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Article de méthode

Colonisation avec Escherichia coli murine pks+ dans des conditions non inflammatoires

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DOI :

10.3791/70204

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10 mars 2026

 , 
1Nutrition and Microbiome Laboratory, Institut du Cancer de Montréal, Centre de recherche du Centre hospitalier de l’Université de Montréal (CRCHUM), 2Department of Medicine, Faculty of Medicine, Université de Montréal

Dans cet article

Résumé

Ce protocole décrit les étapes nécessaires à la colonisation de souris avec pks+ Escherichia coli dans des conditions non inflammatoires, ainsi que des méthodes non invasives pour la validation de la colonisation et l’évaluation de l’expansion de pks+ E. coli dans les selles.

Résumé

pks+ Escherichia coli est de plus en plus impliquée dans le développement du cancer colorectal (CRC), en particulier chez un sous-ensemble en rapide expansion de jeunes patients atteints de CRC à début précoce. Les souches pks+ d’E. coli produisent la génotoxine colibactine, connue pour provoquer des ruptures d’ADN double brin et des mutations dans les voies de prolifération et de différenciation cellulaires associées au CRC. Cet article détaille une méthode de colonisation de pks+ E. coli chez la souris dans des conditions non inflammatoires, de la préparation de l’inoculum bactérien jusqu’à la validation de la colonisation. Après une incubation nocturne, la souche d’E. coli NC101 de pks+ E. coli est administrée à des souris sous conditionnement antibiotique par gavage oral. La colonisation dans les selles est évaluée en quantifiant le nombre d’unités formatrices de colonies à gram-négatif (UFC) fermentant le lactose et par amplification quantitative par PCR. Grâce à ce protocole, il a été démontré qu’après la colonisation réussie de souris C57BL/6 avec E. coli NC101, la supplémentation en fibres alimentaires inuline favorisait la croissance de pks+ E. coli, ce qui se reflète par une récupération accrue des UFC, une plus grande abondance de la famille des Enterobacteriaceae et des niveaux accrus de la CleroP Gene. En résumé, ce modèle permet d’étudier des traitements préventifs et thérapeutiques ciblant un pathobiote clé impliqué dans le développement du CRC.

Introduction

Le microbiote intestinal est connu pour jouer un rôle important dans la santé et les maladies de l’hôte, avec la dysbiose microbienne intestinale, ou une prolifération excessive de certaines bactéries potentiellement pathogènes (pathobytes), identifiée comme une caractéristique de plusieurs pathologies, notamment les maladies cardiovasculaires, les maladies inflammatoires de l’intestin (MII) etle cancer 1. pks+ Escherichia coli est un pathobiote enrichi dans les échantillons de tissu colic de patients atteints deMII 2 et de cancer colorectal (CRC)3 comparé à des individus en bonne santé. L’activité pro-tumorigène de pks+ E. coli est liée à l’expression du groupe génique polyketide synthase (pks) et à la production de la génotoxine colibactine4. La colibactine transloce vers le noyau des cellules épithéliales du côlon, entraînant la formation de ruptures d’ADN doublebrin 5 et des mutations dans les voies clés associées auCRC 6. La colonisation de pks+ E. coli a démontré sa contribution à l’initiationtumorale 7 et à la progressiontumorale 3 dans des modèles précliniques de CRC associée à colite (CAC). Récemment, la mutagenèse induite par la colibactine a été associée à un CRC à débutprécoce 8,9. L’incidence de la CRC à début précoce, chez les moins de 50 ans, a augmenté ces dernières décennies, avec le potentiel d’inverser la baisse globale actuelle des taux deCRC 9.

Le rôle de pks+ E. coli dans le développement du CRC, ainsi que dans d’autres aspects de la santé de l’hôte médiés par le microbiote, continue d’être élucidé. De plus, plusieurs facteurs ont été démontrés comme influençant l’expression du gène pks, notamment l’inflammation10, les concentrations de ferluminal 11 et les facteursalimentaires 12,13, ouvrant la porte à des interventions ciblant le microbiote. Une méthode est décrite ici pour la colonisation intestinale de pks+ E. coli via gavage oral chez des souris utilisant une souche murine de pks+ E. coli NC101 (E. coli NC101). D’autres modèles ont évalué les effets de l’E. coli NC101 sur l’inflammation et la cancérogenèse chez des souris sans germes (GF) monocolonisées par gavage oral et prélèvementrectal 3, dans des modèles génétiquement sensibles (IL-10-/-) decolite 3,14, et dans des modèles chimiquement induits d’inflammation du côlon et de perturbation de la barrièreintestinale 15. Cependant, une colonisation rentable avec pks+ E. coli peut également être obtenue dans des conditions non inflammatoires chez des souris sans pathogènes spécifiques (SPF) prétraitées avec des antibiotiques afin de créer une niche pour la colonisation et l’expansion 14,16,17. Diverses méthodes pour la détection et la quantification de pks+ E. coli dans les excréments de souris sont également présentées, notamment l’amplification quantitative par PCR (qPCR) du gène clbP, l’évaluation qPCR de l’abondance de la famille des Enterobacteriaceae, et la récupération des unités formant colonies (UFC) sur un milieu d’agar MacConkey spécifique aux bactéries fermentant le lactose à gram négatif. Ces méthodes peuvent être utilisées de manière interchangeable ou conjointement pour confirmer la présence de pks+ E. coli et la production de colibactine à des fins de validation ou pour évaluer les différences dans l’expansion de pks+ E. coli en réponse à des interventions ciblant le microbiote.

Ici, ce protocole est utilisé pour évaluer l’effet de l’inuline par fibres alimentaires sur la colonisation et l’expansion de pks+ E. coli par qPCR et la récupération des UFC. L’inuline est un prébiotique qui a démontré qu’il favorise la croissance des espèces bénéfiques de Bifidobacterium et Lactobacillus dans l’intestin, ainsi qu’augmente la production d’acides gras à chaîne courte, qui jouent un rôle important dans l’homéostasieintestinale 18. Cependant, il a également été démontré que l’inuline favorise la croissance de la production de pks+ E. coli et de colibactine, conduisant à une augmentation de la tumorigenèse dans un modèle de polyposis adénomatouse coli (Apc)Min/+ CRC traité par DSS. Cette expérience évalue l’expansion de pks+ E. coli en réponse à l’inuline alimentaire dans un modèle murin sans inflammation ni barrière intestinale altérée.

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Protocole

Toutes les procédures ont été réalisées conformément aux directives du Conseil canadien de soins aux animaux après approbation par le Comité de recherche du Centre hospitalier hospitalier de l’Université de Montréal (CRCHUM). Des souris de sept semaines ont été prélevées à partir d’une source commerciale et acclimatées pendant une semaine avant le début de l’expérience. Une représentation schématique de cette méthode est présentée à la Figure 1. Les détails des animaux, réactifs et équipements utilisés dans cette étude sont listés dans le tableau des matériaux.

figure-protocol-1
Figure 1 : Schéma de la préparation et de la colonisation de pks+ E.coli. Jour (D)-4 : Quatre jours avant le Gavage, commencez les antibiotiques chez les souris. D-1 : 24 heures avant le va-et-à-tête, retirez les antibiotiques. Préparez la culture pks+ E. coli pour une incubation nocturne. D0 : Préparez l’inocule bactérien pks+ E. coli. Administrez le pks+ E. coli ou un système de contrôle (sérum physiologique) aux souris par gavage oral dès que possible après la préparation de l’inoculum. D7+ Collecter des excréments de souris pour la détection et la quantification de la colonisation de pks+ E. coli. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

1. Traitement antibiotique

  1. Diluez l’ampicilline, la colistine et la streptomycine dans de l’eau potable stérile jusqu’à une concentration finale de 1 mg/mL pour l’ampicilline, 1 mg/mL pour la colistine et 5 mg/mL pour la streptomycine.
  2. Autorisez l’accès à des antibiotiques à volonté dans l’eau potable pendant 3 jours.
  3. Retirez les antibiotiques et rétablissez l’accès à l’eau stérile pendant une période de lavage de 24 heures avant le masque avec l’inocule NC101 d’E. coli.
    REMARQUE : La solution antibiotique doit être préparée fraîche pour chaque expérience. Une consommation adéquate de la solution antibiotique doit être surveillée. Si nécessaire, un édulcorant peut être ajouté à l’eau.

2. Préparation de l’inoculum NC101 d’E. coli (jusqu’à n = 12 souris)

REMARQUE : Les étapes 2.1-2.8 doivent être réalisées selon la technique aseptique.

  1. Préparez et autoclavez le bouillon de lysogenèse (LB).
  2. Tracez E. coli NC101 à partir du stock de glycérol sur une plaque d’agar LB en utilisant une boucle inoculante stérile. Incubez toute la nuit à 37 °C.
  3. Inoculez 5 mL de bouillon LB stérile dans un tube de culture avec une seule colonie de la plaque d’agar LB à l’aide d’une boucle inoculante. Incubez toute la nuit à 37 °C dans un shaker d’incubation sur le banc à 150 tr/min.
  4. Centrifugez le tube de culture à 1500 x g pendant 5 minutes à température ambiante.
  5. Retirez et jetez le surnageant, évitant la granule bactérienne, qui apparaîtra sous forme de dépôt blanc cassé à la base du tube.
  6. Résuspendez la granule bactérienne dans 5 mL de solution saline stérile à 0,9 %.
  7. Laver en répétant les étapes 4 à 6.
  8. Mesurez la densité optique à 600 nm (OD600) à l’aide d’un densimètre cellulaire et ajustez le OD600 à 0,625 (~1 x 10,8 CFU/souris) à l’aide d’une solution saline stérile.
    REMARQUE : Pour éviter toute contamination bactérienne du bouillon à l’étape 3, incubez un tube séparé de 2 à 3 mL de bouillon LB stérile pendant la nuit. Le bouillon doit rester clair après incubation nocturne, indiquant qu’il n’y a pas de contamination bactérienne. Si le niveau de départde 600 est inférieur à 0,625, répétez les étapes 4 à 6, en utilisant un volume plus faible pour resuspendre la boule. Pour garantir un dosage précis d’E. coli NC101, les dilutions en série du liquide de la govage doivent être placées et cultivées toute la nuit. Le nombre d’UFC pour chaque dilution peut être utilisé pour estimer la quantité initiale d’UFC dans la suspension bactérienne.

3. Gâteau oral d’E. coli NC101

  1. Agitez doucement l’inoculum bactérien pour assurer une répartition égale des bactéries.
  2. Placez l’aiguille de la Fourchette sur une seringue de 1 mL et remplissez 0,2 mL d’inocule bactérien, en éliminant toute bulle d’air.
  3. Retirez la souris de la cage et saisissez-la doucement mais fermement en saisissant la peau juste derrière les oreilles jusqu’aux omoplats, en utilisant le coussinet du pouce et le côté de l’index. Fixez la queue avec le majeur ou l’annulaire de la même main.
  4. Tenez la souris en position verticale et insérez l’aiguille de la fourrière sur le côté de la bouche. Faites glisser l’extrémité de l’aiguille de la gardien le long du palais jusqu’à l’œsophage et l’estomac, en repoussant doucement la tête de la souris pour étendre le cou. Si une quelconque résistance est ressentie, retirez l’aiguille de gaffe. Re-grattez la souris si nécessaire avant de réessayer.
  5. Injectez lentement l’inoculum bactérien (0,2 mL) et retirez l’aiguille, en suivant le même angle que l’insertion.
  6. Ramenez la souris dans la cage et poursuivez avec les souris restantes.
    REMARQUE : L’inoculum bactérien doit être administré dès que possible après la préparation. Les souris témoins doivent recevoir 0,2 mL de solution saline stérile à 0,9 % (véhicule). La longueur, la jauge et le diamètre de la boule appropriés de l’aiguille de gavage doivent être déterminés en fonction du poids corporel moyen des souris dans chaque expérience. Vérifiez la respiration et l’activité de la souris après 5 minutes et avant de quitter l’étape. Si une respiration laborieuse/détresse respiratoire est observée, euthanasiez la souris selon un protocole approuvé. Le gavage oral ne doit être effectué que par du personnel de recherche formé. Une mauvaise exécution du gavage oral peut entraîner de graves complications ou la mort due à une perforation œsophagienne ou à l’injection du liquide du gavage dans les poumons. Lorsqu’elle est réalisée par un personnel de recherche expérimenté, aucune mortalité n’est attendue avec cette procédure. Les souris utilisées pour cette expérience doivent être hébergées sous conditions de SPF. Pour éviter la contamination entre cages, des cages ventilées individuellement doivent être utilisées, et les souris doivent être manipulées dans une armoire de sécurité biologique. Avant d’ouvrir chaque cage, les mains et l’extérieur du couvercle doivent être essuyés avec un désinfectant approprié (par exemple, du peroxyde d’hydrogène accéléré). Les exigences en matière d’EPI pour manipuler les souris utilisées dans ce protocole incluent une blouse (jetable ou réutilisable) et des gants. Des équipements de protection supplémentaires peuvent être nécessaires pour l’établissement pour animaux hôtes. Toutes les manipulations impliquant des souris témoins doivent être effectuées en premier.

4. Collecte d’échantillons fécaux

  1. Prélever un comprimé fécal de chaque souris dans un tube microcentrifuge de 1,5 mL en écrasant la souris comme décrit à l’étape 3.3. La souris doit déféquer immédiatement. Sinon, placez la souris dans une cage propre et vide et attendez jusqu’à 30 minutes avant la défection.
  2. Congelez l’échantillon en plaçant le tube dans de l’azote liquide. Conservez l’échantillon à -80 °C jusqu’à une analyse complémentaire.
    REMARQUE : La détection de ClbA ou la quantification de ClbP dans les selles par PCR en temps réel doit être réalisée avant le début de l’expérience afin de vérifier que les souris ne sont pas colonisées par E. coli pks+. Pour maintenir la colonisation au-delà d’une semaine, une apparition bactérienne récurrente sans préadministration d’antibiotiques (étapes 2.1-3.6) peut être nécessaire, selon les conditions expérimentales. La quantification d’E. coli NC101 dans les selles par récupération de l’UFC ou par PCR en temps réel doit être réalisée au moins chaque semaine pendant toute la durée de l’expérience lors de la première mise en œuvre de ce protocole afin d’optimiser la fréquence de dosage.

5. Extraction d’ADN de bactéries fécales

  1. Extraire l’ADN bactérien à partir d’échantillons de selles collectés à l’aide d’un kit d’extraction d’ADN en suivant les instructions du fabricant.
  2. Mesurez la concentration d’ADN à l’aide d’un spectrophotomètre et ajustez la concentration d’ADN à 5 ng/μL.

6. Confirmation de la colonisation par détection des gènes 16S de ClbA et d’E. coli

  1. Effectuer une amplification simultanée des gènes de l’ARN ribosomique (ARNr 16S) de ClbA et d’E. coli (Tableau Supplémentaire 1) par PCR à l’aide d’un mélange maître approprié et d’un instrument pour la PCR conformément aux instructions du fabricant.
  2. Visualisez les gènes ClbA et E. coli 16S dans des souris colonisées par E. coli NC101 par électrophorèse en gel d’agarose, comme décritprécédemment 19. Les souris non colonisées ne devraient pas avoir la bande ClbA .

7. Quantification d’E. coli NC101 par récupération de l’UFC

REMARQUE : Effectuez les étapes 7.1 à 7.7 en utilisant la technique aseptique.

  1. Pèse un tube de microcentrifuge vide de 1,5 mL.
  2. Ajoutez environ 20 mg de selles au tube microcentrifuge de 1,5 mL, et notez le poids du tube avec l’échantillon ajouté.
  3. Ajoutez 200 μL de solution saline stérile à 0,9 % dans chaque tube.
  4. Attendez 10 à 15 minutes que les selles ramollissent à température ambiante et faites passer chaque tube en vortex pendant 5 minutes à vitesse maximale pour obtenir une suspension homogène. De petites particules de matière alimentaire non digérée seront visibles.
  5. Transférez 100 μL de chaque suspension dans une plaque d’agar MacConkey et répartissez uniformément l’homogénéité à l’aide d’un écarteur en forme de L.
  6. Incubez les plaques toute la nuit à 37 °C.
  7. Comptez le nombre de colonies roses et normalisez selon le poids de chaque granule fécal et le volume placé.
    REMARQUE : L’agar MacConkey sélectionne les bactéries à gram négatif. De plus, les bactéries capables de fermenter le lactose (comme E. coli) forment des colonies roses, tandis que celles qui ne peuvent pas former des colonies incolores ou jaunes. Seules les colonies roses doivent être comptées aux fins de ce protocole. Si le nombre de colonies est trop élevé pour être comptabilisé, des dilutions sérielles de l’homogénéate initiale peuvent être réalisées à l’aide de solution saline stérile à 0,9 %. Prenez en compte le facteur de dilution lors du calcul du nombre de colonies par échantillon.
    Poids de la pastille = poids du tube de microcentrifuge avec l’échantillon de pellets - poids du tube de microcentrifugeuse vide.

8. Quantification du gène clbP

  1. Effectuer l’amplification des gènes clbP et universels 16S rRNA (Tableau supplémentaire 1) par PCR quantitative en utilisant un mélange maître approprié et un instrument pour la PCR en temps réel selon les instructions du fabricant.

9. Quantification des entérobactéries

  1. Effectuer l’amplification des gènes Enterobacteriaceae et de l’ARN universel 16S (en supplément) par PCR quantitative à l’aide d’un master mix approprié et d’un instrument pour la PCR en temps réel.

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Résultats

L’amplification et la visualisation des gènes clbA et E. coli 16S dans les selles à la fin par PCR et électrophorèse sur gel ont montré que, bien que les deux gènes soient visibles chez les souris colonisées par E. coli NC101, seul le gène E. coli 16S était visible chez les souris témoins, confirmant que E. coli NC101 n’était pas présente (Figure 2B).

Comme prévu, 15

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Discussion

Les effets pro-cancérogènes de la pks+ E. coli productrice de colibactines ont récemment été associés à la fois à la hausse du CRC9 précoce et à l’adoption d’un régime « de style occidental» 12, des facteurs qui continueront de façonner les tendances du CRC pour les décennies à venir. La plupart des modèles de colonisation de pks+ E. coli sont présentés dans le contexte du cancer associé à la colite, qui ne permettent pas ...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.

Remerciements

Ce travail a été financé par une subvention des Instituts canadiens de recherche en santé [IRSC, subvention CSV-198232]. Nous remercions l’établissement vétérinaire du CRCHUM. Les figurines étaient créées à partir de BioRender.com.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
0,9 % de solution saline stérileBaxterJF7634
Régime personnalisé à 10 % d’inulineTekladTD.240286Résultats représentatifs
50 ppm FeS04 (sans fibres) régime personnaliséTekladTD.120515Résultats représentatifs
Femelle B6 de 8 à 12 semainesLaboratoires Charles RiverC57BL/6Résultats représentatifs   ;
Ampicilline sel sodique   ;Wisent Inc400-110 XG
Centrifugeuse de laboratoireFisher scientifique75004381
Densimètre cellulaireBiochrom80-2116-30
Tube de culture, 13 mLSarstedt62.515.006
ECNC101N/AN/AOffert par le Dr Christian Jobin, Université de Caroline du Nord à Chapel Hill & nbsp ;
Aiguille Gavage, 38mm x 22 GAppareil de Harvard Canada34-024Plus disponible - Une alternative potentielle est disponible chez Instech Labs (FTP-22-38) et nbsp ;
Secoueur orbital incubateurVWR980153
Boucle inoculanteFisher scientifique22-363-595
Écarteur en forme de LFisher scientifique14-665-230
Bouillon de lysogenèse   ;Wisent Inc800-060 LGAjoutez 35 g de poudre LB et 1 L d’eau. Autoclave avant utilisation.
Agar  du bouillon de lysogenèse ;Wisent Inc800-011 LGAjoutez 35 g de poudre LB et 1 L d’eau. Autoclave avant utilisation.
Agar MacConkeyBecton Dickinson211387Ajoutez 50 g de poudre de MacConkey à 1L d’eau. Autoclave avant utilisation.  ;
Kit d’extraction d’ADN microbienQiagen47016
Incubateur microbiologiqueFisher scientifique150152633
Tube à microcentrifuge, 1,5 mL  ;UltiDent Scientific73-M150-C
Rotor PCR - tubes à bande de gènes   ;UltiDent Scientific73-V100-RG
Boîte de PetriSarstedt82.1472.001
PCR en temps réel SYBR Green Master MixThermoFisher & nbsp ;A25742
Cycleur thermique PCR en temps réelRecherche CorbettRG-3000A
Tube à bouchon à vis, 15 mLSarstedt62.554.502
Colistimethate et nbsp ;Fresenius KabiC309306
Sel de sulfate de streptomycineMillipore SigmaS9137
Tube gliserin à tuberculine, 1 mLBecton Dickinson309659
VortexFisher scientifique12-812

Références

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