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Article de méthode

Un modèle murin de Streptococcus pyogenes Infection cutanée nécrosante

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DOI :

10.3791/70159

6 mars 2026

Dans cet article

Résumé

Ce protocole décrit un modèle d’infection sous-cutanée chez la souris pour Streptococcus pyogenes qui permet une quantification indépendante de la charge bactérienne et de la progression des lésions. La méthode offre une plateforme standardisée et reproductible pour évaluer les rôles des facteurs de virulence bactérienne, des réponses immunitaires de l’hôte ou des interventions thérapeutiques visant à réduire les lésions tissulaires.

Résumé

Streptococcus pyogenes est un agent pathogène humain qui provoque de graves infections nécrosantes des tissus mous, caractérisées par une destruction rapide et étendue des tissus. Un défi majeur dans l’étude de ces infections est l’absence de modèles expérimentaux permettant une évaluation indépendante de la réplication bactérienne et des lésions tissulaires médiées par l’hôte. Cet article présente un modèle sous-cutané murien standardisé et reproductible de l’infection cutanée nécrosante de S. pyogenes , conçu pour surmonter cette limitation. Le protocole décrit la préparation d’un inocule bactérien en phase logarithmique, l’infection sous-cutanée de souris et la surveillance longitudinale du développement des lésions. Les étapes clés incluent la sonication des cultures bactériennes pour standardiser la longueur de la chaîne, l’imagerie numérique des lésions pour l’analyse quantitative de la surface ulcéraire, ainsi que la détermination de la charge bactérienne par homogénéisation tissulaire et plaque. Ce modèle polyvalent peut être facilement adapté pour évaluer les effets de gènes bactériens spécifiques, de facteurs hôtes ou d’interventions thérapeutiques sur la progression de l’infection et la pathologie tissulaire. En permettant une évaluation reproductible et quantitative des paramètres bactériens et de l’hôte, cette méthode offre une plateforme solide pour étudier la pathogenèse et tester des stratégies visant à limiter les lésions tissulaires lors d’une infection streptococomique invasive.

Introduction

Streptococcus pyogenes (Streptococcus du groupe A, GAS) est un agent pathogène humain important qui provoque des infections nécrosantes des tissus mous (NSTI)1, entraînant une destruction rapide de la peau et des tissussous-jacents 2,3,4. L’étude de la pathogenèse de ces infections nécessite des modèles animaux qui récapitulent les lésions tissulaires localisées tout en permettant une évaluation indépendante de la réplication bactérienne et de la pathologie médiée par l’hôte5. De nombreux modèles d’infection traditionnels, tels que l’inoculation systémique ou les systèmes de culture cellulaire in vitro, sont limités dans leur capacité à séparer la charge bactérienne des lésions tissulaires, ce qui rend difficile l’évaluation des contributions spécifiques des facteurs de virulence ou des réponses de l’hôte6.

L’objectif global de cette méthode est de fournir un modèle sous-cutané standardisé et reproductible de la zone nécrosante de S. pyogenes (S. pyogenes). La logique de cette technique est d’établir un système in vivo facile à gérer qui découple la réplication des agents pathogènes de la lésion tissulaire médiée par l’hôte. Ce modèle est très adaptable aux souches de souris de laboratoire courantes. Bien que la souche SKH1 (sans poils) soit souvent utilisée pour faciliter le suivi deslésions 7,8, le protocole fonctionne efficacement sur les souches à poils (par exemple, C57BL/6J) après dépilation. Les rapports publiés utilisent généralement soit un sexe, soit un seul sexe (souvent des femelles) et trouvent souvent une zone de lésion ou une charge bactérienne similaire selon les conditions expérimentales spécifiques rapportées ; cependant, le contexte génétique de l’hôte et le sexe peuvent influencer la gravité de la maladie à GAS dans certains contextes et doivent être pris en compte lors de la conception des expériences et de l’analyse desrésultats 9. Un avantage clé de ce modèle par rapport aux alternatives est sa capacité à surveiller longitudinalement une lésion localisée, permettant une quantification précise et indépendante de la surface ulcéreuse et de la charge bactérienne du même animal au fil du temps. Avec un inoculum et une souche bien choisis, les infections sous-cutanées sont souvent localisées et permettent d’étudier la progression et la résolution des lésions. Cela dit, la localisation de l’infection dépend de la souche, de l’inoculum et de l’hôte : certains isolats cliniques (ou souches qui développent des mutations du covRS) et des inocules suffisamment grands peuvent se disperser et provoquer une bactériémie ou une maladie mortelle chez des sourisimmunocompétentes 10. Les auteurs doivent rapporter la souche, l’inoculum, la voie et toute modification de l’hôte, et titrer les inocules lors de l’adaptation du modèle à un nouvel isolat. Cette approche est hautement reproductible, accessible et compatible avec diverses analyses en aval, y compris l’histologie et le profilage immunitaire.

Le protocole a été appliqué à plusieurs souches de GAS (y compris des isolats de type M1 tels que HSC511 et d’autres M1T1 10,12) ainsi qu’à des isolats cliniques NSTI. Comme les phénotypes de virulence diffèrent selon les types d’EMM et les isolatsindividuels 13, les chercheurs doivent optimiser empiriquement l’inoculum et surveiller la propagation systémique lors de la traduction du protocole vers de nouvelles souches.

Ce protocole convient aux chercheurs en pathogénie microbienne, immunologie et recherche translationnelle qui souhaitent étudier la virulence bactérienne, les réponses immunitaires de l’hôte ou de nouvelles stratégies thérapeutiques ciblant la préservation des tissus lors d’une infection invasive. Sa conception standardisée et quantitative permet une évaluation rigoureuse des interventions et offre une plateforme polyvalente pour étudier l’interaction entre la réplication des agents pathogènes et la lésion tissulaire médiée par l’hôte.

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Protocole

Toutes les expériences animales ont été réalisées en conformité avec le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de la Faculté de médecine de l’Université Marshall (IACUC) et l’Animal Resource Facility. Toutes les procédures impliquant Streptococcus pyogenes ont été réalisées dans l’établissement animalier assuré par le PHS et accrédité par l’AAALAC, sous confinement de niveau de biosécurité 2 (BSL-2), conformément aux protocoles institutionnels de biosécurité. Le flux de travail expérimental est illustré à la Figure 1.

REMARQUE : Les détails spécifiques concernant les réactifs, matériaux et équipements sont fournis dans le tableau des matériaux.

1. Préparation des bactéries pour l’inoculum

  1. Préparez une culture nocturne en inoculant Streptococcus pyogenes HSC5 d’un stock congelé dans 10,5 mL de milieu C (0,5 % peptone, 1,5 % extrait de levure, 10 mMK 2HPO 4, 0,4 mMMgSO 4 et 17 mM NaCl). Incubez statiquement à 37 °C pendant 16 à 20 heures.
  2. Mesurez la densité optique à 600 nm (OD600) de la culture nocturne. Centrifugez 10 mL de culture à 6 000 x g pendant 5 minutes à température ambiante.
  3. Résuspendez la pellete bactérienne dans 0,5 mL de bouillon Todd Hewitt frais préchauffé, complétée avec un extrait de levure à 1 %.
  4. Inoculez 50 mL de bouillon Todd Hewitt préchauffé, complétés avec un extrait de levure à 1 % dans un tube conique avec les bactéries en suspension à un OD600 de départ de 0,05.
  5. Incubez le tube à 37 °C sans secouer. Surveillez l’OD600 toutes les 30 minutes.
  6. Prélever les bactéries lorsque la culture atteint un OD600 de ~0,200 par centrifugation à 6 000 x g pendant 5 minutes à 4 °C.
  7. Jetez le surnageant et résuspendez la pellete dans 10 mL de solution sérale phosphate tamponnée (PBS) glacée, stérile.
  8. Centrifugez la suspension à nouveau à 6 000 x g pendant 5 minutes à 4 °C. Résuspendez le dernier pellet dans 1 mL de solution PBS stérile et glacée. Gardez la suspension sur glace.
    REMARQUE : Cette suspension bactérienne concentrée peut être maintenue sur glace jusqu’à 30 minutes avant de passer à la sonication.

2. Normalisation de la concentration bactérienne

  1. Transférez la suspension bactérienne de 1 mL dans un tube à microcentrifuge. Sonicez la suspension sur glace à l’aide d’un sonicateur à corne en coupe pour briser de longues chaînes de S. pyogenes.
    ATTENTION : Portez une protection auditive appropriée lors de la sonication. La procédure génère un bruit à haute fréquence pouvant causer des dommages auditifs.
  2. Réglez le sonicateur pour délivrer 5 cycles d’impulsions d’une minute (selon les sonicateurs). Pour confirmer la rupture efficace de la chaîne, placez une goutte de 10 μL de la suspension sonique sur une lame de microscope, couvrez avec une couche de protection, et visualisez sous 40X.
    REMARQUE : L’objectif de la sonication est de réduire les chaînes longues à des chaînes principalement courtes (idéalement 1 à 4 cellules par chaîne) et des cocci simples. Si les chaînes longues (>10 cellules) sont encore présentes, répétez le cycle de sonication.
  3. Préparez une dilution 1:100 des bactéries soniées dans une solution stérile de PBS.
  4. Chargez 10 μL de la bactérie diluée sur une chambre de comptage/hémocytomètre bactérien.
  5. Comptez le nombre de chaînes bactériennes dans 10 grands carrés de la chambre au microscope.
  6. Calculez la concentration bactérienne en unités formant colonie par mL (UFC/mL) à l’aide de la formule : Concentration = (Comptage total / 10) × Facteur de dilution × 1,25 × 106.
    REMARQUE : Chaque chaîne de cellules bactériennes est comptée comme une seule UFC.
  7. Diluez le stock bactérien sonique avec du PBS glacé jusqu’à une concentration finale de travail de 1 × 108 UFC/mL.

3. Infection sous-cutanée des souris

  1. Un jour avant l’infection, raser le flanc arrière gauche de chaque souris. Utilisez une tondeuse électrique pour retirer complètement tous les poils d’environ 2 cm x 2 cm.
  2. Anesthésiez une souris dans une chambre d’induction (induction à 4 %, 1,5 % d’isoflurane d’entretien). Pour maintenir la synchronisation de l’infection, traiter les souris en petits lotes gérables (par exemple, 5 à 10 souris par lot).
  3. À l’aide d’une seringue de 1 mL équipée d’une aiguille à 27 G, extraire 100 μL de l’inocule bactérien.
  4. Retirez la souris de la chambre d’isoflurane et insérez immédiatement l’aiguille par voie sous-cutanée dans le flanc arrière rasé de la souris anesthésiée, le biseau vers le haut.
  5. Injectez lentement tout le volume de 100 μL pour créer une goutte localisée. Retire l’aiguille.
  6. Ramenez la souris dans sa cage et surveillez jusqu’à ce qu’elle soit complètement rétablie de l’anesthésie.
  7. Répétez les étapes 3.2-3.5 pour toutes les souris de la cohorte expérimentale.
  8. Préparez des dilutions en série de 10 fois de l’inoculum bactérien restant dans PBS.
  9. Placez 5 μL de chaque dilution sur plaques d’agar. Incubez les plaques de façon anaérobie à 37 °C pendant la nuit pour confirmer la dose administrée.

4. Suivi longitudinal de la progression de l’infection

  1. Surveillez toutes les souris infectées au moins une fois par jour pour détecter tout signe d’inconfort. Respectez les critères humains établis, particulièrement importants lors de l’utilisation de souches hypervirulentes ou d’hôtes immunodéprimés.
  2. Anesthésiez chaque souris en suivant la procédure décrite à l’étape 3.2.
  3. Retirez la souris de la chambre d’isoflurane et placez-la sur le côté à côté d’une étiquette d’identification. Pour permettre le suivi longitudinal de souris individuelles, marquez (par exemple, un poinçon d’oreille, une étiquette d’oreille) chaque animal avant le début de l’expérience.
  4. Prenez une photo numérique de la zone de la lésion à l’aide d’un appareil photo monté directement au-dessus de la souris.
  5. Ouvrez l’image numérique dans un logiciel d’analyse d’image (ImageJ/Fiji). Sélectionnez l’outil Sélections à main levée depuis la barre d’outils.
  6. Tracez manuellement le périmètre de l’ulcère visible sur l’image.
  7. Ouvrez le menu Analyser et sélectionnez Mesure pour calculer la surface à l’intérieur du périmètre tracé.
  8. Notez la surface mesurée en millimètres carrés pour chaque souris à chaque point temporel.
    REMARQUE : L’expérience peut être mise en pause à ce stade. Les souris sont ramenées dans leurs cages pour une surveillance continue jusqu’au prochain moment d’observation ou point final.

5. Collecte de tissus et quantification de la charge bactérienne

  1. Euthanasiez les souris au point final de l’expérience par inhalation de dioxyde de carbone suivie d’une luxation cervicale, une méthode approuvée par l’IACUC de l’Université Marshall.
  2. À l’aide de ciseaux chirurgicaux stériles et de pinces, exciser aseptiquement toute la lésion ainsi qu’un minimum de tissu environnant. Assurez-vous que l’excision inclut toute l’épaisseur de la peau et le tissu sous-cutané sous-jacent, généralement jusqu’à la couche musculaire mais sans l’inclure, sauf si l’infection a visiblement envahi le fascia musculaire.
  3. Transférez le tissu dans un tube microcentrifuge à bouchon à vis stérile de 2 mL, pré-pesé, contenant 1 mL de PBS stérile et deux billes stériles en acier inoxydable de 2,8 mm.
  4. Notez le poids du tissu.
  5. Homogénéisez le tissu à l’aide d’un homogénéiseur mécanique réglé à 6,5 m/s pendant 60 s.
  6. Placez le tube sur de la glace pendant 5 minutes pour éviter la surchauffe.
  7. Homogénéisez le tissu pour un second cycle de 60 s à 6,5 m/s.
  8. Préparez des dilutions en série de 10 fois de l’homogénate tissulaire dans une plaque à 96 puits en utilisant du PBS stérile comme diluant. Placez 5 μL de chaque dilution sur plaques d’agar.
  9. Incubez les plaques anaérobies à 37 °C pendant 24 à 48 heures. Par exemple, placez des assiettes dans un bocal scellé avec un sachet générateur de gaz anaérobie et un indicateur anaérobie.
  10. Comptez les colonies sur des plaques avec 30 à 300 colonies. Calculez les unités formant la colonie par mL (CFU/mL) d’homogénéate tissulaire.

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Résultats

Le modèle d’infection sous-cutanée chez la souris pour S. pyogenes génère systématiquement un ulcère nécrotique localisé et progressif, permettant la quantification simultanée de la charge bactérienne et de la pathologie tissulaire. Les résultats représentatifs de ce protocole standardisé sont les suivants.

Les groupes expérimentaux comprennent généralement 6 à 10 souris pour fournir une puissance statistique suffisante (par exemple, 80-90 %) pour détecter des différences significativ...

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Discussion

Le modèle d’infection cutanée nécrosante sous-cutanée de S. pyogenes décrit ici fournit un système robuste et reproductible pour disséquer les mécanismes sous-jacents à une infection sévère des tissus mous. Sa valeur principale réside dans la capacité à découpler la charge bactérienne de la pathologie tissulaire, permettant des études mécanistes sur la manière dont les facteurs hôte et pathogène contribuent indépendamment à la progression de la maladie. Cette distinction est par...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par le Marshall University Startup Fund et la bourse Bench-to-Bedside (U54GM104942) de l’Institut des sciences cliniques et translationnelles de WV à WX. Subventions des National Institutes of Health R21 AI163825 (à MGC). Nous remercions la Dre Jill Khan (MA, DVM, MPH, DACLAM), DIRECTRICE DU CENTRE DE RESSOURCES ANIMALES DE L’UNIVERSITÉ MARSHALL, ET LA DR Monica Valentovic (PhD), présidente de l’IACUC, pour leur évaluation critique de ce manuscrit.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Seringue de 1 mLBD309628Pour l’injection sous-cutanée
Aiguille 28-GBD305109Pour l’injection sous-cutanée
Hémocytomètre bactérien / Chambre de comptageHausser Scientific02-671-6Pour le comptage bactérien avant l’inoculation
BD BBL GasPak EZ système anaérobie de conteneursBecton, Dickinson and Company (BD)260001Pour l’incubation anaérobie
Souris C57BL/6JLe laboratoire Jackson6648-12 semaines
Réservoir de dioxyde de carbone (CO2)Fournisseur localN/APour l’euthanasie
Sonicateur à corne en coupe  ; (par exemple, Q700)Qsonica431C2Pour standardiser la longueur de la chaîne bactérienne
Appareil photo numériqueN/AN/APour l’imagerie des lésions
Tondeuses électriquesWahlpar exemple, 8655-200Pour raser le flanc de la souris
Homogénéiseur FastPrep-24MP Biomédicals116005500Pour homogénéisation tissulaire
Logiciel ImageJInstituts nationaux de la santé (NIH)N/Ahttps://imagej.nih.gov/ij/
IsofluraneBaxter1001936060Pour l’anesthésie
Système d’anesthésie isoflurane   ; (Chambre & Vaporisateur)VetEquip ou équivalentN/APour l’anesthésie de la souris
PeptoneBecton, Dickinson and Company (BD)211677Pour la préparation du milieu C
Solution physiologique tamponnée au phosphate (PBS)Gibco10010023Stérile, pH 7,4
Souche de S. pyogenes HSC5Laboratoire CaparonIsolat clinique M1T1
Souris SKH1Laboratoires Charles River4778-12 semaines, sans poils
Billes en acier inoxydable, 2,8 mmMédecine universelleD1133-28Stérile
Ciseaux chirurgicaux stériles et pincesOutils scientifiques fins ou similairesN/APour la collecte de tissus aseptiques
Bouillon Todd HewittBecton, Dickinson and Company (BD)249240Pour la sous-culture bactérienne
Extrait de levure & nbsp ; (pour do moyen)Becton, Dickinson and Company (BD)212750Pour la préparation du médium C (comme pour le complément de bouillon)

Références

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