Méthode d’interaction ADN-ADN chromatine associée à l’ARN

Résumé

Ici, nous présentons un protocole pour capturer les interactions ADN-ADN chromatine associées à l’ARN afin de cartographier l’organisation tridimensionnelle du génome liée à l’ARN.

Résumé

La méthode d’interaction ADN-ADN (RDD) chromatine associée à l’ARN est une stratégie ciblée pour cartographier les interactions de la chromatine ancrées par un ARN spécifique. Il identifie simultanément les loci génomiques associés à l’ARN d’intérêt et résout les contacts ADN-ADN à longue portée entre ces loci, permettant d’inférer l’organisation spatiale et les relations régulatrices. Dans la RDD, des sondes antisens biotinylées complémentaires à l’ARN cible sont utilisées pour enrichir les complexes ARN-chromatine. Les cellules sont réticulées, la chromatine est fragmentée et réparée par les extrémités, et la ligature de proximité est réalisée à l’aide d’un liaison conçu pour relier les fragments d’ADN qui sont spatialement adjacents au sein des complexes capturés. Les produits de ligation sont purifiés, convertis en bibliothèques de séquençage et analysés par séquençage à haut débit pour générer des cartes d’interaction ancrées dans l’ARN. La RDD est applicable aux ARN endogènes ainsi qu’aux ARN exogènes dérivés de micro-organismes et virus infectant l’hôte, et elle est compatible avec divers types cellulaires et conditions expérimentales. La méthode permet de produire des profils de contact spécifiques au locus, à haute résolution, adaptés à la dissection de l’appariement amplificateur-promoteur, de la régulation à longue portée et de l’architecture du génome tridimensionnelle associée aux ARN régulateurs et non codants. En intégrant l’enrichissement biochimique à la ligature de proximité et au séquençage de nouvelle génération, la RDD offre un flux de travail robuste et reproductible pour révéler comment les ARN organisent la chromatine et influencent l’expression génique.

Introduction

Hi-C et ChIA-PET ont transformé les études d’organisation du génome tridimensionnel (3D) en convertissant la proximité spatiale entre fragments de chromatine en jonctions d’ADN covalentes qui peuvent être séquencées pour déduire des contacts physiques à travers des échelles allant des boucles aux^{compartiments 1,2}. Au-delà des protéines, de nombreux ARN participent aux interactions de la chromatine, influençant la communication améliorateur/répresseur-promoteur et l’organisation de la chromatine^{d’ordre supérieur 3} ; cependant, malgré les avancées dans les tests ancrés par des protéines, il reste difficile de déterminer directement comment un ARN spécifique organise les interactions ADN-ADN à longue portée entre ses loci liés. L’objectif principal de la méthode d’interaction ADN-ADN (RDD)4 est de générer des cartes d’interaction chromatine à haute résolution, ancrées dans l’ARN, qui révèlent comment une espèce d’ARN définie s’associe à la chromatine et orchestre les contacts ADN-ADN au sein de son voisinage local, permettant une inférence mécaniste sur la communication améliorateur/répresseur-promoteur et une architecture génomique d’ordre supérieur centrée sur cet^{ARN 5}. Méthodologiquement, la RDD enrichit les complexes ARN-chromatine réticulés avec des sondes antisens biotinylées contre l’ARN d’intérêt, effectue une ligature de proximité sur complexe avec un liaison conçu pour relier des fragments d’ADN spatialement adjacents, et construit des bibliothèques de séquençage pour produire des profils de contact spécifiques au locus, adaptés à des analyses hypothétiques à travers divers types cellulaires et conditions, y compris des contextes impliquant des ARN bactériens ou viraux exogènes chez des hôtes infectés. Ces caractéristiques positionnent la RDD comme un pendant ancré dans l’ARN des méthodes établies de conformation chromosomique, fournissant des informations de contact interprétables à des résolutions appropriées pour l’analyse régulatrice.

La raison d’être de la RDD découle des limites des stratégies existantes de cartographie ARN-chromatine. Des approches de capture ciblée telles que ChIRP-seq et CHART-seq identifient l’occupation d’ADN à l’échelle du génome d’un seul ARN, un paradigme d’un ARN pour tout l’ADN qui rapporte la liaison mais pas les contacts physiques ADN-ADN entre les loci^{occupés 6,7}. Les tests globaux, incluant GRID-seq et MARGI, se sont étendus à tous les ARN de tous les ADN, cataloguant les proximités ARN-ADN à l’échelle du génome mais sans résolution explicite des contacts ADN-ADN au sein des complexes centrés sur^{l’ARN 3,8}. Des méthodes multiplexées telles que RD-SPRITE rapportent une co-localisation d’ordre supérieur entre de nombreux ARN et loci d’ADN et transmettent des aspects de la topologie nucléaire⁹, mais les signaux sont généralement dominés par des ARN abondants, qui peuvent masquer les ARN régulateurs à faible abondance et limiter la profondeur ciblée pour le réseau d’interaction d’un seul ARN. Les stratégies d’enrichissement et de ligation ancrées par protéine ou marque, telles que ChIA-PET¹⁰, PLAC-seq¹¹ et HiChIP¹², cartographient efficacement des boucles centrées sur les facteurs mais n’ancrent pas les interactions à un ARN défini sans module de capture spécifique à l’ARN, laissant la dimension ADN-ADN ancrée par l’ARN non résolue. En intégrant l’enrichissement biochimique ciblé avec la ligature de proximité sur complexe, la RDD capture directement les contacts ADN-ADN entre les fragments de chromatine cooccupés par l’ARN^{d’intérêt 4}, augmente la sensibilité et la spécificité pour les ARN à faible à modérée, et génère des cartes de contact haute résolution spécifiques au lieu qui complètent les méthodes globales centrées sur l’occupation (ChIRP/CHART)^6,7 et centrées sur la proximité (GRID-seq/MARGI/RD-SPRITE^{)3. 8,9} tout en faisant courir en parallèle conceptuellement des stratégies de ligation ancrées dans les facteurs protéiques (ChIA-PET/PLAC-seq/HiChIP⁾10,11,12. Les lecteurs devraient envisager la RDD lorsqu’une question biologique nécessite de résoudre les relations spatiales entre loci de chromatine spécifiquement associés à un ARN cible — en particulier lorsque cet ARN est hypothétique pour échafauder, relier ou contraindre les interactions génomiques à longue portée pour ajuster la transcription — ou lorsqu’ils priorisent les cibles régulatrices potentielles de l’ensemble de liaison d’un ARN, en distinguant les hubs centrés directement sur l’ARN de la simple co-occupation, délimiter les réseaux d’amplificateurs/répresseurs pour des ARN spécifiques, ou suivre le recâblage des contacts ancrés à l’ARN à travers des perturbations, des stades de développement ou des infections. Dans de tels scénarios, la RDD répond à un besoin non satisfait en fournissant des informations d’interaction ADN-ADN ancrées dans l’ARN, avec la sensibilité, la spécificité et la résolution requises pour des études mécanistiques rigoureuses.

Protocole

REMARQUE : Pour cette méthode RDD, le système exemple utilise des cellules Drosophila S2 ainsi que les ncRNA roX2 et 7SK ; Les réactifs de réaction sont listés dans le Tableau 1, les compositions des tampons dans le Tableau 2, les détails des réactifs et les détails de l’instrument sont dans Matériaux . La figure 1 donne un aperçu du protocole pour la génération de bibliothèques RDD. Les procédures impliquant la rotation (F8) utilisent les paramètres suivants : F8, 20 tr/min, uu20 et UU30. Pour tous les tampons utilisés de l’étape 2 à l’étape 10, compléter fraîchement avec un inhibiteur de proténase (PI) et un inhibiteur RNase (RI, 0,05 U/μL).

Principes de conception de la sonde : Pour des ARN nouveaux, non déclarés, concevez les sondes en ligne avec le Stellaris Probe Designer, puis filtrez les séquences non spécifiques à l’aide d’outils d’alignement (par exemple, alignement de type BLAST) ou UCSC BLAT, suivi d’une 3′-biotinylation des sondes sélectionnées. Pour les nouveaux ARN cibles, concevoir des séquences correspondant à l’ARN cible afin de servir de témoins négatifs, également soumis à la 3′-biotinylation. Le contrôle qualité consiste à concevoir des amorces à transcription inverse sur l’ARN cible pour la validation de la transcription, ainsi que des amorces ciblant l’ADN génomique pour la qPCR afin d’évaluer la contamination ; Incluent des amorces localisant les sites de liaison génomique et les régions non liées afin d’évaluer la spécificité de la liaison. Les sondes liées à roX2 et 7SK sont fournies dans le Tableau 1.

1. Récolte cellulaire et double réticulation

1. Culture des cellules de Drosophila S2 à 27 °C. Visez à collecter un total d’environ 3 x 10⁹ cellules. Resuspendez directement les cellules dans le milieu de culture, puis après comptage Trypan-bleu, aliquotez 8 x 10⁸ cellules dans chaque tube centrifuge conique de 50 mL.
   1. Mélangez 2 μL de cellules avec 8 μL de DPBS, ajoutez 10 μL de bleu de Trypan, puis chargez sur l’hémocytomètre pour le comptage cellulaire.
      REMARQUE : Les cellules de Drosophila S2 sont présentées comme exemple. Typiquement, 8 x 10⁸ cellules correspondent à environ 40 mL de volume de culture traités dans un seul tube conique de 50 mL. Les utilisateurs peuvent ajuster les conditions de culture et prélever les quantités cellulaires selon le type cellulaire utilisé et l’abondance de l’ARN cible.
2. Ajoutez le formaldéhyde à une concentration finale de 1 % (p/v) et faites tourner à 27 °C pendant 20 minutes.
   REMARQUE : Effectuer la fixation à la température de culture ou à température ambiante (RT ; 20-25°C). Sauf indication contraire, faites pivoter sur le mélangeur (F1, 12 tr/min). Pour les cellules adhérentes, utilisez un vibrateur orbital (50 tr/min).
   ATTENTION : Le formaldéhyde est toxique ; Utilisez une hotte de fumée.
3. Cellules à pellets à 845 x g pendant 5 minutes en RT ; Jetez le surnageant sur les déchets chimiques/biologiques appropriés. La granule de 8 x¹⁰ cellules S2 mesure généralement environ 1^{cm 3} de volume.
4. Resuspendez le pellet dans un EGS fraîchement préparé de 2 mM à un volume total de 40 mL en DPBS, puis tournez à 27 °C pendant 40 minutes.
   REMARQUE : Dissoudre l’EGS dans le DMSO et transférer vers le DPBS (voir Tableau 2). L’EGS dans DMSO est dangereux.
5. Trempe en ajoutant 2 mL de glycine 2,5 M (0,125 M final) ; Faites tourner à 27 °C pendant 10 minutes.
6. Pellet à 845 x g pendant 5 minutes en RT ; Jetez le surnageant sur les déchets chimiques/biologiques appropriés. Laver les granulés deux fois avec 40 mL de DPBS préchauffé à 27 °C.
7. Pellets à 845 x g pendant 5 minutes. Resuspendez la pellete cellulaire dans 10 mL de DPBS et comptez les cellules. Le nombre de cellules peut diminuer pendant l’étape de réticulation, généralement d’environ 30 %.
8. Aliquotes 1 x 10⁹ cellules dans chaque tube de 50 mL ; Pellet à 845 x g pendant 5 minutes en RT ; Jetez le surnageant. Conservez les granulés à −80 °C.
   REMARQUE : Toutes les étapes de réaction suivantes concernent une bibliothèque RDD.

2. Lyse cellulaire et perméabilisation des noyaux

1. Prenez 1 x 10⁹ S2 de cellules à double réticulation du congélateur à −80 °C. Dégelez sur de l’eau glacée pendant 30 minutes.
2. Résuspendez les cellules dans 50 mL de DPBS, centrifugez à 845 x g pendant 5 minutes en RT et jetez le surnageant.
3. Lyse cellulaire : Resuspendez la granule cellulaire dans 20 mL de tampon de lyse FA à 0,1 % (sans Triton X-100). Tourne en RT pendant 15 minutes. Vérifier par microscopie ; Ajustez le temps par type de cellule. La lyse réussie est indiquée par la perméabilisation de la membrane plasmique et la libération cytoplasmique, de sorte que les noyaux deviennent facilement visibles sous forme de structures distinctes sous un microscope optique standard (Figure 2A).
4. Perméabilisation des noyaux : Ajoutez 1,8 mL de SDS à 10 % (1 % final). Faites tourner à 37 °C pendant 15 minutes. Centrifugeuse à 3 200 x g pendant 20 minutes en temps de réflexion et jetez le surnageant. Vérification par microscopie (Figure 2B) ; Ajustez le temps par type de cellule. Les noyaux paraissent plus foncés, semblables à des membranes voilées, ou certains sont détachés. Répétez jusqu’à ce que la lyse soit terminée.
5. Lavage du noyau : Reposez le pellet dans un tampon de lyse FA à 20 mL (sans Triton X-100), faites pivoter à RT pendant 10 minutes, puis centrifugez à 3 200 x g pendant 20 minutes à RT, jetez le surnageant et marquez la taille du noyau du pellet. Conservez la pastille de noyaux à −80 °C pour une utilisation ultérieure.

3. Fragmentation de la chromatine

1. Resuspendez le pellet de noyaux dans 15 mL de tampon de lyse FA à 0,1 % (avec Triton X-100). Une suspension de 1,5 mL des noyaux dans chaque tube à fond rond de 14 mL, évitant ainsi les bulles.
   1. Marquez la taille du projectile avant la sonication pour comparaison et répétez la sonication si le projectile reste grand après la sonication.
2. Sonicez à 38 % d’amplitude pendant 4,5 minutes, avec des cycles de 30 s ALLUMÉ / 30 secondes ÉTEINT. Collectez toute la chromatine sonique dans un tube de 15 mL et centrifugez à 3 200 x g pendant 20 minutes en RT, puis transférez le surnageant (~13 mL) dans un nouveau tube de 15 mL.

4. Préclair chromatine avec des billes de C1

1. Préparez des billes de Streptavidine C1 : Des billes de Streptavidine C1 de 400 μL en aluminium dans un tube de 1,5 mL (100 μL par 1 × 10 cellules 9 S2), placez sur un aimant pendant 30 s, puis retirez le surnageant. Laver deux fois avec 200 μL de tampon de lyse FA à 0,1 % (avec Triton X-100), puis resuspendre dans 100 μL de tampon de lyse FA à 0,1 % (avec Triton X-100).
2. Préclair de chromatine : Ajouter les 100 μL de billes préparées de Streptavidine C1 dans le tube contenant ~13 mL de surnageant de chromatine sonique (de l’étape 3.2) ; rotation de 20 minutes à RT ; placer sur un support magnétique pendant 1 minute et transférer le surnageant (chromatine pré-clearée) dans de nouveaux tubes de 50 mL ; prendre 10 μL et stocker à −20 °C pour QC1 (Figure 3A).

5. Hybrider la sonde ARN avec la chromatine pré-clearée

1. Ajouter 2 volumes (26 mL) de tampon d’hybridation fraîchement préparé à 1 volume (13 mL) de chromatine pré-dégagée ; Tourne 30 minutes à la RT.
2. Aliquote le mélange en trois tubes de 15 mL ; ajouter 6 μL de sondes biotinylées de 100 μM (oligonucléotides d’ADN, tableau 1) à chaque échantillon (2 μL par tube de 15 mL) ; Tournez à 37 °C pendant la nuit. Scellez les bouchons des tubes avec du film.

6. Immobiliser la sonde - complexe de chromatine sur les billes C1

1. Bloquez les billes de Streptavidine C1 avec tampon de blocage : Prenez 400 μL de billes fraîches de Streptavidine C1 et lavez deux fois avec 800 μL de tampon de lyse FA à 0,1 % (sans Triton X-100) ; ajouter 400 μL de tampon de blocage et incuber sur un mélangeur (F8) pendant 30 minutes à la réanimation. Placer sur un aimant pendant 10 minutes et éliminer le surnageant ; lavage trois fois avec 800 μL de tampon de lyse FA à 0,1 % (sans Triton X-100). Pour chaque lavage, faites doucement une pipette pour mélanger, placez sur l’aimant pendant au moins 30 secondes, puis jetez le surnageant.
2. Resuspendez les billes C1 dans 400 μL de tampon d’hybridation.
3. Immobiliser le complexe sonde-chromatine sur les billes de Streptavidine C1 : Ajouter les billes de streptavidine C1 traitées au tampon de blocage à la chromatine hybridée correspondante et faire pivoter pendant 2,5 heures à la RT.
4. Transférez la réaction d’immobilisation des tubes de 15 mL vers un tube de 1,5 mL à l’aide d’un support magnétique. Placer chaque tube de 15 mL sur un support magnétique pendant 5 minutes ; Retirez le surnageant. Résuspendez les billes avec 1 mL de tampon de lavage et transférez dans un nouveau tube de 1,5 mL.
5. Lavez les billes cinq fois avec 800 μL de tampon de lavage, puis deux fois avec un tampon TE. Pour laver, ajoutez un tampon, faites couver sur un mélangeur (F1, 12 tours/min) pendant 5 minutes à 37 °C, placez-le sur une grille magnétique pendant 30 s, puis jetez le surnageant.
6. Maintenez les billes dans 1 000 μL de tampon TE (1x PI) à RT.

7. Bloquage des sites inoccupés sur des billes de C1 avec de l’iodoacétyl-PEG2-biotine (IPB) dénaturée

1. Dissolvez 4,8 mg d’IPB dans 400 μL de tampon IPB Wash ; Tourne à la RT pendant 15 minutes.
2. Solution β-ME : Ajouter 1 μL de β-ME à 312 μL d’H₂O ; mélanger et faire pivoter à RT pendant 15 minutes.
3. Dénature de l’IPB : Ajouter 44 μL de la solution β-ME à 400 μL d’IPB ; mélanger et faire pivoter à RT pendant 15 minutes.
4. Bloquez les billes C1 : Ajoutez 220 μL de l’IPB dénaturé aux billes C1 liées au complexe sonde-chromatine (en 1 000 μL TE) ; Tourne à la RT pendant 15 minutes.
5. Lavez les billes C1 avec du TE cinq fois. Ajoutez le tampon, incubez sur un mélangeur (F8) pendant 5 minutes à RT, puis placez sur un rack magnétique pendant 30 s, et jetez le surnageant.

8. Réparation terminale de la chromatine (sur les billes)

1. Ajoutez 693 μL de mélange de réparation finale à la chromatine sur les billes de C1 et mélangez bien ; puis ajoutez 7 μL de polymérase ADN T4.
2. Incuber au thermomixeur (800 tr/min) à 12 °C pendant 30 minutes ; puis sur le mélangeur (F8) à 16 °C pendant 15 minutes.
3. Lavez les billes trois fois avec 800 μL de tampon ChIA-PET bien froid, puis une fois avec TE. Pour chaque lavage, faites doucement une pipette pour mélanger, placez sur l’aimant pendant au moins 30 secondes, puis jetez le surnageant.

9. Queue en A de chromatine (sur les billes)

1. Ajoutez 693 μL de mélange A-tailing à la chromatine sur les billes de C1 et mélangez bien, puis ajoutez 7 μL de fragment de Klenow (exo-3'-5').
2. Incubez sur le mélangeur (F1, 12 tr/min) à 37 °C pendant 50 minutes. Lavez les billes trois fois avec 800 μL de tampon ChIA-PET glacé, puis une fois avec un tampon d’élution.

10. Ligature de proximité par chromatine (sur billes)

1. Ajoutez 1 390 μL de mélange de ligature de proximité à la chromatine sur les billes de C1. Incuber sur le batteur (F8) à RT pendant 5 minutes.
2. Ajoutez ensuite 10 μL de ligase d’ADN T4. Faites tourner sur le mélangeur (F8) en RT pendant 5 minutes, puis passez en F1 (12 tours/min) en RT pendant 50 minutes, puis à 16 °C pendant la nuit.
3. Lavez les billes trois fois avec 800 μL de tampon ChIA-PET glacé, puis deux fois avec un tampon TE.

11. Libération de l’ADN de chromatine ligué par proximité provenant des billes de C1

1. Ajoutez 480 μL de tampon d’élution LC ChIP à la chromatine sur les billes de C1, mélangez bien, puis ajoutez 20 μL de protéinase K à 20 mg/mL pour le désentrecroisement.
2. Incubez au thermomixeur (950 tr/min) à 65 °C pendant la nuit.

12. Purification de l’ADN ligature de proximité (avec phénol : chloroforme : réactifs IAA)

1. Faites tourner le tube de verrouillage de phase haute densité à 13 500 x g pendant 2 minutes en RT. Ajoutez des produits de désentrecroisement (500 μL) dans le tube à verrouillage de phase haute densité.
2. Ajoutez 500 μL de Phénol : Chloroforme : IAA (en utilisant une pointe de pipette de 5 mL) au tube à verrouillage de phase haute densité. Mélangez doucement à la main.
   ATTENTION : Jouez dans une hotte à vapeur.
3. Centrifugeuse à 13 500 x g pendant 6 minutes en RT. Lors de la centrifugation, préparez un tube de 1,5 mL en ajoutant 52 μL d’acétate de sodium de 3 M (pH 5,5) au fond. Placez 1 μL de glycogène avec un colorant bleu sur le bouchon. Ne mélangez pas et ne fermez pas le tube à ce stade.
4. Transférez rapidement le surnageant du tube à verrouillage de phase haute densité vers le tube préparé de 1,5 mL.
5. Ajoutez 520 μL d’isopropanol glacé au tube de 1,5 mL. Mélangez doucement, puis laissez-le à -80 °C toute la nuit.
6. Retirez le tube de -80 °C et décongelez à RT (~10 min). Centrifugeuse à 13 500 x g pendant ~1 h à 4 °C pour précipiter l’ADN. Un comprimé bleu sera présent au fond du tube.
7. Lavez la pastille d’ADN avec de l’éthanol à 75 % et retirez soigneusement le surnageant. Ajoutez 800 μL d’éthanol glacé à 75 %, centrifugez à 13 500 x g pendant 5 minutes à 4 °C, puis retirez le surnageant. Répétez le lavage à l’éthanol une fois.
   ATTENTION : Retirez le surnageant immédiatement après centrifugation : d’abord avec une pointe de 1 mL, puis une pointe de 100 μL. Des tubes chauds peuvent déloger la pastille bleue.
8. Après le dernier lavage à l’éthanol, centrifugez à 13 500 x g pendant 10 minutes à 4 °C pour collecter tout éthanol résiduel au fond, puis retirez soigneusement l’éthanol restant.
9. Faites sécher la granule d’ADN dans le vide (généralement 1 min 30 s à 2 min). Resuspendez la pellete d’ADN dans 10 μL de tampon d’élution et incubez à RT pendant environ 2 heures. Quantifiez l’ADN à l’aide d’un quantificateur d’acides nucléiques et évaluez la qualité avec un système automatique d’électrophorèse capillaire (Figure 3B-C).

13. Étiquetage ADN Tn5 ligaturé à proximité

1. Test de tagmentation Tn5 : Préparez un volume total de réaction de 50 μL selon le Tableau 1. Dans un tube PCR sur glace, ajoutez séquentiellement 50 ng d’ADN QC1, ddH₂O, et 12,5 μL de tampon de tagmentation 4x. Enfin, ajoutez la quantité requise d’enzyme Tn5. Mélangez doucement en pipettant 10 à 20 fois après chaque addition, en évitant les bulles. Faites brièvement tourner le tube si nécessaire.
   REMARQUE : Mélanger doucement et éviter les bulles est essentiel pour le tagmentation. De plus, la quantité de Tn5 doit être optimisée empiriquement pour atteindre la distribution de fragments souhaitée (principalement 200 bp-1 ko), et les utilisateurs peuvent ajuster la plage de taille en ajustant l’entrée Tn5.
2. Réaction de marquage : Incubez la réaction à 55 °C pendant 10 minutes dans un instrument PCR avec le couvercle réglé à 70 °C, puis maintenez à 4 °C.
3. Libération de Tn5 et purification de l’ADN : Ajoutez 50 μL de tampon d’élution ChIP et 1 μL de Protéinase K à l’ADN marqué (pour une concentration finale de SDS de 0,5 %). Mélangez et faites éclore sur le thermomixeur à 65 °C et 900 tr/min pendant 30 minutes. Purifiez l’ADN avec un kit de purification de l’ADN et quantifiez l’ADN à l’aide d’un système automatique d’électrophorèse capillaire (Figure 3D).
   REMARQUE : À ce stade, les fragments d’ADN devraient principalement varier de 200 pb à 1 kb. Le rapport enzyme/ADN Tn5 doit être optimisé empiriquement.
4. Mise à l’échelle de la tagmentation Tn5 : Sur la base des résultats du test Tn5, augmentez la réaction pour l’ADN ligaturé de proximité en utilisant les mêmes conditions. Après l’étiquetage, retirez l’échantillon de l’instrument PCR et placez-le sur la glace. Descendez brièvement, incubez à la RT pendant 2 minutes, puis ajoutez 5,5 μL de SDS à 10 % (p/v ; concentration finale de SDS : 1 %). Mélangez en pipettant 10 à 20 fois, évitant les bulles, puis en faisant tourner un peu plus vite. Incuber des échantillons à 37 °C dans un instrument PCR pendant au moins 15 minutes. L’ADN marqué peut être stocké à -20 °C pendant plusieurs jours.

14. Blocage des perles M280

1. Prenez 20 μL de billes M280 et lavez-les deux fois avec 200 μL de tampon 1x B&W. Pour laver, ajoutez un tampon, resuspendez les billes en pipettant, faites une courte rotation vers le bas, placez sur un aimant pendant 30 secondes, puis retirez le surnageant.
2. Blocage des billes avec tampon de blocage : Resuspendez les billes M280 dans 100 μL de tampon de blocage ; Faites pivoter sur le mélangeur (F8) à RT pendant 45 minutes.
3. Lavage des perles : Faites une petite rotation vers le bas, placez sur l’aimant pendant 10 minutes, puis jetez le tampon de blocage. Lavez les billes deux fois avec 200 μL de 2x tampon noir et blanc.
4. Blocage des billes avec ADN génomique : Resuspendez les billes dans 100 μL de tampon 2x en noir et blanc, ajoutez 100 μL d’ADN génomique cisaillé (~500 ng, 300-500 pb), mélangez bien, puis faites tourner sur le mélangeur (F8) à RT pendant 30 minutes.
5. Éliminez le mélange d’ADN génomique et lavez les billes deux fois avec 200 μL de tampon 1x noir et blanc.

15. Immobilisation de l’ADN ligué sur des billes M280

1. Liaison de l’ADN lié aux billes M280 : Rejetez un tampon 1x noir et blanc. Ajoutez tout l’ADN fragmenté ligué aux billes M280, mélangez, puis faites tourner sur le mélangeur (F8) à RT pendant 45 minutes.
2. Faites brièvement tourner vers le bas, placez sur l’aimant, puis jetez le surnageant. Lavez les billes cinq fois avec 500 μL de tampon de lavage préchauffé à 37 °C ; une fois avec 500 μL de 1x B&N ; et une fois avec 200 μL de 1x noir et blanc. Placer sur un aimant pendant 1 minute, mélanger doucement au fond du tube, puis jeter le surnageant. Ajoutez 30 μL de tampon d’élution aux billes (ne pas mélanger).
   1. Pour laver, ajoutez le tampon, incubez 5 minutes sur le mélangeur (F8), placez 30 secondes sur l’aimant, puis jetez le surnageant. Les billes avec de l’ADN lié et lié peuvent être stockées à -20 °C.

16. Amplification de l’ADN ligué sur des billes M280

1. Préparez la réaction PCR (selon le kit de préparation de la bibliothèque ADN). Transférez les tubes PCR vers la machine PCR et installez le programme.
   REMARQUE : Les cycles d’amplification PCR sont essentiels pour la qualité finale de la bibliothèque ; augmenter le nombre de cycles réduit la complexité des bibliothèques. Optimisez le nombre de cycles empiriquement et ne dépassez généralement pas 15 cycles.
2. Purifiez le produit PCR à l’aide de billes magnétiques (Figure 3E). Sélection de la taille : Utilisez des billes magnétiques (0,8-0,61) pour faire une sélection double de taille de la bibliothèque RDD.
   1. La bibliothèque finale d’ADN devrait principalement varier de 250 à 600 pb (Figure 3F). Assurez-vous que 10 à 30 ng d’ADN de bibliothèque sont mesurés par un quantificateur d’acides nucléiques pour le séquençage.
3. Séquençage : sujet pour séquençage Illumina avec 2x 150 pb. La profondeur de séquençage dépend de l’expression de l’ARN, de la densité du site de liaison et des motifs à l’échelle du génome. Ici, roX2 sature à ~23M lectures et 7SK à ~8M lectures, donc ce dernier nécessite moins de profondeur. Commencez par espèce, puis évaluez la redondance pour toute profondeur supplémentaire : ~5 M pour Drosophila, ~20M pour l’humain/souris, ajusté selon les métriques de contrôle qualité.

Résultats

Ce protocole décrit la méthode RDD pour détecter les interactions ADN-ADN chromatine associées à l’ARN. Le flux de travail commence par un enrichissement biochimique des complexes ARN-chromatine à l’aide de sondes biotinylées, suivi d’une ligation de proximité pour relier des fragments d’ADN spatialement adjacents. Après avoir construit des bibliothèques de séquençage, un séquençage à haut débit est effectué.

L’analyse bioinformatique des données RDD est rationalisée par la plateforme^{ChIA-PIPE 13}. Les étapes clés de ce pipeline analytique incluent : le découpage des lieurs de séquençage à partir des lectures brutes, le mappage des lectures en binôme au génome de référence, le filtrage des paires de lectures mappées de manière unique, la suppression des doublons PCR, et l’attribution d’interactions aux sites d’ARN ciblés en fonction des coordonnées de la sonde. En général, environ 50 % des lectures séquencées sont conservées avec succès après le filtrage par liaison et qualité. Des événements d’interaction valides ont ensuite été agrégés pour générer des cartes de contact spécifiques au locus, fournissant des profils détaillés de l’architecture de la chromatine guidée par ARN. Pour les données RDD, nous avons mis en œuvre trois ajustements ChIA-PIPE : la séquence de liaison DDD (« ACGCGATATCTTATCTGACT ») a été utilisée à la place du liaison par défaut ChIA-PET (« ACGCGATGGCTACTCTGACT ») ; le regroupement en boucles a été réalisé avec une extension PET raccourcie de 50 pb en plus des 500 pb par défaut afin d’augmenter la précision positionnelle des sites d’interaction ARN ; et la couverture d’enrichissement ARN a été calculée avec deepTools (bamCoverage v3.5.1) en utilisant une taille de bin de 1 pb. Ces modifications — configuration du lien, réduction de l’extension PET pour un clustering plus fin, et ChIA-PIPE adapté à la couverture haute résolution pour les bibliothèques RDD.

La figure 4 présente des résultats représentatifs de la RDD pour deux ARN non codants : roX2¹⁴ (Figure 4A,C ; vert), un complexe d’ARN de compensation de dosage impliqué dans la régulation de la structure du chromosome X et de l’expression génique chez Drosophila, et 7SK¹⁵ (Figure 4B,D ; violet), un petit ARN nucléaire hautement conservé qui module l’élongation de la transcription en régulant l’activité P-TEFb chez les métazoaires. Les interactions de liaison à l’ARN et de chromatine détectées par la RDD sont visualisées conjointement avec les données RNAPII ChIA-PET (arcs bleus), mettant en lumière la relation structurelle entre les boucles associées à l’ARN et les éléments régulateurs clés tels que les promoteurs (P), les amplificateurs (E) et les sites de début ou de fin de transcription (TSS/TES). Les pics d’interaction marquants dans les données agrégées soutiennent un modèle dans lequel roX2 et 7SK interviennent tous deux entre les contacts critiques améliorateur-promoteur ou chromatine à longue portée.

L’analyse multidimensionnelle est réalisée en intégrant des interactions ancrées dans la RDD avec des cartes de conformation de chromatine génomique Hi-C (cartes thermiques rouges du panneau inférieur) et des marques épigénomiques (H3K27ac, H3K27me3), la transcription naissante (RNA-seq) et les données RNAPII ChIA-PET (Figure 4C,D). Dans ces régions, les domaines d’association topologique (TAD) sont clairement visualisés, avec des boucles de chromatine guidées par l’ARN souvent situées aux frontières des TAD ou s’étendant sur plusieurs TAD. Une annotation supplémentaire avec des données de modification des histones et de transcription permet de discriminer les régions de chromatine active et inactive. Les principaux centres de régulation centrés sur l’ARN sont entourés dans la figure.

Des schémas distincts apparaissent pour différents ncRNA. roX2 se caractérise par une liaison aux régions TES et une boucle vers les TSS, se localisant fréquemment aux frontières TAD et formant des contacts à longue portée pouvant traverser plusieurs TAD. En revanche, 7SK se lie principalement aux amplificateurs et forme des boucles à plus courte portée avec des promoteurs voisins, généralement sans franchir les frontières du TAD.

Collectivement, ces résultats confirment que la RDD est une méthode fiable et à haute résolution pour disséquer l’organisation 3D spécifique à l’ARN. Cette approche permet une investigation directe des rôles spatiaux des ARN régulateurs dans l’architecture du génome et l’expression génique à travers divers contextes biologiques.

Figure 1 : Schéma du flux de génération de la bibliothèque RDD. Les étapes centrales du flux de travail pour la génération de bibliothèques RDD sont présentées en séquence et accompagnées d’illustrations schématiques correspondantes. La procédure commence par un double réticulation et une marquage par chromatine, suivies d’une hybridation avec une sonde d’ARN modifiée par biotine et d’une immobilisation via streptavidine. Les étapes suivantes incluent le détachage en A, la ligature de proximité avec des liaisons modifiées à la biotine, et la construction de bibliothèques. Après ligation de l’ADN, une purification, une fragmentation médiée par Tn5, un enrichissement de biotine et une amplification de la bibliothèque sont réalisés. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 2 : Images microscopiques représentatives des cellules de Drosophila S2 démontrant les critères de contrôle qualité visuel pour la lyse cellulaire et la perméabilisation des noyaux. (A) La lyse cellulaire réussie se caractérise par la perméabilisation de la membrane plasmique et la libération cytoplasmique, rendant les noyaux facilement visibles. (B) La perméabilisation réussie des noyaux est indiquée par le gonflement cellulaire, le décollement partiel de la membrane plasmique et des noyaux intacts et clairement visibles. Barre-échelle = 100 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Analyse électrophhérographique des préparations de chromatine. Capture d’écran d’un système d’électrophorèse capillaire effectuant un profil de divers échantillons de chromatine. (A) Affiche une chromatine fragmentée (sonication) d’une taille allant d’environ 1000 à 3000 pb, indiquant une fragmentation réussie. (B) Illustre la chromatine associée à l’ARN (ARN associé + sondes non liées), avec un pic plus petit représentant les sondes non liées, comme indiqué par la flèche. (C) Présente une chromatine associée à l’ARN, présentant également une plage de concentration allant de 1000 à 3000 pb, reflétant les complexes ARN-protéine. (D) Représente la chromatine marquée avec Tn5, révélant une plage indiquant l’efficacité de l’étiquetage. (E) Affiche la distribution de la taille des fragments de la bibliothèque de séquençage après amplification, couvrant environ 180-1000 pb. (F) Montre la distribution de taille des fragments de la bibliothèque de séquençage après sélection de taille, avec des fragments principalement enrichis dans la plage de ~250-600 pb. Les valeurs RFU (unités relatives de fluorescence) sont indiquées pour chaque échantillon, démontrant une quantification efficace de l’intégrité et de la taille de la chromatine. Les pics violets représentent le marqueur. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 4 : Résultats représentatifs de la RDD pour les interactions chromatine associées à ncRNA. (A-B) Affiche les emplacements génomiques de la liaison ncRNA roX2 (vert) et 7SK (violette), ainsi que les boucles d’interaction éloignées correspondantes à la chromatine. Les données de RNAPII ChIA-PET (bleu) révèlent une relation régulatrice claire entre ces arc-ncRNA et l’expression génique, avec des pics indiquant la force d’interaction. Abréviations : TSS = site de début de transcription ; TES = site final de transcription ; P = promoteur ; E = améliorateur. (C-D) Fournit une vue à plus grande échelle de la relation entre les boucles de chromatine liées à l’arcnRNA roX2 et 7SK ainsi que les TADs (rouge), ainsi que les différents états actifs et inactifs de la chromatine et les niveaux d’expression génique. Les cercles mettent en évidence les zones avec des interactions significatives entre les TAD. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Tableau 1 : Réactifs de réaction RDD. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 2 : Compositions des tampons RDD. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Discussion

Étapes critiques de la méthode
Estimer la quantité de sondes d’ARN et les niveaux d’ARN correspondants dans la chromatine est crucial. Un excès de sondes peut conduire des sondes non liées occupant des sites de streptavidine pendant l’étape d’immobilisation, ce qui peut entraver la capture prévue des interactions de l’ARN cible. De plus, ajouter trop de streptavidine dépasse les matériaux et nécessite un IBP dénaturé plus efficace pour bloquer efficacement les sites vacants. Un blocage insuffisant peut nuire à l’efficacité de la ligation de proximité ultérieure, d’autant plus que le liaiseur de ligature de proximité comporte également des modifications de biotine. Si le blocage n’est pas suffisamment effectué, des portions du liant peuvent se lier directement aux billes de streptavidine, compliquant les résultats. De plus, le ratio liant par rapport à la chromatine doit être soigneusement estimé : un excès de liaison peut provoquer le marquage des deux extrémités de l’ADN de la chromatine, inhibant ainsi la ligature de proximité efficace.

Modifications de la méthode
Dans cette étude, nous illustrons la méthode RDD en utilisant des cellules S2 de Drosophila avec des ncRNA roX2 comme exemple. Les volumes de réactifs doivent être ajustés en fonction du type cellulaire et des niveaux d’expression des ncRNA ; si l’expression de l’ARNCn est élevée, on peut réduire la quantité cellulaire ou augmenter la concentration d’ARN dans la sonde, et inversement. Bien que ce protocole immobilise la chromatine sur les biles, une approche alternative consiste à effectuer une ligature de proximité in situ suivie d’un enrichissement avec des sondes ARN.

Spécificité, contrôles et contrôle qualité
Nous avions précédemment décrit et validé la RDD et réalisé des RDD parallèles sur plusieurs ARN, montrant une forte spécificité ; Les lecteurs peuvent se référer à l’ouvrage^{précédent 4,16}. La RDD nécessite un enrichissement dépendant de la sonde, spécifique au locus, reproductible et, lorsque possible, validé orthogonalement. Les interactions véritables répondent à trois critères : enrichissement dans les loci ciblés par la sonde versus les régions non liées à proximité ; dépendance à la sonde (absente ou nettement réduite dans les témoins négatifs) ; et la reproductibilité entre réplications biologiques et validation indépendante (par exemple, RT-qPCR). Les sondes antisens ont été conçues avec Stellaris, criblées par BLAST/BLAT pour éliminer les cibles hors cible, commandées avec de la biotine 3', et validées par RT et qPCR (y compris les contrôles de contamination ADN et l’enrichissement du site vs non-site). Nous recommandons trois témoins — sans sonde, sans brouillement/non ciblant, et sans lien avec ARN ou zone non liée — et évaluons la spécificité en comparant la couverture qPCR ou de séquençage entre échantillons cibles et témoins, en rapportant l’enrichissement des plis et le fond. Pour les ARN à faible abondance, augmentez la densité des sondes (dans les contraintes hors cible), augmentez la profondeur de séquençage et effectuez une validation orthogonale.

Dépannage de la méthode
Si les interactions ARN-chromatine capturées sont notablement faibles, l’efficacité de la ligature de proximité peut nécessiter une optimisation par des ajustements des quantités de liaison et de chromatine. De plus, des pics élevés de sondes non liées ont été observés grâce à des électrophhérogrammes capillaires automatiques. Les résultats indiquent qu’un trop grand nombre de sondes ont été ajoutées, ce qui peut être corrigé en réduisant la quantité utilisée.

Limites de la méthode
Un avantage clé de la méthode RDD est son efficacité à capturer des interactions spécifiques de chromatine associées à l’ARN, ce qui signifie que chaque expérience ne peut se concentrer que sur un ARN spécifique à la fois. De plus, comme la ligature de proximité est conçue pour détecter les interactions par paires, les interactions entre plusieurs sites ne peuvent pas être évaluées simultanément.

Importance de la méthode
La méthode RDD révèle non seulement les sites de liaison à l’ARN, mais éclaire également les relations d’interaction entre ces sites, enrichissant ainsi notre compréhension de l’architecture de la chromatine.

Utilisations pratiques et potentiel futur de la RDD
La RDD convient à divers ARN associés à la chromatine, y compris les ARN hôtes endogènes et les ARN exogènes provenant de virus ou d’autres micro-organismes, ce qui souligne sa large applicabilité dans différents domaines de recherche.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
0,5 M EDTA	Invitrogen	AM9260G
1 M acétate de magnésium	Sigma-Aldrich	63052-100ML
1 M Tris-HCl pH 7,0	Invitrogen	AM9851
1 M Tris-HCl pH 8,0	Invitrogen	AM9856
Tubes de 1,5 mL	Eppendorf	30108051
10 mM dATP	Invitrogen	18252015
SDS 10 % (poids/vol)	Invitrogen	AM9822
10 et fois ; Tampon de déroulement A	NEB	B7002S
10 et fois ; Tampon de réparation finale	NEB	B6002S
10 et fois ; Tampon de ligase ADN T4	NEB	B0202S
10 et fois ; Tampon TBE	Invitrogen	AM9863
Tubes à essai à fond rond de 14 mL	Corning	352057
2 et fois ; Mix maître PCR	NEB	M0541
20 et fois ; Tampon SSC	Invitrogen	AM9770
200-&mu ; Tubes PCR L	Sangon Biotech	F611541-0010
Bouteilles de stockage en PET carré de 250 mL	Corning	431531
2-Mercaptoéthanol (&bêta ;-ME)	Sigma-Aldrich	M6250-100 mL	! ATTENTION &beta ;-ME est toxique ; Utilisez-le toujours dans une hotte à fumée.
Tubes de 2 mL	Eppendorf	22431048
3 M Acétate de sodium pH 5,5	Invitrogen	AM9740
5 M NaCl  ;	Invitrogen	AM9759
5 M acétate de potassium	Sigma-Aldrich	95843-100ML-F
Bouteilles carrées en PET de 500 mL	Corning	431532
Bilan analytique	Sartorius	BP211D
Compteur automatique de cellules	Counterstar	IC1000
Système automatique d’électrophorèse capillaire	Bioptique	C100100
Sondes biotinylées	GENEWIZ		Référez-vous à < fort>Tableau 1
Poudre de blocage	Invitrogen	T2015
Oligos de liaison de pont	GENEWIZ		Référez-vous à < fort>Tableau 1
Incubateur CO2	Thermo Scientific	51033549
Diméthylsulfoxyde (DMSO)	Sigma-Aldrich	D2650-100 mL
Kit de préparation de bibliothèque d’ADN V2 pour Illumina	Vazyme	TD501
Kit de purification de l’ADN	Zymo	D4013
Dulbecco » s Phosphate Tamponné (DPBS) (1 et fois)	Gibco	14190250
Cocktail inhibiteur de protéase sans EDTA	Roche	11836170001
EGS (Éthylène glycol bis[succiniMidylsuccinate])	Thermo Scientific	21565
Tampon d’élution	Qiagen	19086
Alcool éthylique pur	Sigma-Aldrich	E7023-500 mL
Solution de formaldéhyde	Sigma-Aldrich	47608-250 mL-F	! ATTENTION Le formaldéhyde est toxique ; Utilisez-le toujours dans une hotte à fumée.
Formamide	Invitrogen	AM9342
Système d’imagerie sur gel	Tanon	3500R
Glycine	Invitrogen	50046-1kg
Glycogène avec colorant bleu	Invitrogen	AM9516
Cartouche à haute sensibilité	Bioptique	C105105
Tubes à verrouillage de phase haute densité (1,5 mL)	Qiagen	129046
Kit de test fluorométrique à haute sensibilité dsDNA	Invitrogen	Q32851
Index kit V2 pour Illumina	Vazyme	TD202
Iodoacétyl-PEG2-Biotine (IPB)	Thermo Scientific	21334
Alcool isopropylique	Sigma-Aldrich	I9030	! ATTENTION : L’alcool isopropylique est toxique ; Utilisez-le toujours dans une hotte à fumée.
Cartouche à base de kilo	Bioptique	C105106
Fragment de Klenow (3'&rarr ; 5' exo-)  ;	NEB	M0212L
Billes magnétiques	Beckman	A63881
Rack de séparation magnétique & nbsp ; pour tube de 15 mL	Invitrogen	12301D
Rack de séparation magnétique & nbsp ; pour tube de 2 mL	Invitrogen	12321D
Rack de séparation magnétique pour tube PCR	NEB	S1515S
Incubateur microbiologique	Thermo Scientific	IMH180
Microscope	Nikon	Eclipse TS2
Mixer	ELMI	RM-2L
N,N-Diméthylformamide (DMF)	Sigma-Aldrich	227056-100ML	! ATTENTION : Le DMF est toxique ; Utilisez-le toujours dans une hotte à fumée.
Microcentrifugeuse non réfrigérée	Eppendorf	5405000204
Eau sans nucléase (non traitée par DEPC, 1000 mL)	Invitrogen	AM9932
Eau sans nucléase (non traitée par DEPC, 50 mL)	Invitrogen	AM9937
Quantificateur d’acides nucléiques	Invitrogen	Q33226
Secoueur orbital	Cristal	SYC-2102
Phénol : Chloroforme : IAA	Solarbio	P1012-100mL
Solution de protéinase K	Invitrogen	AM2548
Centrifugeuse réfrigérée	Eppendorf	22628180
Incubateur réfrigéré	Thermo Scientific	IMP180
Microcentrifugeuse réfrigérée	Eppendorf	5404F1621754
Réfrigérateur	Haier	DW-25L262
Inhibiteur de RNase	Ambion	AM2696
Tubes de 15 mL sans RNase	Invitrogen	AM12500
Tubes sans RNase de 50 mL	Invitrogen	AM12502
Sonicator	Sonics & Matériaux	VCX130
Billes magnétiques recouvertes de streptavidine C1	Invitrogen	65001
Des billes magnétiques recouvertes de streptavidine M-280  ;	Invitrogen	11205D
T4 ADN ligase   ;	NEB	M0202S
ADN polymérase T4	NEB	M0203S
pH du tampon TE 8,0	Invitrogen	AM9849
Cycleur thermique	Bio-Rad	1851148
Thermomixeur	Eppendorf	5382000023
Triton X-100	Acros Organics	327371000-100 mL
Congélateur ultra-basse température	Thermo Scientific	995
Concentrateur à vide	TOMY	MV-100