Colonisation avec Escherichia coli murine pks+ dans des conditions non inflammatoires

Résumé

Ce protocole décrit les étapes nécessaires à la colonisation de souris avec pks+ Escherichia coli dans des conditions non inflammatoires, ainsi que des méthodes non invasives pour la validation de la colonisation et l’évaluation de l’expansion de pks+ E. coli dans les selles.

Résumé

pks+ Escherichia coli est de plus en plus impliquée dans le développement du cancer colorectal (CRC), en particulier chez un sous-ensemble en rapide expansion de jeunes patients atteints de CRC à début précoce. Les souches pks+ d’E. coli produisent la génotoxine colibactine, connue pour provoquer des ruptures d’ADN double brin et des mutations dans les voies de prolifération et de différenciation cellulaires associées au CRC. Cet article détaille une méthode de colonisation de pks+ E. coli chez la souris dans des conditions non inflammatoires, de la préparation de l’inoculum bactérien jusqu’à la validation de la colonisation. Après une incubation nocturne, la souche d’E. coli NC101 de pks+ E. coli est administrée à des souris sous conditionnement antibiotique par gavage oral. La colonisation dans les selles est évaluée en quantifiant le nombre d’unités formatrices de colonies à gram-négatif (UFC) fermentant le lactose et par amplification quantitative par PCR. Grâce à ce protocole, il a été démontré qu’après la colonisation réussie de souris C57BL/6 avec E. coli NC101, la supplémentation en fibres alimentaires inuline favorisait la croissance de pks+ E. coli, ce qui se reflète par une récupération accrue des UFC, une plus grande abondance de la famille des Enterobacteriaceae et des niveaux accrus de la CleroP Gene. En résumé, ce modèle permet d’étudier des traitements préventifs et thérapeutiques ciblant un pathobiote clé impliqué dans le développement du CRC.

Introduction

Le microbiote intestinal est connu pour jouer un rôle important dans la santé et les maladies de l’hôte, avec la dysbiose microbienne intestinale, ou une prolifération excessive de certaines bactéries potentiellement pathogènes (pathobytes), identifiée comme une caractéristique de plusieurs pathologies, notamment les maladies cardiovasculaires, les maladies inflammatoires de l’intestin (MII) et^{le cancer 1}. pks+ Escherichia coli est un pathobiote enrichi dans les échantillons de tissu colic de patients atteints de^{MII 2} et de cancer colorectal (CRC⁾³ compar....

Protocole

Toutes les procédures ont été réalisées conformément aux directives du Conseil canadien de soins aux animaux après approbation par le Comité de recherche du Centre hospitalier hospitalier de l’Université de Montréal (CRCHUM). Des souris de sept semaines ont été prélevées à partir d’une source commerciale et acclimatées pendant une semaine avant le début de l’expérience. Une représentation schématique de cette méthode est présentée à la Figure 1. Les détails des animaux, réactifs et équipements utilisés dans cette étude sont listés dans le tableau des matériaux.

Résultats

L’amplification et la visualisation des gènes clbA et E. coli 16S dans les selles à la fin par PCR et électrophorèse sur gel ont montré que, bien que les deux gènes soient visibles chez les souris colonisées par E. coli NC101, seul le gène E. coli 16S était visible chez les souris témoins, confirmant que E. coli NC101 n’était pas présente (Figure 2B).

Comme prévu^{, 15}

Discussion

Les effets pro-cancérogènes de la pks+ E. coli productrice de colibactines ont récemment été associés à la fois à la hausse du CRC⁹ précoce et à l’adoption d’un régime « de style occidental^{» 12}, des facteurs qui continueront de façonner les tendances du CRC pour les décennies à venir. La plupart des modèles de colonisation de pks+ E. coli sont présentés dans le contexte du cancer associé à la colite, qui ne permettent pas .......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
0,9 % de solution saline stérile	Baxter	JF7634
Régime personnalisé à 10 % d’inuline	Teklad	TD.240286	Résultats représentatifs
50 ppm FeS04 (sans fibres) régime personnalisé	Teklad	TD.120515	Résultats représentatifs
Femelle B6 de 8 à 12 semaines	Laboratoires Charles River	C57BL/6	Résultats représentatifs   ;
Ampicilline sel sodique   ;	Wisent Inc	400-110 XG
Centrifugeuse de laboratoire	Fisher scientifique	75004381
Densimètre cellulaire	Biochrom	80-2116-30
Tube de culture, 13 mL	Sarstedt	62.515.006
ECNC101	N/A	N/A	Offert par le Dr Christian Jobin, Université de Caroline du Nord à Chapel Hill & nbsp ;
Aiguille Gavage, 38mm x 22 G	Appareil de Harvard Canada	34-024	Plus disponible - Une alternative potentielle est disponible chez Instech Labs (FTP-22-38) et nbsp ;
Secoueur orbital incubateur	VWR	980153
Boucle inoculante	Fisher scientifique	22-363-595
Écarteur en forme de L	Fisher scientifique	14-665-230
Bouillon de lysogenèse   ;	Wisent Inc	800-060 LG	Ajoutez 35 g de poudre LB et 1 L d’eau. Autoclave avant utilisation.
Agar  du bouillon de lysogenèse ;	Wisent Inc	800-011 LG	Ajoutez 35 g de poudre LB et 1 L d’eau. Autoclave avant utilisation.
Agar MacConkey	Becton Dickinson	211387	Ajoutez 50 g de poudre de MacConkey à 1L d’eau. Autoclave avant utilisation.  ;
Kit d’extraction d’ADN microbien	Qiagen	47016
Incubateur microbiologique	Fisher scientifique	150152633
Tube à microcentrifuge, 1,5 mL  ;	UltiDent Scientific	73-M150-C
Rotor PCR - tubes à bande de gènes   ;	UltiDent Scientific	73-V100-RG
Boîte de Petri	Sarstedt	82.1472.001
PCR en temps réel SYBR Green Master Mix	ThermoFisher & nbsp ;	A25742
Cycleur thermique PCR en temps réel	Recherche Corbett	RG-3000A
Tube à bouchon à vis, 15 mL	Sarstedt	62.554.502
Colistimethate et nbsp ;	Fresenius Kabi	C309306
Sel de sulfate de streptomycine	Millipore Sigma	S9137
Tube gliserin à tuberculine, 1 mL	Becton Dickinson	309659
Vortex	Fisher scientifique	12-812