Développement de nanovésicules enveloppées de membrane des cellules souches mésenchymateuses pour une meilleure délivrance de gènes

Résumé

Ce protocole vise à introduire une méthode permettant de produire et de purifier des biomimétiques extracellulaires de vésicules dérivées des cellules souches mésenchymateuses (MSC) pour la thérapie génique. La nanovésicule est confinée par des bicouches lipidiques dérivées de la MSC et encapsule des VA recombinants portant le gène d’intérêt dans la lumière. Cette nanovésicule offre un vecteur amélioré pour la délivrance de gènes in vivo .

Résumé

Les vésicules extracellulaires (EV) dérivées des cellules souches mésenchymateuses (MSC) présentent un grand potentiel pour des applications thérapeutiques et la médecine régénérative. Les EV sont des vésicules à l’échelle nanométrique sécrétées par tous les types cellulaires connus, transportant diverses cargaisons incluant des protéines ancrées dans la membrane, des facteurs solubles, de multiples espèces d’ARN et des métabolites qui régulent la physiologie et le comportement des cellules recevrices. Bien que les VE dérivés ou modifiés par MSC puissent délivrer des protéines thérapeutiques et des ARN, la délivrance d’ADN médiée par les EV reste difficile en raison du manque de mécanismes efficaces pour trier les séquences d’ADN en vésicules. Des travaux antérieurs de notre groupe et d’autres ont démontré que les VE contenant un virus adéno-associé (AAV) permettent une livraison ciblée de l’arme nucléaire et une expression soutenue des gènes in vitro et in vivo. Cependant, leur production et leur isolation ont été limitées par des procédures de faible rendement et chronophages. Ici, nous rapportons le développement de nanovésicules enveloppées de membrane MSC générées par une méthode d’extrusion définie par taille pour une délivrance efficace des gènes. Ces vésicules, d’environ 200 nm de diamètre, imitent les propriétés des EV naturels tout en encapsulant des vecteurs AAV recombinants portant des séquences de gènes thérapeutiques. Comparées aux AAV conventionnelles, les vésicules MSC modifiées ont amélioré l’efficacité de la délivrance des gènes et ont obtenu des rendements nettement supérieurs avec moins de temps et de coût par rapport aux EV-AAV naturellement sécrétés. En résumé, nous présentons une nouvelle plateforme de nanovésicules membranaires basée sur MSC qui combine les avantages des structures imitant les EV avec le transfert génétique médié par AAV. Cette approche améliore l’efficacité de la délivrance et la scalabilité de la production, offrant une stratégie prometteuse pour faire avancer la thérapie génique vers la traduction clinique.

Introduction

La thérapie génique représente une approche transformatrice pour traiter les maladies génétiques et acquises en introduisant, remplaçant ou silencieux des gènes spécifiques afin de restaurer la fonction cellulaire normale. Au cours des deux dernières décennies, les avancées en ingénierie vectorielle et en stratégies de délivrance ont considérablement élargi le paysage thérapeutique de la thérapie génique. Parmi les différents systèmes vectoriels développés, le virus adéno-associé (AAV) s’est imposé comme l’une des plateformes les plus réussies et largement adoptées grâce à son profil de sécurité favorable, sa transduction efficace et son expression génique à long terme dans les cellules en division et non^{divisées 1,2}. À ce jour, plusieurs traitements basés sur l’AAV ont reçu une approbation réglementaire pour un usage clinique, y compris des traitements pour l’atrophie musculaire spinale, les dystrophies rétiniennes et l’hémophilie, marquant des étapes importantes en médecine^{translationnelle 3}. Le tropisme large et la faible immunogénicité des vecteurs AAV ont également permis leur application sur une variété de tissus, notamment le foie, le muscle, le système nerveux central et^{l’œil 4}. En conséquence, l’AAV est devenue une plateforme de premier plan pour la délivrance de gènes in vivo, soutenant des études précliniques et cliniques en cours ciblant les troubles métaboliques, neurologiques et cardiovasculaires.

Malgré son succès clinique remarquable, la thérapie génique basée sur l’AAV fait face à plusieurs défis intrinsèques qui continuent de limiter son application plus large. Une contrainte majeure réside dans la capacité limitée d’emballage du génome de la capside AAV (~4,7 kb), ce qui limite son utilisation pour délivrer de grands ou multiples gènes^{thérapeutiques 5,6}. De plus, la biodistribution et le tropisme cellulaire des vecteurs AAV sont largement déterminés par leurs sérotypes, chacun présentant des affinités distinctes pour des tissus spécifiques. Bien que des stratégies d’ingénierie des capsides et d’affichage peptidique approfondies aient été employées pour améliorer le ciblage tissulaire et l’efficacité de la transduction, atteindre un tropisme précis et prévisible dans divers contextes biologiques reste un obstacle^{majeur 7}. Une autre limitation cruciale est la prévalence des anticorps neutralisants (NAb) préexistants contre les sérotypes naturels AAV dans la population humaine. Même de faibles titres de NAbs peuvent réduire considérablement l’efficacité de la transduction vectorielle, limitant l’éligibilité des patients et compliquant la répétition des^{dosages 8,9}. Diverses stratégies, telles que la refonte rationnelle de la capside, les schémas immunosuppresseurs et l’échange plasmatique transitoire, ont été explorées pour atténuer la neutralisation médiée par anticorps^10,11, mais ces approches n’offrent qu’un soulagement partiel ou transitoire. Collectivement, ces limitations réduisent l’efficacité thérapeutique globale et la reproductibilité de la délivrance génique médiée par l’AAV en milieu clinique.

Ces dernières années, les AVA enveloppés par des vésicules extracellulaires (EV-AAV) ont été explorés comme vecteur alternatif avec le potentiel de surmonter plusieurs limitations clés des AAV^{conventionnels} 12,13,14,15. Lors de l’emballage vectoriel, une portion des particules AAV peut être sécrétée par des voies de trafic vésiculaire et être enfermée dans des vésicules extracellulaires. Ce processus impliquerait une protéine accessoire associée à la membrane codée en AAV (MAAP), qui facilite l’évacuation virale et favorise l’association^{membranaire 16,17}. Les particules EV-AAV résultantes présentent une meilleure efficacité de transduction et une résistance accrue aux anticorps neutralisants par rapport aux AAV conventionnels, principalement grâce à la membrane vésiculaire qui favorise l’absorption cellulaire et assure un blindage partiel contre la reconnaissance^{des anticorps 18}. Cependant, malgré ces avantages, la production de véhicules électriques (EV-AAV) reste inefficace. Typiquement, seule une petite fraction des génomes de vecteurs (environ 0,5 %-12 %) est sécrétée dans le milieu de culture sous forme de VA associés aux EV, tandis que la majorité reste intracellulaire ou existe sous forme de VA libres^12,13. Par conséquent, une production à grande échelle est nécessaire pour obtenir un rendement vectoriel suffisant. De plus, la génération de VE-AAV a été principalement démontrée à l’aide de cellules productrices HEK293T, dont les VE peuvent présenter une dégagement hépatique rapide, une demi-vie de circulation courte et des risques potentiels de biosécurité. Ces limitations soulignent la nécessité d’une stratégie d’enveloppement membranaire plus efficace et personnalisable, ce qui motive le développement de la plateforme AAV enveloppée par membrane cellulaire (CME-AAV) présentée dans cette étude.

Les cellules souches mésenchymates (MSC) et leurs EV ont été largement étudiées pour leur potentiel régénératif et leurs propriétés immunoévasives. Au-delà des thérapies basées sur des cellules ou des VE naturellement sécrétés, des études récentes ont démontré une approche alternative pour améliorer la délivrance de médicaments en utilisant des nanoparticules enveloppées de membranes^MSC 19,20,21. Le revêtement membranaire MSC confère une capacité de ciblage active, réduit l’immunité et prolonge le temps de circulation, effets dont les effets sont probablement attribués à la composition moléculaire intrinsèque des membranes dérivées des^{MSC 22,23}. En nous appuyant sur ce concept, nous avons utilisé un matériau membranaire dérivé des MSC pour construire une nanovésicule AAA enveloppée de membrane cellulaire (CME-AAV) pour la délivrance de gènes. Pour y parvenir, des fragments de membrane MSC purifiés ont été mélangés avec des particules AAV recombinantes et soumis à un procédé d’extrusion contrôlée, une technique initialement établie pour la fabrication de^{liposomes 24,25}. Par extrusion définie par taille, les composants de la membrane s’assemblent spontanément en vésicules à l’échelle nanométrique encapsulant des particules AAV. Les CME-AAV obtenus ont été purifiés à partir de VA libres et non encapsulées grâce à une centrifugation basée sur un gradient de densité. Cette stratégie permet une préparation efficace et reproductible des vecteurs AAV enveloppés par membrane, qui présentent une efficacité de transduction nettement améliorée par rapport aux AAV conventionnels et maintiennent une résistance comparable aux anticorps neutralisants que les EV-AAV. En substituant différents transgènes, la plateforme CME-AAV offre un large potentiel pour le traitement de diverses maladies génétiques et acquises.

Protocole

Toutes les procédures animales ont été approuvées par le comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Université normale de Pékin à Zhuhai, en Chine. Les réactifs et l’équipement utilisés sont listés dans le tableau des matériaux.

1. Préparation et formation de CME-AAV par extrusion définie par taille de pores

1. Production de vecteurs AAV recombinants
   REMARQUE : Le protocole de production AAV suit des procédures précédemment publiées et largement utilisées. Des étapes d’optimisation détaillées et des variations ont été décrites dans des études^{antérieures 12,26}.
   1. Cultivez HEK293T cellules dans un milieu de croissance complet et maintenez-les à 70 % à 80 % de confluence le jour de la transfection.
   2. Préparez trois plasmides codant (i) le vecteur de transfert AAV portant le transgène d’intérêt, (ii) les gènes rep/cap AAV correspondant au sérotype désiré, et (iii) les fonctions auxiliaires adénovirales.
   3. La co-transfection HEK293T cellules avec les trois plasmides en utilisant une méthode de transfection établie (par exemple, la transfection à base de phosphate de calcium ou polymère), suivant la pratique standard en laboratoire.
   4. Incuber les cellules transfectées pendant 48 à 72 heures pour permettre l’assemblage et l’accumulation de l’AAV.
   5. Collectez les cellules et cultivez le milieu, puis libérez les particules d’AAV par des cycles répétés de gel-dégel ou une méthode de lyse cellulaire équivalente.
   6. Centrifugez le lysat à basse vitesse pour éliminer les débris cellulaires et collecter le surnageant contenant les particules AAV.
   7. Purifier les particules AAV en utilisant l’ultracentrifugation à gradient de densité ou une autre approche de purification établie.
   8. Échangez les vecteurs AAV purifiés en solution stérile tamponnée phosphate (PBS) et stockez les aliquotes à −80 °C jusqu’à utilisation.
2. Préparation de la fraction membranaire MSC
   REMARQUE : Les cellules souches mésenchymateuses humaines (MSC) ont été isolées conformément aux directives institutionnelles. Les cellules ont été cultivées et développées selon des conditions établies ou des protocoles modifiés en laboratoire. L’identité des MSC peut être confirmée en évaluant l’expression de marqueurs phénotypiques tels que CD73, CD90 et CD105 à l’aide de la cytométrie en flux. La multipuissance des CMS est attestée par leur capacité à se différencier en ostéoblastes, chondrocytes et adipocytes in vitro. Les cellules sont prêtes à être collectées lorsqu’elles atteignent une confluence de 70 % à 90 %. Les procédures suivantes ne sont pas nécessairement obligatoires à effectuer dans des conditions stériles.
   1. Retirez le milieu de culture et détachez les MSC de la plaque de culture à l’aide d’un grattoir à cellules.
   2. Collectez les cellules détachées dans un tube conique contenant du PBS et centrifugez à 300 × g pendant 5 minutes à 4 °C pour pelleter les cellules.
   3. Lavez les cellules deux fois avec du PBS, centrifugant à chaque fois à 300 × g pendant 5 minutes à 4 °C.
   4. Resuspendez la dernière pellete cellulaire dans le PBS complétée par un cocktail inhibiteur de protéase.
   5. Soumettez la suspension cellulaire à trois cycles de congélation-dégel pour perturber la membrane plasmique et générer un lysat cellulaire rudimentaire.
   6. Pipettez le lysat soigneusement pour l’homogénéiser, puis centrifugez à 1 000 × g pendant 20 minutes à 4 °C pour éliminer les débris cellulaires.
   7. Transférer le surnageant dans un nouveau tube et centrifuger à 18 000 × g pendant 1 h à 4 °C pour pelleter la fraction membranaire.
   8. Jetez le surnageant et resuspendez la pastille membranaire résultante dans le PBS. Cette suspension représente la fraction membranaire brute du MSC et sera utilisée pour l’encapsulation des AAV.
   9. Homogénéisez la suspension membranaire en la faisant passer séquentiellement à travers des seringues équipées d’aiguilles de 20 G à 27 G.
   10. Déterminez la concentration en protéines de la suspension membranaire homogénéisée à l’aide d’un test BCA. Aliquote et stocke la suspension à −80 °C, ou passe directement aux étapes suivantes. Réhomogénéisez la suspension membranaire à l’aide d’une seringue de 27 G après chaque cycle de décongélation.
3. Formation de la CME-AAV par extrusion
   1. Mélangez la suspension membranaire préparée avec des AAV selon un ratio défini de 150 μg de protéine membranaire pour 1 × 10¹⁰ copies du génome (g.c.) d’AAV. Incubez le mélange à 37 °C pendant 30 minutes en secouant doucement.
   2. Chargez le mélange membrane-AAV sur une mini-extrudeuse équipée d’une membrane en polycarbonate (PC) de 400 nm. Faites passer l’échantillon 20 fois dans l’extrudeur pour favoriser l’encapsulation membrane-AAV.
   3. Remplacer la membrane PC de 400 nm par une membrane de 200 nm et répéter le processus d’extrusion 20 fois pour réduire encore l’hétérogénéité de la taille des vésicules.
   4. Ramassez le mélange transformé. Si une quantité plus importante est nécessaire, regroupez plusieurs lots d’extrusion. La suspension résultante contient des CME-AAV, ainsi que des AAV non encapsulés et des vésicules membranaires vides. Procédez immédiatement à la purification CME-AAV.

2. Purification de la CME-AAV par centrifugation par gradient de densité

REMARQUE : Cette étape décrit la séparation du CME-AAV pur à partir des AAV non encapsulés, des agrégats protéiques et des acides nucléiques résiduels par ultracentrifugation à gradient de densité à base d’iodixanol. Le CME-AAV purifié obtenu à cette étape convient aussi bien aux études in vitro qu’in vivo . Toutes les interventions sont recommandées sous une cagoule de culture tissulaire stérile.

1. Préparation du gradient d’iodixanol
   1. Préparez des solutions d’iodixanol à 40 % et 25 % en diluant la solution d’origine avec 10 × PBS et de l’eau déionisée stérile pour obtenir une concentration finale en 1× PBS.
   2. Dans un tube ultra-clair à paroi fine ouverte de 13,2 mL, établissez soigneusement un gradient de densité discontinue en déposant 1 mL d’iodixanol à 40 % et 3 mL d’iodixanol à 25 % par le fond.
   3. Superposez doucement 7 mL de la suspension contenant CME-AAV obtenue à partir de l’étape 1.14 sur le sommet de la pente. Équilibrez les tubes et chargez-les dans un rotor d’ultracentrifuge à seau pivotant.
2. Ultracentrifugation et collecte des fractions CME-AAV
   1. Centrifugez la pente à 150 000 × g pendant 3 heures à 4 °C en utilisant une accélération rapide et une décélération lente (niveau 9 et niveau 1, respectivement).
   2. Retirez soigneusement les tubes du rotor sans perturber la pente. Collectez des fractions de 1 mL du haut vers le bas du tube dans des tubes microcentrifuge de 1,5 mL marqués (F1-F11). Gardez toutes les fractions sur glace.
   3. Identifier et regrouper les fractions F7 et F8, qui contiennent les CME-AAV purifiés, dans un nouveau tube ultracentrifuge ouvert à toit. Ajoutez le PBS à un volume total de 11 mL et mélangez doucement avec une pipette de 1 mL.
3. Lavage et récupération de CME-AAV
   1. Centrifugez à nouveau les fractions accumulées à 150 000 × g pendant 3 heures à 4 °C en utilisant une accélération et une décélération rapides (niveau 9 pour les deux réglages).
   2. Éliminez soigneusement le surnageant et resuspendez la pellete CME-AAV dans 50-200 μL de PBS stérile, selon la concentration souhaitée.
   3. Aliquotes selon les besoins et conserver à −80 °C jusqu’à une utilisation ultérieure.

3. Caractérisation de la CME-AAV à l’aide de la microscopie électronique de transmission (TEM)

REMARQUE : La microscopie électronique en transmission (TEM) est utilisée pour visualiser la morphologie, la taille et la structure membranaire des particules CME-AAV. La procédure suit un protocole standard de coloration négative similaire à celui utilisé pour les vésicules extracellulaires. Toutes les étapes sont effectuées à température ambiante, sauf indication contraire.

1. Préparation et fixation de l’échantillon
   1. Diluez la suspension CME-AAV purifiée obtenue à partir de l’étape 2 à une concentration d’environ 1 ×^{10 9-1} × 10^{particules de 10} mL dans PBS.
   2. Fixez l’échantillon en ajoutant un volume égal de paraformodéhyde fraîchement préparé à 4 % (concentration finale 2 %) et en incubant pendant 30 minutes à température ambiante.
   3. Placez une grille en cuivre recouverte de Formvar/carbone (maille 200) sur une feuille de film de paraffine, côté carbone vers le haut.
   4. Pipettez 10 μL de la suspension CME-AAV fixe sur la grille et laissez une adsorption pendant 30 minutes à température ambiante. Évitez de sécher pendant l’adsorption.
   5. Retirez doucement l’excès de liquide du bord de la grille à l’aide de papier filtre sans toucher le centre.
2. Lavage et post-fixation
   1. Faites flotter la grille, côté échantillon vers le bas, sur une goutte de 50 μL de PBS pendant 2 minutes pour le laver. Répétez deux fois.
   2. Transférez la grille sur une goutte de 50 μL de glutaraldéhyde à 1 % pendant 5 minutes pour stabiliser la structure membranaire.
   3. Lavez la grille séquentiellement 5 fois avec des gouttes d’eau déionisée (30 s chacune) pour éliminer les sels tampons. Épongez doucement après le lavage final.
3. Coloration négative
   1. Placez la grille sur une goutte de 50 μL d’acétate d’uranyle aqueux à 2 % pendant 1 minute pour obtenir une coloration négative.
   2. Enlevez l’excès de tache en touchant doucement le bord de la grille avec du papier filtré et laissez sécher complètement à l’air à température ambiante.
4. Imagerie
   1. Examinez les grilles colorées à l’aide d’un microscope électronique à transmission fonctionnant à 200 kV.
   2. Capturez des images représentatives à des grossissements entre 30 000× et 120 000× afin d’évaluer la morphologie CME-AAV et l’intégrité des membranes.
   3. En option, mesurez les diamètres des particules à l’aide d’un logiciel d’analyse d’images TEM pour confirmer la cohérence de la taille des vésicules avec les résultats de l’NTA.
      REMARQUE : Concentration d’échantillon - Ajuster la concentration CME-AAV pour obtenir une densité de particules modérée ; Des échantillons trop concentrés entraînent un chevauchement des particules, tandis que des échantillons trop dilués produisent peu de vésicules détectables. Éviter les artefacts – Un lavage incomplet peut laisser des cristaux de sel qui obscurcissent la visualisation des particules. Veillez à ce que les grilles restent hydratées pendant la coloration afin d’éviter l’effondrement des membranes. Colorations alternatives - L’acide phosphotongstique (PTA, 1 %-2 %, pH 7,0) peut être utilisé comme alternative à l’acétate d’uranyle si des restrictions de manipulation radioactive s’appliquent. Stockage - Les grilles préparées peuvent être conservées dans un récipient sans poussière à température ambiante pendant plusieurs jours avant l’imagerie, bien qu’une observation immédiate soit recommandée pour un meilleur contraste.

4. Quantification de la CME-AAV à l’aide de la qPCR

REMARQUE : Cette étape décrit une méthode basée sur la qPCR pour quantifier les copies du génome CME-AAV (g.c./μL). Le protocole met l’accent sur la préparation d’échantillons et la déclaration des données spécifiques à CME-AAV. Tous les autres aspects de la configuration et du cycle de la qPCR doivent suivre la pratique standard en laboratoire ainsi que les instructions du fabricant pour le kit de qPCR sélectionné.

1. Préparation d’échantillon et standard
   1. Décongelez des aliquotes de CME-AAV purifié sur glace et mélangez doucement par pipette. Évitez le vortex.
   2. Préparez les dilutions standard AAV de 1 × 10⁶ à 1 × 10³ g.c./μL par dilutions séquentielles de 10 fois à l’aide d’eau déionisée sans nucléase ou d’un tampon TE. Préparez des standards frais ou aliquotes et conservez à −20 °C pour un usage à court terme.
   3. Préparez les contrôles suivants : un contrôle sans gabarit (NTC ; eau), un contrôle négatif (PBS ou matrice vierge) et un contrôle positif (échantillon AAV de concentration connue), si disponible.
   4. Préparez le mélange maître qPCR sur glace selon les instructions du fabricant pour la chimie choisie (à base de colorant ou de sonde).
2. Cycle qPCR et analyse des données
   1. Lancez la qPCR en utilisant les paramètres de cycle recommandés par le fabricant du master mix qPCR.
   2. Générez une courbe standard en traçant C_t (axe y) versus_{log 10} (concentration standard en g.c./μL) (axe x). Ajustez une régression linéaire pour obtenir la pente (m) et l’interception y (b).
   3. Calculez la concentration du génome CME-AAV pour chaque réplication d’échantillon à l’aide de l’équation de régression :
      ou
      
      où C correspond aux copies du génome par μL.
   4. Réplications techniques moyennes et rapportent la concentration finale de CME-AAV en g.c./μL.
      REMARQUE : Parce que la dénaturation thermique lors de la préparation de la qPCR perturbe à la fois la membrane enveloppante et les capsides AAV, aucune extraction d’ADN séparée n’est nécessaire. Ne pas effectuer de traitement par DNase sur des échantillons avant la lyse thermique ; La DNase peut accéder et dégrader les génomes AAV une fois que les capsides ou membranes sont perturbées, mais avant que l’échantillon n’atteigne des températures qui inactivent la DNase. Les normes doivent être adaptées lorsque cela est possible : préparer une courbe standard à partir d’une norme AAV bien caractérisée. Si vos échantillons ou standards diffèrent dans la configuration du génome (AAV simple brin vs AAV auto-complémentaire/double brin), ajustez les valeurs rapportées en conséquence. Conception amorce/sonde : les amorces peuvent cibler toute séquence AAV conservée ; par exemple, des amorces ciblant le promoteur CMV (en amont du transgène) sont couramment utilisées.

5. Quantification des profils de particules CME-AAV

1. Utilisez l’analyse de suivi de nanoparticules (NTA), la détection résistive d’impulsions accordables (TRPS) ou des techniques comparables d’analyse de particules pour déterminer la répartition de taille et la concentration des particules des préparations CME-AAV.
2. Dégelez des échantillons de CME-AAV purifiés sur la glace et les homogénéisez doucement par pipetage avant analyse. Effectuer des mesures en suivant la pratique standard en laboratoire et les instructions du fabricant pour l’instrument sélectionné, comme décrit dans les protocoles^{12, 27, 28, 29} précédemment publiés.

6. Analyse in vitro du transfert génique médié par CME-AAV

REMARQUE : Cette étape décrit la procédure d’évaluation de la délivrance génique et de l’expression transgénique médiées par CME-AAV dans les cellules cultivées. Le test est démontré à l’aide de cellules HEK293T et de CME-AAV9. EGFP, mais peut être adapté à d’autres types cellulaires ou constructions de rapporteurs. AAV9 conventionnel (non enveloppé de membrane). L’EGFP sert de contrôle positif, tandis que les PBS ou particules AAV vides sont utilisées comme témoins négatifs.

1. Préparation cellulaire
   1. Cultivez HEK293T cellules dans des conditions standard (DMEM avec 10 % de FBS, 1 % de pénicilline-streptomycine) à 37 °C avec 5 % de CO₂.
   2. Ajoutez les cellules de graines dans des plaques de 48 puits ou 96 puits pour atteindre environ 70 % de confluence au moment de la transduction (généralement 24 h après l’ensemencement). Ajustez la densité de semis selon la taille du puits (par exemple, ~5 × 10⁴ cellules/puits pour une plaque à 48 puits ou ~ 1 × 10⁴ cellules/puits pour une plaque à 96 puits).
   3. Laissez les cellules s’attacher et s’équilibrer pendant 24 heures avant d’ajouter des vecteurs.
2. Application vectorielle
   1. Préparez le CME-AAV9. EGFP et AAV9. Solutions de travail EGFP dans PBS stérile. Dose virale typique : 5 × 10⁸ g.c. par 48 puits (ajusté en fonction de la force du promoteur, du gène cible et des objectifs expérimentaux).
   2. Pour chaque puits, ajoutez des copies égales du génome (par exemple) de CME-AAV9. EGFP ou AAV9. EGFP directement au support culturel.
   3. Inclure des puits de contrôle négatifs avec un volume équivalent de PBS ou de particules AAV vides.
   4. Faites doucement tourner la plaque pour assurer une répartition uniforme et revenez à l’incubateur.
   5. Poursuivre l’incubation pendant 24 à 72 heures, selon l’activité du promoteur et la cinétique d’expression des transgènes. Pour l’EGFP alimenté par le CMV dans les cellules HEK293T, une forte fluorescence est généralement observée dans les 48 heures.
3. Imagerie et analyse de cellules vivantes
   1. Au moment de l’imagerie, aspirez doucement le milieu de culture et lavez les cellules deux fois avec du PBS pour éliminer les particules non liées. Évitez de déloger les cellules.
   2. Colorez les noyaux des cellules avec Hoechst 33342 (compatibles cellules vivantes) selon les instructions du fabricant. N’utilisez pas de DAPI pour les cellules vivantes.
   3. Réaliser l’imagerie à fluorescence à cellules vivantes à l’aide d’un microscope à fluorescence inversée équipé de filtres appropriés (par exemple, excitation 488 nm/émission 513 nm pour EGFP ; excitation 350 nm/émission 460 nm pour Hoechst).
   4. Utiliser des objectifs de 10× ou 20 × pour la quantification de l’efficacité de transduction et 63 × pour la localisation subcellulaire à haute résolution si nécessaire.
   5. Acquérir au moins cinq champs de vision par puits (par exemple, quatre coins et un centre) en utilisant des paramètres d’imagerie identiques (temps d’exposition, gain, ouverture, etc.).
   6. Enregistrez toutes les images en formats raw et en niveaux de gris pour une analyse quantitative.
4. Analyse quantitative d’images
   1. Images ouvertes dans ImageJ (FIJI) ou un logiciel équivalent.
   2. Mesurer l’intensité moyenne de fluorescence pour les canaux EGFP et Hoechst pour chaque champ.
   3. Déterminez l’intensité de fond en sélectionnant une région sans signal fluorescent et en calculant la moyenne des valeurs des pixels.
   4. Calculez l’intensité corrigée pour chaque canal :
      _{J’ai corrigé} = Je_{veux dire} -_{I contexte}
   5. Calculer l’intensité normalisée pour chaque champ comme suit :
      
   6. Normalisez les intensités moyennes d’au moins cinq champs par puits, et rapporte la moyenne ± DS sur trois réplications biologiques indépendantes.
      NOTE : LE CME-AAV présente généralement une intensité de fluorescence accrue par rapport à l’AAV conventionnel lorsque des copies égales du génome sont appliquées, reflétant une meilleure captation cellulaire et/ou une protection contre les anticorps neutralisants. L’efficacité optimale de la transduction dépend de la qualité de préparation CME-AAV, du type cellulaire, de la force du promoteur et du titre viral. Si des signaux faibles sont observés, augmentez l’entrée des copies du génome, confirmez l’intégrité du vecteur par qPCR, et vérifiez l’étalonnage du microscope. D’autres rapports fluorescents (par exemple, mCherry, mNeonGreen, tdTomato) ou des constructions luciférase peuvent être utilisées selon les besoins expérimentaux. Lors du travail avec des cellules primaires ou non adhérentes, ajustez en conséquence les conditions d’ensemencement et d’imagerie (par exemple, recouvrir les plaques de poly-L-lysine ou utiliser des lames de chambre).

7. Évaluation de la délivrance génique médiée par CME-AAV dans un modèle murin

REMARQUE : Cette étape décrit l’évaluation de la délivrance génique médiée par CME-AAV in vivo à l’aide d’un modèle murin.

1. Préparation animale
   1. Utilisez des souris sauvages comme la C57BL/6. Veiller à ce que toutes les procédures animales soient approuvées par le comité institutionnel de soins et d’utilisation animale et qu’elles soient réalisées conformément aux réglementations applicables.
   2. Sélectionnez des souris âgées de 4 à 6 semaines pour une cohérence optimale entre les expériences.
   3. Maintenir les animaux dans des conditions de logement standard avec un accès improvisé à la nourriture et à l’eau avant l’injection.
2. Préparation et administration des vecteurs
   1. Sélectionnez un sérotype AAV selon l’objet de l’étude et le tissu cible. Dans cette étude, AAV9 et CME-AAV9 sont utilisés.
   2. Préparez des vecteurs viraux codant pour un gène rapporteur luciférase (par exemple, CME-AAV9.luciférase) pour une imagerie non invasive.
   3. Diluez les vecteurs viraux dans du sérum stérile jusqu’à une concentration finale de 1 × 10¹° copies du génome (g.c.) par 50 μL pour chaque souris.
   4. Réchauffez doucement la queue à l’aide d’une bouillotte ou de l’eau tiède pour dilater la veine avant l’injection.
   5. Chargez 50 μL de suspension virale dans une seringue d’insuline 31-G et injectez lentement dans la veine latérale de la queue pour minimiser les fuites et la rupture veineuse.
   6. Après l’injection, remettez les souris dans leurs cages et surveillez-les jusqu’à ce qu’elles soient complètement rétablies.
3. Imagerie bioluminescente in vivo
   1. Deux semaines après l’administration, anesthésiez les souris avec de l’isoflurane (selon les protocoles approuvés par l’institution) et injectez de la D-luciferine (150 μg/g de poids corporel ; Sigma) intrapéritonéalement dans PBS.
   2. Placez les souris anesthésiées dans un système d’imagerie bioluminescente.
   3. Acquérir des images de luminescence toutes les 2 minutes après l’injection jusqu’à ce que le signal atteigne un plateau.
   4. Quantifier la bioluminescence avec un logiciel approprié. Définissez les régions d’intérêt (ROI) autour des zones luminescentes et calculez le flux total de photons (photons/s) pour chaque animal.
   5. Inclure les groupes traités par AAV9.luc et injectés par PBS comme témoins positifs et négatifs, respectivement, pour comparaison.
4. Imagerie ex vivo
   REMARQUE : Cette étape est optionnelle.
   1. Immédiatement après l’imagerie in vivo , euthanasiez les souris et prélèvez les organes majeurs (foie, cœur, rate, rein et cerveau).
   2. Imagez les organes isolés sous des paramètres d’imagerie identiques en utilisant le même système IVIS pour déterminer l’expression spécifique de la luciférase tissulaire.
      REMARQUE : Des voies d’administration alternatives (par exemple, injection intramusculaire, intracérébrale ou intrapéritonéale) peuvent être adoptées selon les objectifs expérimentaux. L’intensité de la bioluminescence reflète à la fois l’efficacité de délivrance des gènes et la biodistribution tissulaire. L’expression de la luciférase médiée par CME-AAV présente généralement un début plus précoce et une expression maximale accrue comparée à l’AAV libre, en raison d’une endocytose médiée par membrane par les cellules captantes. Assurez-vous que la dose, le timing et les réglages d’imagerie de luciférine soient cohérents sur les échantillons pour une comparaison précise. La dose virale décrite (1 × 10¹° g.c. par souris) fournit généralement un signal détectable 2 à 4 semaines après l’injection, mais une optimisation peut être nécessaire pour différents vecteurs ou modèles animaux.

Résultats

Les CMM utilisés dans cette étude ont été isolés à partir de tissu du cordon ombilical humain selon des protocoles conformément aux directives éthiques pertinentes. Les fractions membranaires de la MSC ont été préparées selon le protocole décrit. AAV9. L’EGFP a été produite en interne à l’aide d’un système de transfection à double plasmide transitoire dans HEK293T cellules, comme précédemment^{rapporté 12,26}. Pour la fabrication de...

Discussion

Étapes critiques du protocole CME-AAV

Ce protocole décrit une méthode pour générer des AAVs enveloppés par membrane MSC, et plusieurs étapes sont cruciales pour une formation réussie de CME-AAV. Tout d’abord, un prétraitement soigneux de la membrane cellulaire est essentiel. L’objectif de cette étape est d’obtenir des fragments membranaires adaptés à l’extrusion tout en minimisant la contamination par l’ADN nucléaire, les protéines cytosolique...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Système d'imagerie bioluminescente	PerkinElmer	Système d'imagerie optique IVIS Spectrum (Lumina III)
Sel de potassium D-Luciferine	Yeasen Biotechnology	40902ES03
Sérum bovin fœtal	Yeasen Biotechnology	40130ES76
Microscope à fluorescence	Zeiss	Axio Observer 7
Réseau de cuivre revêtus de formvar/carbone 200 mailles	Millipore-Sigma	TEM-FCF400CU
Glutaraldéhyde	Millipore-Sigma	354400
HBSS	Gibco	C14175500BT
Hieff Unicon qPCR TaqMan Probe Master Mix	Yeasen Biotechnology	11205ES08
Milieu de Dulbecco modifié de Eagle à haute teneur en glucose	Hyclone	SH30243
Centrifugeuse à haute vitesse	Beckman Coulter	Avanti J-E
Hoechst 33342	Beyotime	C1022
Instrument NTA	Malvern Panalytical	NanoSight NS300
Tube ultra-clair à paroi mince ouvert pour ultracentrifugeuse	Beckman Coulter	344059
Iodixanol OptiPrep	Millipore-Sigma	D1556
Paraformaldéhyde 4%	Beyotime	P0099
PBS	Biosharp	BL302A
Pénicilline-streptomycine	Millipore-Sigma	V900929
Instrument qPCR	Applied Biosystems	Système de PCR en temps réel QS6
Rotor pour centrifugeuse à haute vitesse	Beckman Coulter	JA-25.50
Rotor SW 41 Ti pour ultracentrifugation	Beckman Coulter	331362
Microscope électronique à transmission	JEOL	JEM-2100F
Ultracentrifugeuse	Beckman Coulter	Optima XE-100
Acétate d'uranyle	Electron Microscopy Sciences	NC1375332
Filtres membranes en polycarbonate Whatman Nuclepore (200 nm)	Cytiva	10417004
Filtres membranes en polycarbonate Whatman Nuclepore (400 nm)	Cytiva	10417104