Ce protocole présente un flux de travail reproductible pour l'analyse de données de transcriptomique spatiale, guidant les utilisateurs depuis l'acquisition de données publiques et le contrôle qualité basé sur Seurat jusqu'à l'intégration, la détection de caractéristiques spatiales, la déconvolution des types cellulaires, l'annotation de régions d'intérêt et l'analyse des communications cellule-cellule, avec des points de contrôle pratiques qui soutiennent une exécution transparente.
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Article de méthode
Un flux de travail pratique pour l'analyse des données de transcriptomique spatiale : de l'acquisition des données aux analyses avancées
Dans cet article
Résumé
Résumé
La transcriptomique spatiale (ST) caractérise l'expression génique à l'échelle du génome tout en préservant le contexte spatial bidimensionnel des molécules d'ARNm au sein des sections de tissus, permettant ainsi l'étude de l'architecture tissulaire et de la biologie associée au microenvironnement. Toutefois, l'analyse ST demeure difficile, car l'importation des données, le contrôle de qualité, l'intégration, la déconvolution, les statistiques spatiales et la visualisation nécessitent souvent plusieurs environnements logiciels ainsi que des choix de paramètres reproductibles. Ce protocole présente un flux de travail computationnel pratique pour les jeux de données ST publics en R, en commençant par l'acquisition des données et la configuration des logiciels, puis en poursuivant avec le chargement des données, le contrôle de qualité, la normalisation, l'intégration multi-échantillons, le regroupement (clustering) et l'analyse des gènes à variabilité spatiale basés sur Seurat. Le flux de travail applique ensuite des stratégies complémentaires de déconvolution, notamment une analyse SPOTlight guidée par référence et une modélisation thématique STdeconvolve sans supervision, suivies d'une analyse de communication spatiale entre cellules basée sur Giotto et d'une sélection interactive de régions d'intérêt (ROI) à l'aide d'une application Python Dash personnalisée. En mettant l'accent sur l'exécution par script, les justifications explicites des paramètres, les résultats attendus et des points de contrôle pour le dépannage, ce protocole fournit un cadre adaptable aux jeux de données ST standards basés sur puces d'éléments ainsi qu'à des plateformes apparentées, après évaluation des paramètres spécifiques à chaque jeu de données et à chaque plateforme.
Introduction
La transcriptomique spatiale (ST) est une famille révolutionnaire de technologies qui mesure l'expression génique à l'échelle du génome tout en conservant les coordonnées spatiales des molécules d'ARN messager (ARNm) au sein des sections de tissus. Les méthodes de ST comprennent des approches fondées sur le séquençage utilisant des réseaux à codes-barres positionnels et des approches d'imagerie in situ qui cartographient les signaux transcriptionnels dans des microenvironnements tissulaires intacts1,2. En préservant le contexte spatial, la ST permet l'analyse de l'architecture tissulaire, de l'organisation des voisinages cellulaires, de la communication entre cellules et des processus biologiques associés au microenvironnement, qui ne peuvent pas être entièrement résolus après la dissociation du tissu3.
La croissance rapide des dépôts publics de données de transcriptomique spatiale (ST) a créé des opportunités sans précédent pour l'analyse secondaire et le développement de méthodes3. Des ressources telles que la base de données CROST regroupent des centaines de jeux de données transcriptomiques à résolution spatiale provenant de multiples espèces et de diverses plates-formes technologiques, tandis que des collections spécialisées comme STOmicsDB se concentrent sur des méthodologies spécifiques telles que le Stereo-seq4,5. Malgré l'abondance de données, l'analyse computationnelle demeure difficile en raison de la complexité des structures des données spatiales, de la diversité des outils d'analyse et des obstacles techniques liés à la mise en œuvre de flux de travail reproductibles6,7,8,9,10,11.
Pour pallier les limites liées à l'utilisation d'un seul environnement logiciel, un flux de travail computationnel intégré utilisant des outils d'analyse complémentaires est présenté ici. Les écosystèmes d'analyse de données de séquençage spatial (ST) existants comprennent principalement Seurat, Giotto et des cadres basés sur Python tels que Squidpy6,7,12. Bien que les outils basés sur Python comme Squidpy offrent des fonctionnalités étendues pour l'analyse de graphes spatiaux, regrouper le pipeline computationnel principal au sein d'un seul environnement de langage de programmation permet de minimiser les obstacles techniques liés à l'interopérabilité entre langages. En conséquence, le pipeline central est principalement implémenté en R afin de réduire ces difficultés techniques inter-langages. Dans ce flux de travail basé sur R, Seurat est utilisé pour le chargement des données, le contrôle de qualité, la normalisation, la réduction de dimensionnalité, la visualisation et l'intégration de plusieurs échantillons, reflétant ainsi son utilisation courante dans les pipelines de transcriptomique unicellulaire et spatiale. Giotto est ensuite utilisé pour la construction du réseau spatial et l'analyse des communications cellule-cellule basée sur les interactions ligand-récepteur. Ce pipeline établit donc un lien entre le prétraitement et l'intégration fondés sur Seurat et l'analyse spatiale fondée sur Giotto, tout en rendant explicite et reproductible le transfert des données entre ces deux ensembles d'outils.
Dans ce cadre, deux stratégies complémentaires de déconvolution sont mises en œuvre : SPOTlight, une méthode guidée par référence qui utilise les données de scRNA-séquençage pour estimer les proportions de types cellulaires, et STdeconvolve, une méthode de modélisation thématique non supervisée qui identifie des profils transcriptionnels latents8,11. Les résultats fournissent des perspectives complémentaires sur l'hétérogénéité cellulaire spatiale, mais ne sont pas considérés comme une validation croisée quantitative, sauf si l'utilisateur effectue l'analyse de concordance facultative décrite dans le protocole. Une application Python Dash personnalisée, Select Spatial Spots, est intégrée pour l'annotation interactive de régions d'intérêt (ROI) et exporte des fichiers d'annotation standard basés sur des coordonnées, utilisables dans des analyses ultérieures en aval.
En ce qui concerne l'applicabilité pratique, ce flux de travail est conçu principalement pour les données spatiales standard basées sur des puces (par exemple, Visium avec une résolution de 55 µm) et pourrait être adapté à d'autres types de tissus après évaluation des paramètres. Certaines limitations importantes doivent être prises en compte avant l'analyse. Premièrement, le module de désconvolution guidée par référence dépend d'une référence de séquençage d'ARN monocellulaire (scRNA-seq) de haute qualité, appariée au tissu étudié. Deuxièmement, les plateformes subcellulaires ou quasi monocellulaires peuvent nécessiter un prétraitement modifié, un regroupement spatial des bins ou une segmentation cellulaire basée sur l'image avant l'intégration2. Le jeu de données représentatif du côlon de souris est utilisé comme cas démonstratif pour illustrer comment le flux de travail permet d'évaluer les domaines spatiaux et l'organisation tissulaire définie par des marqueurs, et non comme preuve d'une compatibilité universelle avec la plateforme.
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Protocole
Toutes les banques de données biologiques analysées dans ce protocole sont accessibles au public et utilisées uniquement à des fins de démonstration. Les numéros d'accès spécifiques aux données ainsi que les référentiels d'origine sont indiqués dans les étapes correspondantes. Les jeux de données originaux ont été produits par les chercheurs initiaux conformément aux lignes directrices éthiques institutionnelles applicables à chaque étude source. Consultez le Tableau des matériaux pour vérifier toutes les versions requises des logiciels et des packages R.
Exigences matérielles : La mémoire informatique requise pour ce flux de travail augmente en fonction du nombre d'échantillons et de points analysés. Pour un jeu de données typique de transcriptomique spatiale (par exemple, environ 3 000 points par échantillon sur un maximum de trois échantillons), une station de travail standard disposant d'au moins 16 Go de RAM suffit pour exécuter le pipeline. Toutefois, 32 Go de RAM ou plus sont fortement recommandés afin d'assurer des performances et une stabilité optimales, en particulier lors des étapes de calcul intensives en mémoire telles que la normalisation par SCTransform et la factorisation matricielle durant la déconvolution.
1. Acquisition des données et préparation de la structure des répertoires
- Obtenir des jeux de données publics de transcriptomique spatiale (par exemple, l'accession GEO GSE169749, avec une date de soumission du 26 mars 2021 et une dernière mise à jour du 6 mars 2022) et des données de référence d'ARN-séquençage en cellule unique (par exemple, l'accession GEO GSE264408, avec une date de soumission du 19 avril 2024 et une dernière mise à jour du 10 décembre 2024).
- Téléchargez l'archive des données brutes (par exemple, GSE169749_RAW.tar) depuis le référentiel et décompressez l'archive.
REMARQUE : Pour l'ensemble de données représentatif utilisé dans ce protocole, le répertoire extrait contient plusieurs fichiers pour chaque échantillon, les noms de fichiers incluant généralement l'identifiant d'échantillon GEO (par exemple, GSM5213483). - Organisez les fichiers selon une structure de répertoires normalisée compatible avec Seurat Load10X_Espace fonction.
- Créez un répertoire principal pour les données (par exemple, ./data/).
- Créez un sous-répertoire dédié pour chaque échantillon (par exemple, ./data/sample_A1/).
- Transférez (copiez ou déplacez) les fichiers essentiels suivants pour chaque échantillon dans le sous-répertoire correspondant.
- Placer le filtered_feature_bc_matrix.h5 transférez dans le sous-répertoire principal de l'échantillon.
- Créer un spatial/ sous-dossier dans chaque répertoire d'échantillon.
- Placez les fichiers suivants dans le spatial/ sous-dossier : tissue_positions_list.csv.gz, scalefactors_json.json.gz et tissue_hires_image.png.gz.
- Décompressez le .gz fichiers dans le spatial/ dossier. Veillez à ce que les noms de fichiers d'origine restent exactement tels que requis par le Load10X_Espace fonction (par ex., tissue_positions_list.csv).
REMARQUE : La structure finale et organisée pour un chargement sans problème doit suivre ce modèle, en prenant l'exemple de l'échantillon A1 :
./data/échantillon_A1/matrice_bc_filtre_avec_caractéristiques.h5
./data/échantillon_A1/spatial/positions_tissu_liste.csv
./data/sample_A1/spatial/facteurs_echelle_json.json
./data/échantillon_A1/spatial/image_tissu_haute_résolution.png
2. Configuration de l'environnement logiciel
- Installez R (version 4.4.3 ou supérieure).
- Obtenez les scripts d'analyse (1_ReadSpatialData.R à 8_Giotto_Communication.R) depuis le dépôt GitHub (https://github.com/LeafLight/SpatialTranscriptomicsWorkFlow, au commit d'empreinte 2d85e18 pour assurer la reproductibilité).
- Installez les packages R requis depuis CRAN et Bioconductor en exécutant le script setup.R.
NOTE : Une liste complète des versions spécifiques des packages utilisés dans ce flux de travail est fournie dans le Tableau des matériaux et est également disponible dans le fichier session_info.txt du dépôt GitHub associé (https://github.com/LeafLight/SpatialTranscriptomicsWorkFlow). - Installez la Giotto Suite en exécutant les commandes d'installation fournies dans la documentation officielle.
- Accédez à l'URL d'installation officielle pour récupérer les scripts de configuration : https://giottosuite.com/articles/installation.html
- Initialisez l'environnement Python requis et les dépendances système conformément aux instructions étape par étape.
- Installez des packages supplémentaires pour une visualisation améliorée.
- Exécutez : install.packages(c("ggprism", "colorBlindness"))
- Installez l'outil personnalisé Select Spatial Spots. Assurez-vous que le système d'exploitation est Windows, macOS ou Linux, et qu'une version de Python 3.8 ou supérieure est installée. Cette étape est facultative.
- Obtenez l'outil en accédant au dépôt GitHub (https://github.com/LeafLight/SelectSpatialSpots, au commit d'empreinte d20946e pour assurer la reproductibilité) et en téléchargeant le code source.
- Accédez au répertoire de l'outil et installez les dépendances Python : pip install -r requirements.txt
- Installez le package glmGamPoi en exécutant BiocManager::install("glmGamPoi") afin d'accélérer la normalisation SCTransform.
NOTE : Le flux de travail principal nécessite uniquement les packages listés aux étapes 2.1–2.3 et 2.6. Le package Rfast2 est utilisé pour accélérer le calcul de la statistique de Moran's I. Les packages facultatifs de l'étape 2.5 permettent de générer des graphiques prêts pour publication avec un thème de style prism (ggprism) et d'accéder à une palette de couleurs adaptée aux personnes malvoyantes (colorBlindness). L'outil de l'étape 2.6 active la fonctionnalité de sélection interactive des spots. Exécutez la commande sessionInfo() et enregistrez la sortie complète de la console dans un fichier texte. Cela documente précisément les versions des logiciels et les dépendances des packages, éléments essentiels pour garantir une reproductibilité à long terme.
3. Chargement des données spatiales et contrôle de qualité (1_ReadSpatialData.R, 2_SpatialDataQC.R)
- Lire les données spatiales dans des objets Seurat.
- Utiliser Read10X_Image pour charger manuellement l'image tissulaire haute résolution, en spécifiant le image.dir et image.name.
- Utiliser Load10X_Spatial avec le paramètre image défini sur l'objet image créé à l'étape 3.1.1 afin de créer l'objet Seurat.
- Calculer les métriques de contrôle qualité.
- Calculer le pourcentage de lectures mitochondriales à l'aide de PercentageFeatureSet avec le motif ^mt-.
- Visualiser et interpréter les données selon les métriques de contrôle qualité.
- Générer des diagrammes en violon de nCount_Spatial, nFeature_Spatial et percent.mt à l'aide de VlnPlot.
- Créer des diagrammes spatiaux des caractéristiques pour ces métriques à l'aide de SpatialFeaturePlot afin d'identifier les spots situés en dehors de la zone tissulaire.
NOTE : Point de contrôle visuel : les spots situés en dehors de la zone tissulaire affichent généralement un faible nombre de lectures UMI (nCount_Spatial < 500) et une faible détection de gènes (nFeature_Spatial < 200). - À des fins de démonstration, appliquer des filtres pour supprimer les spots de faible qualité (par exemple, subset(seurat_obj, subset = nFeature_Spatial > 200 & nCount_Spatial > 500)). Cette étape est facultative.
NOTE : L'objectif principal du contrôle qualité en transcriptomique spatiale est d'identifier et d'annoter les artefacts techniques, tels que les spots situés en dehors du tissu. Pour les données Visium du côlon utilisées en démonstration, les seuils nFeature_Spatial > 200 et nCount_Spatial > 500 permettent d'éliminer les spots à faible complexité ou correspondant au bruit de fond. Pour les tissus à faible teneur en ARN ou dégradés, examiner les diagrammes en violon et les diagrammes spatiaux des caractéristiques avant d'augmenter les seuils ; pour les tissus denses ou à nombre élevé d'UMI, des seuils plus stricts peuvent être appropriés. Éviter de filtrer uniquement sur des valeurs d'expression élevées, sauf si des doublets, des plis tissulaires ou des artefacts évidents sont visibles. Le filtrage n'est souvent pas recommandé car il supprime physiquement des emplacements spatiaux, ce qui peut perturber la continuité de la structure tissulaire pour les analyses spatiales ultérieures.
4. Prétraitement, intégration et regroupement des données (3_IntegrationAndClustering.R)
- Normaliser et prétraiter les échantillons individuels.
- Appliquer la normalisation SCTransform à chaque échantillon séparément avec assay = Spatial.
- Intégrer plusieurs échantillons.
- Préparer la liste des objets normalisés par SCT pour l'intégration. S'assurer que chaque objet possède un assay « RNA » en copiant l'assay « Spatial » : spatial_list[[1]][[« RNA »]] <- spatial_list[[1]][[« Spatial »]]
REMARQUE : Copier l'assay « Spatial » dans un emplacement d'assay « RNA » standard constitue une solution nécessaire pour assurer la compatibilité avec les fonctions d'intégration en aval initialement conçues pour les objets Seurat unicellulaires. - Utiliser SelectIntegrationFeatures et PrepSCTIntegration pour identifier les caractéristiques variables partagées.
- Trouver les ancres d'intégration à l'aide de FindIntegrationAnchors avec normalization.method = « SCT ».
- Intégrer les données à l'aide de IntegrateData avec normalization.method = « SCT ».
- Préparer la liste des objets normalisés par SCT pour l'intégration. S'assurer que chaque objet possède un assay « RNA » en copiant l'assay « Spatial » : spatial_list[[1]][[« RNA »]] <- spatial_list[[1]][[« Spatial »]]
- Réaliser une réduction de dimensionnalité et un regroupement sur l'assay intégré.
- Exécuter l'ACP sur les données intégrées à l'aide de RunPCA.
- Déterminer le nombre optimal de composantes principales (CP) pour l'analyse en aval en calculant la variance cumulée expliquée. Identifier le point du coude de façon programmée (par exemple, le point où la variance cumulée dépasse 90 % et où le gain marginal tombe en dessous de 0,1 %), en utilisant le code dans 3_IntegrationAndClustering.R, lignes 36-38. Le nombre résultant de CP sera désormais désigné par pc.use.
- Exécuter RunUMAP avec dims = 1:pc.use.
- Regrouper les cellules à l'aide de FindNeighbors avec dims = 1:pc.use et FindClusters avec resolution = 0,5. Ajuster la résolution uniquement après avoir examiné la stabilité des groupes et la cohérence des gènes marqueurs.
- Effectuer une analyse d'expression différentielle entre les groupes cibles (par exemple, « B1_colon_d14 » versus « A1_colon_d0 ») à l'aide de la fonction FindMarkers.
REMARQUE : Point de contrôle visuel : une intégration réussie affichera un mélange approprié des échantillons sur le graphique UMAP tout en conservant des groupes biologiquement distincts.
- Identifier les gènes variables spatialement.
- Pour chaque échantillon d'origine, exécuter FindSpatiallyVariableFeatures en utilisant la méthode « moransi » sur l'assay « SCT » afin de calculer l'autocorrélation spatiale.
5. Prétraitement des données de référence à cellule unique (4_scDataPreProcessing.R)
- Lire la matrice de comptage d'ARN-séquençage en cellule unique à l'aide de Read10X et créer un objet Seurat.
- Effectuer le contrôle qualité standard, la normalisation et le regroupement en clusters.
- Calculer le pourcentage de lectures mitochondriales (percent.mt) et filtrer les cellules (par exemple, nFeature_RNA > 200 & nFeature_RNA < 7500 & percent.mt < 25).
- Normaliser les données à l'aide de SCTransform, en définissant vars.to.regress = "percent.mt".
- Exécuter l'ACP, l'UMAP et regrouper les cellules en utilisant la méthode dynamique de sélection des composantes principales décrite à l'étape 4.3.2.
- Annoter les types cellulaires.
- Calculer les scores de module pour les gènes marqueurs canoniques des types cellulaires à l'aide de AddModuleScore.
- Annoter les clusters en fonction des scores de module et des connaissances biologiques établies. En alternative, importer des annotations pré-calculées à partir des métadonnées.
6. Décodage guidé par référence avec SPOTlight (5_SPOTlight_Deconv.R)
- Préparer les données pour SPOTlight.
- Convertir l'objet Seurat monocellulaire annoté et l'objet Seurat spatial en objets SingleCellExperiment.
- Normaliser les données monocellulaires par logarithme à l’aide de logNormCounts.
- Exécuter la déconvolution SPOTlight.
- Identifier les gènes hypervariables (HVG) dans les données monocellulaires à l’aide de modelGeneVar et getTopHVGs.
- Calculer les gènes marqueurs spécifiques aux types cellulaires à l’aide de scoreMarkers et filtrer les marqueurs de haute qualité (par exemple, mean.AUC > 0,8).
- Sous-échantillonner la référence monocellulaire pour chaque type cellulaire à un nombre gérable (par exemple, 50 cellules) afin de réduire le temps de calcul.
- Exécuter la déconvolution à l’aide de la fonction SPOTlight avec weight_id = "mean.AUC", group_id = "cluster", et gene_id = "gene".
- Visualiser et exporter les résultats.
- Extraire la matrice de résultats de déconvolution (proportions des types cellulaires par spot).
- Utiliser plotSpatialScatterpie pour visualiser la composition cellulaire sur les coordonnées spatiales.
- Ajouter les résultats de déconvolution aux métadonnées de l’objet Seurat spatial à l’aide de AddMetaData. Résultat attendu : une matrice de déconvolution comportant des colonnes de proportions de types cellulaires pour chaque spot spatial, des graphiques en camembert spatiaux montrant la composition cellulaire locale, et un objet Seurat contenant les proportions de déconvolution comme métadonnées.
7. Dédconvolution sans référence avec STdeconvolve (7_STdeconvolve.R)
- Préparer les données spatiales.
- Extraire la matrice de comptage brute à partir de l'objet spatial Seurat en utilisant GetAssayData avec slot = "comptages".
- Supprimer les spots et les gènes de faible qualité à l'aide de cleanCounts de STdeconvolve (par ex., min.lib.size = 100).
- Identifier les types cellulaires latents.
- Filtrer davantage le corpus pour les gènes exprimés dans une fraction minimale de spots en utilisant restreindreCorpus (par exemple, removeAbove=1.0, removeBelow = 0,05).
- Ajuster un modèle d’allocation latente de Dirichlet (LDA) pour une gamme de nombres potentiels de sujets (K) (par ex. Ks = seq(2, 9, par = 1)) en utilisant fitLDA.
- Sélectionner le modèle optimal en fonction de la perplexité minimale en utilisant modèle optimal avec opt = "min".
- Analyser et visualiser les résultats.
- Extraire les proportions de types cellulaires (thêta) et les profils géniques (bêta) à partir du modèle optimal en utilisant getBetaTheta.
- Pour faciliter l'interprétation biologique des thèmes déconvolués, importez des annotations de régions d'intérêt (ROI) générées par le "Sélectionner les spots spatiaux" outil (voir étape 9.3.3). Utilisez ces annotations comme paramètre de groupes dans le vizTousLesSujets fonction permettant de projeter les proportions de types cellulaires déconvoluées sur les coordonnées spatiales et de coder par couleur les points selon leur région d'intérêt (ROI). Cette étape est facultative.
REMARQUE : Le résultat attendu est que STdeconvolve renvoie des valeurs theta représentant les proportions de thèmes par point et des valeurs beta représentant les profils génétiques pour chaque thème. Si les utilisateurs souhaitent comparer quantitativement les résultats non supervisés de STdeconvolve avec les sorties de SPOTlight guidées par référence (de l'étape 6), ils peuvent exporter les deux matrices de proportions (theta issue de STdeconvolve et la matrice de SPOTlight) et calculer des mesures de corrélation ou de concordance par point (par exemple, corrélation de Pearson ou de Spearman) à l'aide de fonctions R standards. La comparaison quantitative entre SPOTlight et STdeconvolve est facultative et n'est pas requise pour exécuter le flux de travail principal ; toutefois, les matrices de sortie pertinentes sont disponibles aux étapes 6.3.1 et 7.3.1 pour les utilisateurs souhaitant réaliser une telle analyse.
8. Communication cellulaire spatiale à l'aide de Giotto(8_Giotto_Communication.R)
- Convertir l'objet Seurat en un objet Giotto.
- Utiliser la fonction createGiottoObject, en fournissant la matrice brute de comptages et les coordonnées spatiales.
- Prétraiter l'objet Giotto et ajouter les résultats de la déconvolution.
- Normaliser les données à l'aide de normalizeGiotto.
- Ajouter les annotations des types cellulaires (par exemple, le type cellulaire majeur issu de la déconvolution SPOTlight) aux métadonnées cellulaires à l'aide de addCellMetadata.
- Inférer la communication cellule-cellule informée spatialement.
- Créer un réseau spatial à l'aide de createSpatialNetwork avec method = "Delaunay" et name = "Delaunay_network".
- Charger une base de données de ligands-récepteurs dans l'environnement R. S'assurer que l'objet chargé est formaté comme une trame de données avec deux colonnes distinctes représentant les symboles génétiques du ligand et du récepteur (par exemple, un réseau souris pré-établi provenant de Zenodo : https://zenodo.org/api/records/15168114/files/lr_network_mouse.csv/content, version v6, publié le 7 avril 2025).
- Exécuter exprCellCellcom avec cluster_column = "celltype_major" pour identifier les interactions significatives ligand-récepteur entre les types cellulaires situés en proximité spatiale. Résultat attendu : un tableau contenant des paires ligand-récepteur, des combinaisons de types cellulaires sources et cibles, des valeurs de log2 fold-change et des valeurs de P ajustées ; conserver les interactions significatives (par exemple, p.adj < 0,05) pour la visualisation.
9. Sélection interactive de taches avec la fonction select spatial spots (6_SelectSpatialSpots.R)
- Préparer les données pour l'outil interactif.
- Extraire les coordonnées spatiales de l'objet Seurat à l'aide de GetTissueCoordinates.
- Formater et exporter les données.
- Formater le tableau de données des coordonnées afin qu'il contienne exactement les en-têtes de colonne suivants : CELL_ID, X et Y.
- Exporter le tableau de données formaté vers un fichier CSV.
- Effectuer l'analyse de la région d'intérêt (ROI).
- Lancer l'application personnalisée Dash Select Spatial Spots et charger le fichier CSV.
- Sélectionner interactivement des points en fonction de leur emplacement spatial.
- Exporter la liste des points sélectionnés et leurs étiquettes de groupe/ROI attribuées sous forme d'un nouveau fichier CSV. Résultat attendu : un fichier CSV contenant les identifiants des points, les coordonnées X/Y et les étiquettes de groupe/ROI attribuées, pouvant être appariés à l'objet Seurat via CELL_ID.
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Résultats
Mise en œuvre du flux de travail et intégration des données illustrant les caractéristiques majeures des tissus
Le flux de travail informatique a été appliqué à des données de transcriptomique spatiale du côlon de souris afin d'illustrer les résultats attendus à chaque étape analytique. Comme indiqué dans le schéma du flux de travail (Figure 1), le pipeline débutait par l'acquisition des données et le contrôle de qualité, où les graphiques spatiau...
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Discussion
Ce protocole fournit un flux de travail computationnel complet pour l'analyse de données de transcriptomique spatiale, équilibrant profondeur analytique et accessibilité pratique. L'approche étape par étape accompagne les chercheurs tout au long du pipeline analytique complet, de l'acquisition initiale des données jusqu'aux analyses spatiales avancées, en mettant l'accent sur les points de décision cruciaux et les pièges potentiels.
Plusieurs étapes du protocole méritent une attention particul...
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Déclarations de divulgation
Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt financier concurrent.
Remerciements
Les auteurs remercient les développeurs et mainteneurs des packages Seurat, Giotto et SPOTlight pour leur soutien et leur documentation. Les contributions des dépôts de données publiques et des chercheurs ayant généreusement partagé leurs jeux de données sont également chaleureusement reconnues.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| ggplot2 | Posit Software, PBC | v4.0.0(CRAN) | Visualisation avancée des données |
| Giotto | Dries Lab | v4.2.2 (GitHub) | Analyse des réseaux spatiaux et des communications cellule-à-cellule |
| patchwork | Thomas Lin Pedersen | v1.3.2 (CRAN) | Composition et disposition des graphiques |
| R software | Fondation R pour l'informatique statistique | v4.4.3 | Environnement d'exécution principal (macOS aarch64) |
| scater | Davis McCarthy et al. | v1.34.1 (Bioconductor) | Contrôle qualité et visualisation en cellule unique |
| scran | Aaron Lun et al. | v1.34.0 (Bioconductor) | Modélisation de la variance en cellule unique et détection de marqueurs |
| Select Spatial Spots (Outil Python personnalisé) | LeafLight | v1.0.0 (GitHub) | Sélection interactive de régions d'intérêt spatiales (ROI) (https://github.com/LeafLight/SelectSpatialSpots) |
| Seurat | Satija Lab | v5.3.0 (CRAN) | Prétraitement, intégration et regroupement des données spatiales |
| SeuratObject | Satija Lab | v5.2.0 (CRAN) | Structures de données pour les données en cellule unique et spatiales |
| SingleCellExperiment | Équipe centrale de Bioconductor | v1.28.1 (Bioconductor) | Conteneur de données standardisé pour la scRNA-séq |
| SPOTlight | Marc Elosua-Bayes et al. | v1.10.0 (Bioconductor) | Déconvolution spatiale guidée par référence |
| Stdeconvolve | Jean Fan Lab | v1.3.2 (Bioconductor) | Modélisation de sujets latents non supervisée |
| tidyverse | Posit Software, PBC | v2.0.0 (CRAN) | Suite principale de manipulation et de formatage des données |
Références
- Ozirmak Lermi N, Molina Ayala M, Hernandez S, et al. Comparison of imaging based single-cell resolution spatial transcriptomics profiling platforms using formalin-fixed paraffin-embedded tumor samples. Nat Commun. 2025;16(1):8499.
- Ren P, Zhang R, Wang Y, et al. Systematic benchmarking of high-throughput subcellular spatial transcriptomics platforms across human tumors. Nat Commun. 2025;16(1):9232.
- Danishuddin, Khan S, Kim JJ. Spatial transcriptomics data and analytical methods: An updated perspective. Drug Discovery Today. 2024;29(3):103889.
- Xu Z, Wang W, Yang T, et al. STOmicsDB: A comprehensive database for spatial transcriptomics data sharing, analysis and visualization. Accessed October 31, 2025. https://dx.doi.org/10.1093/nar/gkad933
- Wang G, Wu S, Xiong Z, Qu H, Fang X, Bao Y. CROST: A comprehensive repository of spatial transcriptomics. Nucleic Acids Res. 2024;52(D1):D882-D890.
- Chen JG, Chávez-Fuentes JC, O’Brien M, et al. Giotto Suite: a multiscale and technology-agnostic spatial multiomics analysis ecosystem. Nat Methods. 2025;22(10):2052-2064. doi:10.1038/s41592-025-02817-w
- Butler A, Hoffman P, Smibert P, Papalexi E, Satija R. Integrating single-cell transcriptomic data across different conditions, technologies, and species. Nat Biotechnol. 2018;36(5):411-420.
- Elosua-Bayes M, Nieto P, Mereu E, Gut I, Heyn H. SPOTlight: seeded NMF regression to deconvolute spatial transcriptomics spots with single-cell transcriptomes. Nucleic Acids Res. 2021;49(9):e50-e50.
- McCarthy DJ, Campbell KR, Lun ATL, Wills QF. Scater: pre-processing, quality control, normalization and visualization of single-cell RNA-seq data in R. Bioinformatics. 2017;33(8):1179-1186.
- Lun ATL, McCarthy DJ, Marioni JC. A step-by-step workflow for low-level analysis of single-cell RNA-seq data with bioconductor. F1000Research. Preprint posted online October 31, 2016. doi:10.12688/f1000research.9501.2
- Miller BF, Huang F, Atta L, Sahoo A, Fan J. Reference-free cell type deconvolution of multi-cellular pixel-resolution spatially resolved transcriptomics data. Nat Commun. 2022;13(1):2339.
- Palla G, Spitzer H, Klein M, et al. Squidpy: A scalable framework for spatial omics analysis. Nat Methods. 2022;19(2):171-178.
- Luecken MD, Büttner M, Chaichoompu K, et al. Benchmarking atlas-level data integration in single-cell genomics. Nat Methods. 2022;19(1):41-50.
- Hafemeister C, Satija R. Normalization and variance stabilization of single-cell RNA-seq data using regularized negative binomial regression. Genome Biol. 2019 Dec 23;20(1):296.
- Cuevas-Diaz Duran R, Wei H, Wu J. Data normalization for addressing the challenges in the analysis of single-cell transcriptomic datasets. BMC Genomics. 2024;25(1):444.
- Sun S, Zhu J, Zhou X. Statistical analysis of spatial expression patterns for spatially resolved transcriptomic studies. Nat Methods. 2020;17(2):193-200.
- Jin S, Plikus MV, Nie Q. CellChat for systematic analysis of cell–cell communication from single-cell transcriptomics. Nat Protoc. 2025;20(1):180-219.
- Zohora FT, Paliwal D, Flores-Figueroa E, et al. CellNEST reveals cell–cell relay networks using attention mechanisms on spatial transcriptomics. Nat Methods. 2025;22(7):1505-1519.
- Wang Q, Zhu H, Deng L, et al. Spatial transcriptomics: Biotechnologies, computational tools, and neuroscience applications. Small Methods. 2025;9(5):2401107.
- Chen MM, Gao Q, Ning H, et al. Integrated single-cell and spatial transcriptomics uncover distinct cellular subtypes involved in neural invasion in pancreatic cancer. Cancer Cell. 2025;43(9):1656-1676.e10.
- Li H, Guan W, Huang J, et al. A complete model of mouse embryogenesis through organogenesis enabled by chemically induced embryo founder cells. Cell. 2025;188(21):5912-5930.e20.
- Loh JW, Lee JY, Lim AH, et al. Spatial transcriptomics reveal topological immune landscapes of asian head and neck angiosarcoma. Commun Biol. 2023;6(1):461.
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