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Article de méthode

Métagénomique de la fraction virale de taille de l’ADN pour les échantillons de selles humaines

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DOI :

10.3791/70187

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24 mars 2026

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1Department of Plant Pathology, University of California, Davis

Dans cet article

Résumé

Nous présentons un protocole flexible pour générer des métagénomes de fractions de taille virale (viromes) de haute qualité à partir d’échantillons de selles humaines. Initialement développé pour la viromique des sols, ce protocole a ici été appliqué avec succès à des échantillons de selles, permettant une caractérisation robuste de la virosphère intestinale humaine.

Résumé

Comprendre la virosphère humaine saine (la composante virale du microbiome) nécessite des mesures précises de la composition des communautés virales à travers une grande diversité de types viraux. S’appuyant sur notre expérience antérieure avec les méthodes d’écologie des communautés virales du sol, nous démontrons ici une série d’approches de laboratoire pour enrichir et extraire l’ADN de virus extracellulaires dans des échantillons de selles humaines. Un protocole principal fonctionnel est présenté, ainsi que des options pour les écarts à différentes étapes. L’approche générale consiste à ajouter un tampon liquide (par défaut : solution séline phosphatée tamponnée enrichie par protéines, PPBS) pour faciliter l’élimination des particules virales libres de la matrice des selles, la centrifugation pour séparer la fraction liquide contenant des particules virales, la filtration (par défaut : taille pore de 0,2 μm) pour éliminer la plupart des cellules, la concentration des particules virales (par défaut : ultracentrifugation), l’élimination des acides nucléiques libres avec des nucléases avant la lyse vironique, puis l’extraction d’ADN pour le séquençage. Des techniques alternatives, incluant différents tampons, tailles de filtres et méthodes de concentration, sont également notées. Dans l’ensemble, plusieurs options sont proposées pour générer de l’ADN viromique de haute qualité pour le séquençage. Plutôt que d’adapter l’approche à des équipements et ressources spécifiques, la flexibilité du protocole devrait le rendre largement applicable dans les laboratoires avec des équipements de biologie moléculaire standard variés.

Introduction

La viromique, ou séquençage métagénomique non ciblé de la fraction de taille virale des communautés mixtes, peut fournir des éclairages sur la diversité, l’évolution et l’écologie des virus non cultivés. Depuis les premiers efforts pour cataloguer les communautés virales intestinales il y a plus de 20 ans, qui utilisaient notamment des méthodes développées pour des échantillons environnementaux comme l’eaude mer 1, les approches viromiques ont continué de permettre des découvertes en écologie virale au sein dumicrobiome humain 2. Cependant, il n’existe pas de protocole universel unique sur les viromiques, et les variations techniques peuvent influencer les résultats duséquençage 3,4, influençant finalement l’interprétation des dynamiques des communautés virales et entravent les comparaisons inter-études. Des protocoles optimisés, combinés à une compréhension approfondie de la manière dont les choix méthodologiques façonnent les profils de viromes, sont nécessaires pour caractériser de manière robuste la virosphère humaine.

Bien qu’il n’existe pas de protocole universel de viromiques, la base générale des méthodes de viromanie consiste à séparer et concentrer physiquement les particules extracellulaires de type viral (virions) en fonction de leur taille et/ou densité, à retirer les acides nucléiques libres (issus en partie de débris cellulaires ou de capsides virales compromises) avant la lyse vironique, et à extraire l’ADN et/ou l’ARN pour séquençage. Certaines techniques viromiques choisissent pour ou contre certains types viraux, que ce soit par choix intentionnel des chercheurs ou par limitation méthodologique non intentionnelle. La filtration à seringue ou sous vide est fréquemment utilisée pour éliminer les cellules microbiennes et autres débris, et la taille du filtre influence intrinsèquement la qualité et la composition du virome récupérable. Par exemple, la filtration peut augmenter la pureté duvirome 5, mais elle peut exclure les particules virales plusimportantes 6,7. Les méthodes de concentration de virions, telles que l’ultracentrifugation, la précipitation au polyéthylène glycol (PEG), l’ultracentrifugation à gradient de densité et l’ultrafiltration, présentent également des compromis entre pureté, débit et coût del’équipement 3,8. Plusieurs chimies tampons sont connues pour être efficaces pour la viromique. Ils n’ont peut-être pas d’impacts démesurés sur la caractérisation desviromes 9, mais les tampons de stockage et de resuspension peuvent tout de même affecter la récupération des virus et les profils de virome générés par analyse bioinformatique10,11. Enfin, comme les concentrations d’acides nucléiques viraux peuvent être faibles dans les échantillons naturels, de nombreuses études choisissent d’amplifier l’ADN viral avant la construction de la bibliothèque (par exemple, par amplification par déplacement multiple (MDA) ou amplification à amorce unique indépendante de la séquence (SISPA)). Pourtant, certaines de ces techniques introduisent un biaissignificatif 12,13. Dans l’ensemble, bien que de nombreuses méthodes viromiques puissent générer des viromes avec succès, des protocoles optimisés reconnaissant les biais et quelque peu standardisés permettront une recherche précise et reproductible sur les viromes.

Cet article présente un flux de travail flexible pour générer des viromes à partir d’échantillons de selles humaines. Adapté des techniques éprouvées de viromiques de sol 14,15,16, ce protocole comprend plusieurs étapes facilitant la modification, permettant aux chercheurs de l’adapter à leurs propres besoins d’équipement et de recherche. La méthode standard des viromiques de sol décrite ci-dessous, appliquée avec succès à la fois sur des échantillons de sol et de selles congelées, produit des viromes de haute qualité sans étape d’amplification de l’ADN viral avant la construction de la bibliothèque. Les suggestions de modifications de protocole ont été testées à des degrés divers dans d’autres études, mais leurs effets spécifiques en aval sur les séquences de virome des selles humaines n’ont pas été examinées ici.

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Protocole

Tous les sujets recrutés pour la collecte d’échantillons de selles ont donné leur consentement éclairé. Les protocoles de collecte d’échantillons ont été approuvés par le Conseil d’examen institutionnel de l’Université de Californie à Davis, et les études sont conformes à la Déclaration d’Helsinki. Ce protocole est adapté d’Emerson et al. (2022)17.

1. Préparation des matériaux

  1. Préparez une solution saline tamponnée phosphate enrichie en protéines (PPBS, 10x PBS, 1 % de K-citrate, 150 mMMgSO 4, 2 % d’albumine sérique bovine (BSA))18.
    REMARQUE : D’autres tampons couramment utilisés dans les protocoles viromiques sont le magnésium saline (SM)19 et le tampon amendé de citrate de potassium (AKC') 11.
    1. Ajoutez 10 mL de 10 PBS, 10 g de K-citrate, 18,05 g deMgSO 4 anhydres dans une bouteille en verre autoclavable de 1 L et remplissez jusqu’à 1 L d’eau de laboratoire ultra-pure. Ajustez le pH à 6,5 (nécessite généralement environ 50 μL de 6 M HCl ou environ 100 μL de 2 M HCl). Laissez une barre de brassage à l’intérieur de la bouteille pour l’utiliser à l’étape 1.1.2.
    2. Autoclave la bouteille avec tampon et une bouteille en verre autoclavable vide de 1 L. Après l’autoclavage, une fois que le tampon refroidit à température ambiante, placez-le sur une plaque magnétique de remuage et ajoutez lentement 20 g de BSA directement dans la bouteille, en ajoutant environ 5 g de BSA à la fois (pour éviter la mousse, minimisez l’agitation excessive de la solution, par exemple commencez par un remuage lent et augmentez progressivement).
    3. Filtrez tout le volume tampon à travers un filtre à vide stérile de 0,22 μm dans la bouteille vide autoclavée de 1 L de l’étape 1.1.2. Conservez le tampon à 4 °C jusqu’à utilisation.
      REMARQUE : Le tampon PPBS peut être stocké à 4 °C pendant environ 3 mois, mais il n’est pas stable à long terme lorsqu’il est stocké au-dessus de zéro.
  2. Préparez les tubes ultracentrifuge.
    REMARQUE : Ce protocole utilise l’ultracentrifugation pour concentrer les virions. D’autres approches courantes incluent la précipitation au polyéthylène glycol (PEG), l’ultracentrifugation par gradient de densité (par exemple, gradients de chlorure de césium) et l’ultrafiltration.
    1. Pour nettoyer les tubes des ultracentrifugeuses, d’abord, frottez-les avec de l’eau de laboratoire ultra-pure. Ensuite, rince les tubes avec de l’eau de laboratoire ultra-pure.
    2. Remplissez les tubes avec 1 M de NaOH et laissez tremper au moins 1 heure (on peut laisser tremper toute la nuit). Nettoyez les capsules en plastique/caoutchouc des ultracentrifugeuses et leurs joints toriques en les immergeant dans 1 M de NaOH.
      REMARQUE : Ne plongez pas les bouchons métalliques à vissage dans NaOH.
    3. Après le trempage, rincez trois fois avec de l’eau de laboratoire ultra-pure, suivie d’un rinçage avec de l’eau sans nucléase, de qualité biologie moléculaire. Séchez les tubes en les inversant et en tapotant doucement, ou en les laissant sécher complètement toute la nuit. Étiquetez chaque tube d’ultracentrifuge avec un identifiant d’échantillon.
  3. Pré-refroidissez le rotor de l’ultracentrifugeuse à 4 °C en laissant le rotor au réfrigérateur ou dans la chambre froide toute la nuit.

2. Purification et concentration des virions

  1. Pèser les selles dans un tube conique stérile, sans DNase, RNase et ADN, de 50 mL.
    REMARQUE : La quantité de selles utilisée peut dépendre de la quantité de matière d’échantillon disponible. Ici, 2 g de selles ont été utilisées. Si le matériel d’échantillon inutilisé doit être stocké congelé, il est envisageable d’aliquote de l’échantillon complet avant la congélation afin de minimiser les futurs cycles de gel-dégel et de dégel.
  2. Ajoutez 8 mL de tampon PPBS directement dans les tubes coniques contenant la selle (conique #1). Suspendez complètement par vortex.
  3. Secouez les tubes à 300 tr/min à 4 °C pendant 10 minutes.
    REMARQUE : Si nécessaire, le secouage peut être effectué à température ambiante, mais 4 °C est recommandé.
  4. Centrifugez les échantillons en conique #1 à 4 000 x g à 4 °C pendant 10 minutes.
    REMARQUE : Utilisez un rotor à seau pivotant, si possible, pour faciliter la séparation verticale de la densité et faciliter les étapes suivantes.
  5. Découper soigneusement le surnageant en une nouvelle conique stérile de 50 mL (conique #2) et stocker à 4 °C (le surnageant ici contient les virions). Ne jetez pas le tube conique contenant la pelote (conique #1), car il est utilisé à nouveau à l’étape 2.6.
  6. Répétez les étapes 2.2-2,5 deux fois de plus (de sorte que l’échantillon dans la conique #1 ait subi un total de 3 fois la resuspension avec tampon, 3 fois le secouement et 3 centrifugation) et continuez à regrouper le surnageant dans la conique #2.
    REMARQUE : Trois cartouches devraient accumuler un total de ~24 mL de surnageant.
  7. Centrifugez le tube conique de 50 mL contenant le surnageant accumulé (conique #2) pendant 8 minutes à 10 000 x g à 4 °C.
  8. Effectuez une deuxième centrifugation. D’abord, décanter le surnageant de la conique #2 dans un nouveau tube conique de 50 mL (conique #3). Centrifugez la conique #3 pendant 8 minutes à 10 000 x g à 4 °C.
  9. À l’aide de la filtration à la seringue, filtrez séquentiellement le surnageant du conique #3, en évitant la pellete au niveau ou près du fond du tube. Préfiltrez à l’aide d’un filtre à seringue stérile de polyéthérsulfone (PES) de 5,0 μm, suivi d’un filtre à seringue PES stérile de 0,20 μm, directement dans un tube ultracentrifuge.
    REMARQUE : Le but du pré-filtrage avec des filtres de 5,0 μm est de réduire l’encombrement des filtres de 0,20 μm. Il peut toujours être nécessaire de jeter et de remplacer les filtres à seringue s’ils se bouchent. La filtration peut être effectuée en une seule étape en empilant le filtre 5 μm sur le filtre de 0,20 μm, fixé à une seule seringue, et directement dans un tube ultracentrifuge. Les membranes PES sont préférées, car d’autres matériaux membranaires peuvent retenir les virions (par exemple, la fibre de verre) ou se boucher plus rapidement (par exemple, fluorure de polyvinylidène, PVDF). 0,45 μm est une autre taille de filtre courante.
  10. Vérifiez la masse de tous les tubes ultracentrifuge avec leur contenu d’échantillon, et associez les tubes dans l’ultracentrifuge selon la masse. Si nécessaire, ajoutez du PPBS dans le tube le plus léger de chaque paire pour égaliser le poids (avec une marge d’erreur de 0,05 g pour les tubes appariés).
  11. Ultracentrifuge à 112 000 x g à 4 °C sous vide pendant 2 h 25 min.
    REMARQUE : Selon le rotor utilisé, la durée de rotation variera (selon le coefficient sédimentaire (s) = 58). Consultez le tableau des matériaux pour le rotor utilisé ici. Avant de retirer les tubes de l’ultracentrifugeuse, notez l’orientation de chaque tube dans le rotor pour aider à localiser la pelote virale. Parfois, après l’ultracentrifugation, le pellet viral n’est pas visible, et il convient de faire preuve d’une attention particulière lors du retrait du surnageant à l’étape suivante.

3. Resuspension virale de granulés et traitement de la DNase

  1. Retirez le surnageant soit par décantation, soit à l’aide d’une pipette, en veillant à ne pas déranger la pellete, qui peut être fragile (la pellete contient les virions concentrés).
    REMARQUE : Comme indiqué à l’étape 2.11, la boule peut ou non être visible, mais une boule brune ou jaune de la taille d’un trou de perforation peut souvent être visible.
  2. Traitez les échantillons avec de la DNase.
    REMARQUE : Si vous choisissez de ne pas traiter des échantillons par DNase, passez à l’étape 4 et suivez « Si le traitement par DNase n’a pas été réalisé ». Consultez la Discussion pour les considérations concernant la réalisation d’un traitement à la DNase.
    1. Resuspendez le pellet dans 100 μL d’eau de qualité biologique moléculaire sans nucléase dans un tube microcentrifuge marqué de 1,5 mL.
    2. Préparez le mélange maître du traitement DNase en ajoutant 10 μL de tampon de réaction DNase et 10 μL de DNase pour chaque échantillon à traiter. Pipette pour bien mélanger.
      REMARQUE : Préparez suffisamment de mélange maître de traitement DNase pour des réactions supplémentaires afin de tenir compte de la perte de volume potentielle lors du pipetage à l’étape 3.2.3.
    3. Ajoutez 20 μL du mélange maître du traitement DNase aux virions en suspension réintégrée. Mélangez bien en pipotant doucement. Incubez à 37 °C pendant 30 minutes.
    4. Ajoutez 10 μL de solution d’arrêt de DNase pour inactiver les nucléases. Un court vortex.

4. Extraction des acides nucléiques viraux

  1. Effectuez l’extraction ADN à l’aide du kit d’extraction ADN indiqué dans le tableau des matériaux.
    REMARQUE : Apportez deux modifications aux instructions du fabricant. 1) Après l’étape 1 de la procédure du kit, chauffez le tube à billes contenant les virions dans le tampon CD1 à 65 °C pendant 10 minutes, puis procédez à l’extraction selon les instructions du fabricant. 2) Pendant l’étape d’élution de l’ADN (étape 16 de la procédure du kit), incuber les colonnes à température ambiante pendant 5 minutes après avoir ajouté du C6.
    1. Si un traitement par DNase a été réalisé : Après l’inactivation des nucléases (à l’étape 3.2.4), utilisez l’ensemble du volume comme entrée pour l’extraction de l’ADN (c’est-à-dire à l’étape 1 de la procédure du kit d’extraction ADN, ajoutez ce volume au tube à billes contenant 800 μL de CD1). Veillez à ne laisser aucune solution derrière vous (cette solution contient les virions).
    2. Si le traitement à la DNase n’a pas été réalisé : ajouter 100 μL d’eau moléculaire sans nucléase dans le tube ultracentrifuge contenant la pellete de l’étape 3.1. Grattez doucement la pelote et resuspendez-la. Utilisez la pellete resuspendue comme entrée pour l’extraction de l’ADN.

5. Quantification de l’ADN

  1. Quantifiez l’ADN extrait avec la méthode de fluorescence choisie.
    REMARQUE : Les rendements d’ADN de Virome sont rarement suffisamment élevés pour une quantification basée sur l’absorption ; Cependant, cela peut tout de même être utile pour identifier les contaminants chimiques.
  2. Pour un stockage à court terme, stockez l’ADN à -20 °C après la quantification. Pour un stockage à plus long terme, conserver à -80 °C. L’ADN est désormais prêt pour la préparation et le séquençage de la bibliothèque. Consultez le tableau des matériaux pour le kit de préparation de la bibliothèque et la plateforme de séquençage utilisés ici.

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Résultats

Un effort exploratoire appliquant ce protocole à un seul échantillon de selles congelées (traité en triple exemplaire technique pour les viromes) accompagné de deux échantillons de sol a démontré son efficacité dans la production de viromes de haute qualité à partir de différents types d’échantillons. En utilisant des données de séquençage filtrées par la qualité et des contigs assemblés de novo générés par ce protocole, des séquences virales présumées ont été identifié...

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Discussion

Ce protocole présente une méthode relativement simple et adaptable pour générer des viromes. Prouvé dans les sols14, 15, 16, 21, il est appliqué avec succès ici sur des échantillons de selles humaines. Ce protocole permet de récupérer au mieux les virus à ADN extracellulaires intacts et n’est pas conçu pour récupérer intentionnellement des virus intracellulaire...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.

Remerciements

Nous remercions les Drs Sean Adams, Trina Knotts et Mohamed R. Ali (faculté de médecine de l’Université de Californie, Davis) pour la collecte et la fourniture de l’échantillon de selles conformément aux protocoles et normes éthiques de l’IRB. Nous remercions le Dr Matthew R. Olm (Université du Colorado, Boulder) pour sa collaboration sur l’analyse de l’échantillon de selles. Cette recherche a été soutenue par le NIH Common Fund (Human Virome Program), Prix # U01DE034198. LSH a également été partiellement soutenue par le Département de l’Énergie des États-Unis (DOE), le Bureau des sciences, l’Office de la recherche biologique et environnementale (BER), le programme de sciences génomiques, numéro de subvention DE-SC0023127 (subvention à JBE, chercheur principal Sydney Glassman).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Poudre sans DNase et Protéase pour l’albumine sérique bovine (BSA)Fisher BioReagentsBP9706100Pour la recette PPBS (Étape 1.1)
DNeasy PowerSoil Pro KitQIAGEN47016Kit d’extraction d’ADN (Étape 4.1)
Kit de bibliothèque KAPA DNA HyperPrepRocheN/DLes bibliothèques générées par ce kit étaient séquencées à l’aide de la plateforme Illumina NovaSeq 6000 (2 x 150 bp).
Sulfate de magnésium (MgSO4), anhydre, etc. 99.5%Sigma-AldrichM7506Pour la recette PPBS (Étape 1.1)
Solution physiologique tamponnée au phosphate (PBS), 10x, pH 7,4, sans RNaseInvitrogenAM9624Pour la recette PPBS (Étape 1.1)
Filtres à seringues à membrane en polyéthérsulfone (PES), stériles, 28 mm, 0,2 & mu ; mCorning431229Pour la filtration à la seringue (Étape 2.9)
Tubes centrifugeurs coniques en polypropylène, stériles, 50 mLOlympus Plastics28-108
Citrate de potassium monohydrate (cristallin/certifié)Fisher ChemicalP222Pour la recette PPBS (Étape 1.1)
Qubit  ; Tubes d’essaiInvitrogenQ32856Pour la quantification de l’ADN (Étape 5.1)
Fluoromètre Qubit 4InvitrogenQ33238Pour la quantification de l’ADN (Étape 5.1)
Kits de quantification de l’ADN dsDNA QubitInvitrogenQ32850Pour la quantification de l’ADN (Étape 5.1)
RNase sans RNase RQ1PromegaPR-M6101Comprend le tampon de réaction, la DNase et la solution d’arrêt
Filtres à membrane hydrophiles polyéthérsulfone (PES), stériles, 32 mm, 5,00 & micro m  ;Cytiva (anciennement Pall Lab)28150-956Pour la filtration à la seringue (Étape 2.9)
Rotor ultracentrifuge : Type 50.2 Ti Fixed Angle Rotor, 50 000 tr/min, 302 000 x g, 12 x 39 mBeckman Coulter337901Nous utilisons également le disque Beckman Coulter Type 70 Ti en titane à angle fixe (cat. 337922). Centrifugez pendant 3 heures si vous utilisez le 70 Ti.
Ultracentrifuge tubes : bouteille en polycarbonate de 26,3 mL avec ensemble bouchon, 25 x 89 mmBeckman Coulter355618Compatible avec les rotors Beckman Coulter Type 50.2 Ti (cat. 337901) et Type 70 Ti (Cat. 337922)
Ultracentrifugeuse : Beckman Instruments Optima LE-80K Ultracentrifugeuse de solBeckman Coulter365668Nous utilisons également la Beckman Coulter L8-70M Ultracentrifuge réfrigérée (Cat. 344196)

Références

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