pour des cœurs de donneurs marginaux et à critères étendus.

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Protocole

Ce protocole suit les directives institutionnelles de soins aux animaux et a été approuvé par le comité de soins et d’utilisation des animaux de Johns Hopkins (numéro de protocole SW24M319) pour toutes les procédures impliquant des animaux vivants, jusqu’à et y compris la prélève chirurgicale. Toutes les expériences ex vivo ultérieures ont été réalisées à partir de tissus obtenus après l’euthanasie.

1. Procédure pré-récolte

  1. Réglez l’incubateur à une température inférieure de 2 °C à la température cible de conservation. Laissez l’incubateur se stabiliser pendant au moins 2 heures.
  2. Placez 6 à 7 poches de glace dans l’incubateur pour les pré-refroidir à la température fixée. Assurez-vous que les poches de glace sont en quantité suffisante pour maintenir la température pendant le transport.
  3. Préparez une solution de cardioplégie de Saint Thomas modifiée :
    1. Dans 1 litre de sachet de solution de Ringer lacté, ajoutez
      1. 30 mL de bicarbonate de sodium à 8,4 %
      2. 5 mL de 30 mmol/10 mL de chlorure de potassium
      3. 2,5 mL de sulfate de magnésium 20 mmol/10 mL
      4. 15 mL de 50 % de dextrose
      5. 100 mg de nitroglycérine de 50 mg/10 mL
      6. 5000 U d’érythropoïétine froide
    2. Préparez un total de 3 L de solution de cardioplégie et stockez la solution dans l’incubateur pré-refroidi.
  4. Mettez de côté le refroidisseur isolé avec un tube en silicone intégré qui permet un positionnement optimal de la hauteur verticale du cœur. Apposez une marque de référence noire sur le tube en silicone à l’endroit qui se trouve directement sous la pointe de l’ouverture sur le couvercle du refroidisseur.
  5. Mettez de côté une canule nervurée pour sécuriser et suspendre le cœur récolté. Placez une marque de référence noire sur la surface extérieure de la canule pour servir de point d’alignement reproductible.

2. Procédure de récolte

  1. Sédez l’animal à l’aide d’une combinaison de télazol, kétamine et xylazine mélangés dans une seule seringue et administrés par voie intramusculaire, afin de minimiser le stress et la douleur associés à plusieurs injections.
    1. Télazol (50 mg de tilétamine + 50 mg de zolazepam) à 4,4 mg/kg pour chaque composant.
    2. Kétamine à 2,2 mg/kg.
    3. Xylazine à 2,2 mg/kg.
  2. Intubez et anesthésiez l’animal.
    1. Volume de marée à 5-10 mL/kg.
    2. Fréquence respiratoire de 12-15 respirations/min.
    3. Pression expiratoire positive à 5 cmH2O.
    4. Inhalation d’isoflurane à 0,5-2 % avec un débit d’oxygène de 1 à 2 L/min.
  3. Posez des lignes intraveineuses périphériques, effectuez une sternotomie et ouvrez lepéricarde 15. Administrez des antiarythmiques si nécessaire.
  4. Placez une aiguille de cardioplégie dans l’aorte ascendante, en la positionnant au-dessus de la valve aortique mais en dessous de l’arc aortique.
  5. Injectez et connectez un sachet de 1 L de solution cardioplégie à l’aiguille.
  6. Ventilez l’oreillette gauche, la veine cave inférieure et la veine cave supérieure.
  7. Appliquez une pince transversale aortique proximal à l’arche.
  8. Initiez le flux de cardioplégie à travers les coronaires à une pression d’environ 75-80 mmHg. Surveillez la pression à l’aide d’un manomètre en ligne.
  9. Récoltez le cœur tout en maintenant l’intégrité anatomique.
  10. Verser du sérum saline pré-refroidi sur le cœur récolté pour refroidir rapidement sa surface.
  11. Placez le cœur dans un bol rempli de solution froide pour la cardioplégie.
  12. Insérez une sonde de température myocardique à l’apex du cœur, et un thermomètre dans le bol de solution cardioplégique pour surveiller la température.
  13. Séparez l’aorte de l’artère pulmonaire (PA).
  14. Fixez la canule nervurée dans l’aorte à l’aide de liens de soie et de colliers de serrage, en veillant à ce que la partie marquée corresponde à la position du ventricule gauche (LV).
  15. Remplissez la glacière avec la solution Saint Thomas à 60-70 % de sa capacité, puis transférez le cœur et la solution du bol dans la glacière pour un remplissage total, maximisant ainsi l’immersion.
  16. Mesurez et documentez la solution finale et la température du tissu.
  17. Fixez la canule nervurée au couvercle du refroidisseur avec un tube en silicone à la marque prédéfinie. Assurez-vous que les marques sur la canule nervurée et le tube en silicone sont alignées, afin que le vélo garde une orientation cohérente par rapport au couvercle lorsque le refroidisseur est fermé, assurant ainsi un positionnement reproductible du val à chaque balayage (Figure 1A).
  18. Désaérez l’organe pour assurer une homogénéité optimale du champ IRM et un bon rapport signal/bruit lors de la collecte des données IRM.
  19. Fermez le couvercle de la glacière pour assurer l’alignement du VV.
  20. Mettez des poches de glace et une glacière dans un sac de transport.

3. Protocole de spectroscopie

  1. Ce protocole est optimisé pour un scanner IRM 3T. Le scanner MR est équipé d’une option de spectroscopie multi-nuclés, incluant un amplificateur radiofréquence large bande de 4 kW et un récepteur, incluant la bobine au phosphore standard fournie par le fournisseur (P140). La bobine 31P est une bobine de transmission et réception en boucle unique de 14 cm de diamètre, avec deux tiges pour l’accord et l’adaptation.
  2. Prévenez le personnel de l’établissement d’IRM avant le transport et confirmez la disponibilité du scanner.
  3. Préparez une boîte en polystyrène avec les dimensions extérieures suivantes : longueur 33,5 cm, largeur 28 cm (bord plus long), largeur 23 cm (bord plus court) et épaisseur 4 cm. Faites une fente de 3,3 cm de largeur sur un côté de la boîte pour permettre le placement de la bobine 31P adjacente au cœur (Figure 1B).
  4. Insérez le refroidisseur avec le cœur suspendu adjacent à l’axe central de la bobine, en visant la position du ventricule (Figure 1C). Préparez une glacière de 25,4 cm de haut et 11,4 cm de large. Le tube en silicone est fixé à une longueur de 7 cm à partir de la surface interne du couvercle, au point de montage du cœur (Figure 1D).
  5. Placez des poches de glace dans les espaces autour de la glacière, en veillant à ne pas créer d’espace entre la glacière et la bobine, puis rubanez le couvercle de la boîte pour assurer la stabilité lors du scan (Figure 1E).
  6. Centrer le refroidisseur sur l’isocentre de l’aimant à l’aide des guides laser et du point de repère de centrage, afin d’assurer une homogénéité optimale de B0 (Figure 1F).
  7. Branchez la bobine 31P dans le connecteur de balayage et fixez des tiges d’accordage et de correspondance à la bobine (Figure 1F).
  8. Acquérir des images de reconnaissance localisatrice tri-plans pour vérifier le placement de la bobine et la proximité optimale du niveau de tension avec la bobine 31P (Figure 2).
  9. Si le positionnement du LV est incorrect, faites pivoter le couvercle du refroidisseur et relancez le scan scout.
  10. Acquérir une application dechamp statique B 0 pour un shimming localisé du2e ordre16 afin d’assurer un champ magnétique uniforme à travers la région d’intérêt requise pour une haute qualité spectrale :
    1. Après l’acquisition de la carte B0, un « Shimtool »16 est automatiquement lancé avec cette carte chargée (Figure 3).
    2. Points de clic d’un polygone lissé délimitant le muscle cardiaque dans toutes les tranches (Figure 3A).
    3. Le « Shimtool » effectue ensuite un ajustement de moindres carrés contraints pour déterminer la fréquence de résonance localisée et les corrections du champ de cale de premier (x, y, z) et de second ordre (xy, xz, yz, x2-y 2, z2-(x2+y 2)/2) (Figure 3C). Téléchargez ces termes de correction sur le scanner et appliquez-les aux scans suivants.
  11. Avant l’acquisition du MRS 31P, tournez les tiges de synthèse de la bobine pour assurer un réglage optimal de la bobine radiofréquence et adaptez son impédance au système MR, maximisant ainsi l’efficacité de la transmission du signal et minimisant les réflexions dans le système radiofréquence (Figure 4).
  12. Acquérir un spectre initial non localisé de 31P MR (temps de répétition [TR] : 10 s, angle de basculement = 90° en utilisant des impulsions adiabatiques B1-Insensitive Rotation-4 (BIR-4) ; temps d’écho [TE] = 0,1 ms ; bande passante = 3000 hertz (Hz) ; 1024 points spectraux, 5 moyennes) pour déterminer la fréquence de résonance au centre entre les pics PCr et γ-ATP. Temps total d’acquisition : 50 s.
  13. Ensuite, acquérir des spectres MR 31P entièrement relâchés et non localisés après avoir ajusté la fréquence de décalage selon le calcul en 3,12 (TR : 16 s, angle de basculement = 90° en utilisant des impulsions adiabatiques BIR-4 ; TE = 0,1 ms ; bande passante = 3000 Hz ; 512 points spectraux, 20 moyennes). Temps total d’acquisition : 5 min 20 s.
  14. Après l’examen, mesurez les températures de liquide et du myocarde ; garantissant une déviation par rapport à la cible de ≤1 °C.
  15. Conservez le cœur dans l’incubateur à la température souhaitée jusqu’au prochain scanner programmé.

4. Analyse des données

  1. Exportez les données MRS 31P entièrement relâchées sous forme de . SDAT et chargement dans une interface graphique pour le traitement (Figure 5A)17.
  2. D’abord, apodiser les spectres à l’aide d’un filtre lorentzien à 15 Hz (Figure 5B), puis appliquer un décalage de phase d’ordre 0 et 1, et régler la fréquence à 0 parties par million (ppm) au centre du pic PCr (Figure 5C).
  3. Ajustez les spectres à l’aide de la fonctionAMARES 18 en utilisant les valeurs de connaissance listées dans le Tableau 1.
  4. Examinez l’analyse pour un ajustement adéquat dans la fenêtre suivante (Figure 6), en s’assurant que chaque pic est correctement identifié (composants individuels) et qu’un signal résiduel minimal reste après l’analyse (résidu).
  5. Calculez les ratios métabolites du myocarde PCr/ATP et PCr/Pi en fonction de l’amplitude spectroscopique du pic (Figure 7). La résonance γ-ATP est utilisée comme mesure de l’ATP.
  6. Calculer le pH intracellulaire en fonction du décalage chimique entre Pi et PCr après ajustement, pour refléter la condition de température14.
    REMARQUE : Le protocole peut être mis en pause après chaque IRM (étape 3.15). Veillez à ce que le contrôle de la température soit maintenu tout au long de la période.

5. Équations

  1. Calculez le pH intracellulaire (pHi) comme décrit précédemment19 :
    Équation 1
    Où T est la température en °C, et δ0 est la différence de décalage chimique observée entre les résonances PCr et Pi, en ppm.

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Résultats

Le calage localisé du2e ordre16 a entraîné un champ magnétique B0 plus homogène dans la région d’intérêt, comme l’indique une réduction de l’écart-type à chaque point temporel (0 h : 14,0 à 4,0 Hz ; 4 h : 17,5 à 3,2 Hz ; 8 h : 16,0 à 3,2 Hz). Cela garantissait une excellente qualité spectrale à chaque moment (Figure 7). Les changements métaboliques du myocarde lors du stockage frigorifique ex vivo indiquent une déplétion rapide des réser...

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Discussion

Ce manuscrit décrit une préparation chirurgicale et un protocole d’acquisition et d’analyse de la MRS à 31P pour l’évaluation en série de l’énergétique myocardique lors de la préservation cardiaque. 31La P. MRS permet une évaluation sérieuse et non destructive des principaux métabolites cardiaques à différentes températures de stockage au froid, ce qui apporte de nouvelles perspectives sur la viabilité métabolique du tissu myocardique. Ce protocole MRS 31...

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Déclarations de divulgation

Nous n’avons aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

Nous souhaitons remercier notre équipe de Johns Hopkins, au sein du département de chirurgie cardiaque et de radiologie, pour avoir contribué à la réalisation réussie de cette recherche. Cette étude a été financée par l’American Association for Thoracic Surgery (AATS).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
IncubateurBenchmark Scientific & nbsp ;H2265-HCIncubateur de refroidissement chauffant MyTemp 65HC
Refroidisseur isolantGatoradeUPC 052000047097Refroidisseur sportif isolé Gatorade
jMRUI version 7.0Javawww.jmrui.euInterface graphique pour l’analyse des données
Sonde de température myocardeDeRoyal81-030415Sonde de température myocarde DeRoyal série 400 (15 mm)
Scanner à résonance magnétiquePhilipshttps://www.philips.com/healthcare/diagnostic-imaging/magnetic-resonance-imagingAchieva 3T, Philips Healthcare
Bobine de phosphore à boucle uniquePhilips Healthcare & nbsp ;https://www.philips.com/healthcare/diagnostic-imaging/magnetic-resonance-imagingP140, Philips Healthcare

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