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Article de recherche
Cette étude a utilisé le séquençage du 16S rRNA pour comparer le microbiote intestinal chez des témoins sains, des patients atteints de MP non traités et des patients atteints de MP traités par piribedil, et a identifié des différences dans la composition microbienne associées au traitement par piribedil.
Cette étude visait à déterminer si la thérapie au piribedil modifie le microbiote intestinal des patients atteints de la maladie de Parkinson (MP), fournissant une référence théorique pour comprendre les altérations du microbiote intestinal induites par le piribedil et leurs implications cliniques potentielles. Les échantillons fécaux ont été analysés à l’aide du séquençage du gène de l’ARN ribosomique 16S (ARNr 16S). Des comparaisons ont été faites entre les patients atteints de MP ayant pris le piribedil (groupe piribétil), les patients atteints de MP qui n’en ont pas pris (groupe avec la MP) et les témoins sains (groupe blanc). Comparé au groupe blanc, l’abondance relative de Staphylococcus, Rhodococcus et d’autres genres était plus élevée dans le groupe, tandis que l’abondance relative d’Achromobacter et Delftia était plus faible. De plus, l’abondance relative d’Achromobacter, Delftia et Stenotrophomonas était plus élevée dans le groupe piribedil que dans le groupe, tandis que l’abondance relative de Staphylococcus, Rhodococcus et d’autres espèces était plus faible. Comparé aux individus en bonne santé, le microbiote intestinal des patients atteints de MP a montré des changements significatifs. Le microbiote intestinal des patients prenant du piribedil diffère significativement de celui des patients non traités. Ces résultats suggèrent une association entre le piribédil et une altération du microbiote intestinal chez les patients atteints de MP.
L’incidence de la maladie de Parkinson (MP) augmente progressivement ; cependant, son étiologie et sa pathogenèse n’ont pas encore été pleinement clarifiées. D’autres études ont indiqué que le microbiote intestinal est étroitement lié à l’apparition et au développement de la MP. He et al.1ont documenté que la composition du microbiote intestinal chez les patients atteints de MP diffère de celle des personnes en bonne santé, et qu’une augmentation des agents pathogènes intestinaux pourrait être associée à l’apparition de la MP. Scheperans et al.2ont confirmé que l’abondance relative de Prevotella et Bacteroides dans l’intestin des patients atteints de MP est réduite, et que ces genres bactériens sont fortement associés à la fonction de la barrière intestinale.
Plusieurs études ont étudié le lien entre le microbiote intestinal et la MP. Des recherches suggèrent que la dysbiose pourrait jouer un rôle crucial dans la physiopathologie de la MP, influençant les symptômes moteurs et non moteurs par de multiples mécanismes, notamment l’inflammation et les troublesmétaboliques 3. De plus, des traitements médicamenteux contre la MP ont montré qu’ils modifient la composition du microbiomeintestinal 4,5, soulignant l’interaction complexe entre les médicaments et le microbiome intestin.
En tant qu’agoniste non sélectif des récepteurs dopaminergiques, le piribedil joue un rôle clé dans la gestion de la MP ; Elle peut améliorer les symptômes moteurs chez les patients en stimulant les récepteurs de la dopamine6. Cependant, son usage clinique est souvent limité par des réactions indésirables, principalement des symptômes gastro-intestinaux tels que nausées, vomissements et douleursabdominales 7. Le mécanisme sous-jacent de ces effets secondaires reste incertain, et on ignore s’ils sont liés à des modifications du microbiote intestinal induites par le piribétil.
Le lien entre le microbiote intestinal et les réactions indésirables aux médicaments suscite un intérêt croissant ces dernières années. Hill-Burns et al.8ont analysé le microbiote intestinal chez les patients atteints de MP et ont constaté que la diversité microbiote intestinale était associée à la réponse à la thérapie médicamenteuse. De plus, les agonistes de la dopamine peuvent influencer la motilité intestinale et la compositionmicrobienne 9. Les mécanismes derrière ces changements seraient impliqués des altérations du moment du transport intestinal, ce qui affecte à son tour la diversité et l’abondance microbiennes. De plus, le microbiote intestinal peut influencer l’absorption et le métabolisme desmédicaments, affectant ainsi l’efficacité et les effets secondaires de ces médicaments. Cependant, il manque encore de recherches systématiques sur la manière dont le piribedil, un agent couramment utilisé pour la maladie de Parkinson, module la structure du microbiote intestinal, ainsi que sur l’association entre ces déplacements microbiens et leurs réactions indésirables gastro-intestinales.
Dans la présente étude, nous avons comparé la structure du microbiote intestinal chez des témoins sains, des patients atteints de MP non traités et des patients atteints de MP traités avec le piribétil. Nous avons émis l’hypothèse que le traitement par piribédil est associé à des altérations distinctes de la composition du microbiote intestinal chez les patients atteints de MP et que ces changements microbiens pourraient être liés à des effets gastro-intestinaux associés au piribétil. Nous avons visé à identifier des altérations microbiennes spécifiques associées au piribédal et à explorer leur association potentielle avec des effets secondaires gastro-intestinaux, fournissant ainsi une base théorique pour comprendre le mécanisme des réactions indésirables liées au piribétil.
Le microbiote intestinal est une orientation importante pour la recherche sur la pathogenèse de la11. En observant les effets du piribédil sur le microbiote intestinal chez les patients atteints de MP, cette étude contribue à clarifier l’importance clinique des modifications du microbiote intestinal liés aux médicaments et fournit une référence pour optimiser l’utilisation clinique et la gestion de la sécurité du piribétil.
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Cette étude a été examinée par le Comité d’éthique du premier hôpital affilié de l’Université de médecine chinoise de l’Anhui (Numéro de revue éthique : 2025AH-101, Date d’approbation éthique : 2025-07-02).
Sujets de recherche
Des patients atteints de MP et des témoins sains du Premier Hôpital affilié de l’Université de Médecine Chinoise de l’Anhui ont été inscrits. Des échantillons fécaux frais ont été prélevés pour une analyse de suivi. Des échantillons fecaux frais étaient prélevés, aliquotés dans des tubes EP stériles, immédiatement congelés dans de l’azote liquide, puis stockés à −80 °C pour une conservation à long terme. Les critères d’inclusion des patients atteints de MP étaient les suivants : (1) diagnostic clinique de MP ; (2) âge >70 ans ; (3) pour le groupe Piribedil : initié la monothérapie au piribedil après l’inscription et n’ayant pas eu d’exposition préalable à ce médicament ; pour le groupe de la MP : ne pas suivre de traitement avec des médicaments anti-Parkinson ; (4) aucune autre maladie systémique grave, telle que les maladies cardiaques graves, les maladies du foie, les maladies rénales ou le cancer. Avant l’inscription, un consentement éclairé écrit était obtenu de chaque participant. Les critères d’exclusion étaient les suivants : (1) complications graves de la MP, telles que des dysfonctions motrices sévères ; (2) avoir reçu un traitement antibiotique récemment ; (3) la présence d’autres affections pouvant influencer les résultats de l’étude, telles que la maladie inflammatoire de l’intestin, le syndrome du côlon irritable, etc. ; (4) allergique au piribétile. Les sujets témoins sains (groupe Blank) étaient des individus appariés d’âge (âge >70 ans) sans antécédents de maladies neurologiques ou gastro-intestinales majeures.
Tous les participants devaient maintenir leurs habitudes alimentaires habituelles avant l’inscription. Aucun n’avait reçu de probiotiques, prébiotiques, compléments alimentaires de fibres ou autres compléments nutritionnels. De plus, tous les participants n’avaient reçu aucun traitement antibiotique pendant au moins trois mois avant la collecte de l’échantillon. Aucune intervention alimentaire standardisée n’a été réalisée durant l’étude, mais tous les participants ont été invités à maintenir un mode de vie et une alimentation stables afin de minimiser les effets potentiels de confusion sur le microbiote intestinal.
Regroupement de recherche
Cette cohorte d’étude a été divisée en trois groupes : groupe MP (n = 10) : échantillons fécaux prélevés sur des patients atteints de la maladie de Parkinson qui ne prenaient pas de médicaments anti-Parkinson. Groupe piribedil (n=10) : échantillons fécaux prélevés sur des patients atteints de la maladie de Parkinson après 21 jours consécutifs de traitement avec piribedil (50 mg, deux fois par jour). Groupe témoin blanc (n=5) : échantillons fécaux prélevés sur des individus sains.
Séquençage de l’ARN ribosomique 16S
Le séquençage a été réalisé sur une plateforme de séquençage, comme rapporté dans d’autres études12,13. En résumé, l’ADN microbien total a été isolé à partir d’échantillons fécaux en utilisant la méthode du sodium dodecylsulfate (SDS) 14,15,16. L’intégrité de l’ADN extrait a été vérifiée par électrophorèse en gel d’agarose à 1 %, et la concentration et la pureté de l’ADN ont été déterminées à l’aide d’un spectrophotomètre. La région hypervariable V3-V4 du gène bactérien 16S rRNA a été amplifiée à partir de l’ADN génomique à l’aide des amorces dégénérées 341F (5'-CCTAYGGGRBGCASCAG-3') et 806R (5'-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3') avec un thermocycleur de réaction en chaîne par polymérase (PCR). L’amplification du gène bactérien 16S rRNA a été réalisée dans les conditions thermiques suivantes : une étape initiale de pré-dénaturation à 94 °C pendant 2 minutes, suivie de 28 cycles comprenant une dénaturation à 94 °C pendant 30 s, un recuit à 55 °C pendant 30 s, et une élongation à 72 °C pendant 30 s. Une prolongation finale a été effectuée à 72 °C pendant 10 minutes, puis la réaction a été maintenue à 4 °C. Les mélanges PCR contiennent 2 × mélange maître PCR de 25 μL, amorce directe (10 μM) 2 μL, amorce inverse (10 μM) 2 μL, ADN modèle 10 ng, et enfin ddH2O jusqu’à 50 μL. Les réactions PCR ont été réalisées en triple exemplaire. Les mélanges PCR contiennent 2× mélange maître PCR de 25 μL, amorce directe (10 μM), 2 μL, amorce inverse (10 μM) 2 μL, ADN modèle 10 ng, et enfin ddH2O jusqu’à 50 μL. Les réactions PCR ont été réalisées en triple exemplaire. Le produit PCR a été extrait d’un gel d’agarose à 2 % et purifié à l’aide d’un kit d’extraction au gel. Le kit de préparation de la bibliothèque Universal Plus DNA pour MGI V2 a été utilisé pour construire la bibliothèque : (1) lien Splinter ; (2) Utiliser un écran magnétique à billes pour retirer les segments joints auto-contigus ; (3) Enrichissement des gabarits de bibliothèque par amplification PCR ; (4) Billes magnétiques pour récupérer les produits PCR ; (5) Cyclisation des produits PCR. Après validation de la bibliothèque, le séquençage était effectué.
Points de contrôle qualité : Point de contrôle 1 (Collecte d’échantillons) : Les échantillons étaient congelés immédiatement après la collecte et stockés à −80°C. Tout échantillon présentant des signes visibles de dégel ou de contamination était jeté. Point de contrôle 2 (extraction ADN) : Pureté acceptable : A260/A280 = 1,8–2,0, A260/A230 ≥1,8 ; intégrité vérifiée par une seule bande à haut poids moléculaire sur un gel d’agarose à 1 %. Point de contrôle 3 (amplification PCR) : Une seule bande à ~460 pb sur gel d’agarose à 2 % indique une amplification réussie (amorces 341F/806R, région V3-V4) ; s’il est absent ou non spécifique, ajustez la température de recuit ou la concentration du gabarit. Une concentration de récupération ≥0,5 ng/μl était requise pour la préparation à la bibliothèque. Point de contrôle 4 (Préparation et séquençage de la bibliothèque) : Effectué par la fonction de séquençage en suivant leurs protocoles validés standard ; aucun point de contrôle interne supplémentaire (par exemple, la dimension du bioanalyseur) n’a été appliqué.
Sécurité et élimination des déchets : Des gants et des blouses de laboratoire étaient portés lors de la manipulation des échantillons. Les surfaces de travail ont été nettoyées avec 70 % d’éthanol. Tous les consommables contaminés (embouts, tubes, gels) ont été autoclavés (121°C, 20 min) avant leur élimination comme déchets bio-dangereux.
Bioinformatique
Les lectures de séquençage brut du gène 16S rRNA ont d’abord été démultiplexées, soumises à un filtrage qualité utilisant fastp (version 0.20.0), puis assemblées via FLASH (version 1.2.11) selon des critères de dépistage standardisés. En bref : (i) Les séquences brutes de 300 pb ont été réduites lorsque le score qualité moyen est tombé en dessous de 20 dans une fenêtre glissante de 50 pb. Les lectures avec des longueurs tronquées inférieures à 50 pb ou contenant des bases ambiguës ont été supprimées ; (ii) L’assemblage de la séquence n’a été effectué que pour les chevauchements dépassant 10 pb, avec le rapport de désadaptation maximal de la région chevauchante fixé à 0,2. Les lectures non appariées qui n’ont pas pu être assemblées ont été éliminées ; (iii) Les échantillons individuels étaient partitionnés selon des séquences de codes-barres et d’amorces pour un ajustement ultérieur de l’orientation. L’appariement des codes-barres était effectué avec un alignement exact, tandis que l’appariement de l’amorce permettait un maximum de 2 désaccords nucléotidiques. Les lectures du rRNA 16S ont été analysées à l’aide du pipeline Quantitative Insights into Microbial Ecology (QIIME) (version 1.8.0)17. Des séquences de balises ont été ajoutées aux lectures de fin appariée à l’aide de FLASH (version 1.2.11)18. Le trimming a été effectué en utilisant UPARSE (version 7.0.1090) avec une longueur minimale de 200 pb et une qualité moyenne de 25, suivi d’un regroupement à un seuil de 97 % pour générer des unités taxonomiques opérationnelles (OTUs)19. Les lectures OTU représentatives étaient classées taxonomiquement via le classificateur RDP 2.2, avec une limite de confiance ≥0,6. Les abondances de balises et de lectures ont été déterminées par comparaison à l’aide de USEARCH global20. L’identification des séquences chimériques s’est faite sur la base de données Gold utilisant UCHIME (v4.2.40)21. L’analyse des coordonnées principales (PCoA) a ensuite été réalisée sur le jeu de données clairsemé basé sur la dissimilarité de Bray–Curtis, avec un seuil de similarité de séquence fixé à 97 % pour le regroupement. Les OTU représentatives et les profils taxonomiques correspondants ont été analysés davantage à l’aide du logiciel R (version 3.1.1). L’algorithme de taille d’effet d’analyse discriminante linéaire (LEfSe), basé sur l’analyse linéaire discriminante (LDA), a été appliqué pour dépister des biomarqueurs présentant une abondance différentielle significative au niveau de l’OTU. Cette méthode met l’accent à la fois sur la signification statistique et la pertinence biologique en identifiant d’abord des caractéristiques présentant des différences constantes entre groupes (en utilisant le test de Kruskal-Wallis pour la comparaison multi-groupes), puis en estimant la taille d’effet de chaque caractéristique différentiellement abondante à l’aide de LDA. Un score LDA >2,0 est défini comme une abondance significativementaccrue de 22.
Méthodes statistiques
Des analyses statistiques ont été réalisées à l’aide de SPSS. Les données normalement distribuées ont été analysées à l’aide de l’analyse unidirectionnelle de la variance (ANOVA). Les données ne respectant pas la distribution normale ont été analysées à l’aide du test de somme des rangs de Wilcoxon. Toutes les données quantitatives étaient exprimées en moyenne ± erreur standard (SE) pour les paramètres conformes à une distribution normale, tandis que les données non distribuées normalement étaient présentées comme une médiane avec une plage interquartile. Une valeur p < 0,05 a été considérée comme statistiquement significative.
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Différences de diversité microbienne associées au traitement au piribedil
Les résultats du contrôle qualité de l’extraction d’ADN (plage de concentration, pureté) sont fournis dans le Tableau Supplémentaire 1. Le contrôle qualité de l’amplification par PCR (taille de bande, concentrations de récupération) est présenté dans le Tableau Supplémentaire 2. Les métriques de contrôle qualité du séquençage (nombre de lectures, profond...
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La maladie de Parkinson est classée comme la deuxième maladie neurodégénérative la plus courante au monde, seulement précédée par la maladied’Alzheimer 23. Depuis 1970, le piribétile, en tant qu’agoniste des récepteurs de la dopamine, est largement utilisé dans le traitement de la24. Cependant, en pratique clinique, le piribedil peut provoquer certaines réactions indésirables, telles que nausées, vomissements et inconfort gastro-intestinal....
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Les auteurs affirment qu’il n’existe pas d’intérêts concurrents.
Cette recherche a été soutenue par le projet de financement des candidats de réserve des leaders académiques de la province d’Anhui (n° 2022H287), le projet d’excellence des talents exceptionnels en hygiène et santé de la province d’Anhui (n° ahsjhmypygc20230074), le projet provincial de recherche scientifique de l’Anhui sur l’héritage et l’innovation de la médecine traditionnelle chinoise (2025CCCX017), ainsi que le projet spécial d’intégration fondamentale-clinique de l’Université de médecine chinoise de l’Anhui (JCLCA2025009).
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| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| 2× reaction buffer (Taq MasterMix) | Kangweii | CW0690 | |
| Agarose | (général) | non applicable | qualité biologie moléculaire |
| AxyPrep DNA Gel Extraction Kit | Axygen Biosciences | (non fourni) | |
| Centrifugeuse de congélation à haute vitesse de table | Hunan Kosei | GTR116C | |
| Réactifs d'extraction d'ADN (SDS, phénol, chloroforme, éthanol) | (général) | non applicable | |
| Plateforme de séquençage DNBSEQ-G99 PE300 | MGI Tech Co., Ltd | DNBSEQ-G99 | |
| Appareil d'électrophorèse sur gel | Beijing Liuyi | DYY-8C | |
| Système d'imagerie de gel | Shanghai Jiapeng | JP-2880 | |
| Logiciel LEfSe | (open source) | version en ligne | |
| Spectrophotomètre NanoDrop | Hangzhou Haipe | Aurora-900 | |
| Machine PCR | Hangzhou Langji | A200 | |
| Piribédil | Servier | 6094078 | |
| Primers: 341F et 806R (synthétisés) | (synthèse personnalisée) | non applicable | |
| Logiciel QIIME | (open source) | http://qiime.org | version 1.8.0 |
| Fluoromètre Quantus | Promega | E6150 | |
| Fluoromètre Qubit 4.0 | Invitrogen | Q33226 | |
| SDS (dodécylsulfate de sodium) | (général) | non applicable | |
| Logiciel UPARSE | (open source) | http://drive5.com/uparse | version 7.0.1090 |
| Kit de préparation de bibliothèque d'ADN VAHTS Universal Plus pour MGI V2 | Vazyme | NDM627-01 |