Cette étude évalue l’utilité diagnostique et pronostique de la détection combinée de l’IFN-γ sérique et du CD64 neutrophile pour la tuberculose pulmonaire active chez les patients âgés immunodéprimés.
Un abonnement JoVE est requis pour visualiser ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre période d'essai gratuite.
Article de recherche
Cette étude évalue l’utilité diagnostique et pronostique de la détection combinée de l’IFN-γ sérique et du CD64 neutrophile pour la tuberculose pulmonaire active chez les patients âgés immunodéprimés.
Cette étude a évalué le risque de tuberculose pulmonaire active (ATB) chez les patients âgés présentant une immunité affaiblie en détectant conjointement l’interféron-γ sérique (IFN-γ) et le neutrophile CD64, et a analysé l’impact de ce protocole diagnostique sur l’évolution de l’ATB. Un total de 50 patients atteints d’ATB et 50 témoins sains appariés selon l’âge et le sexe ont été recrutés. Par la suite, le neutrophile CD64 du patient (quantifié comme le pourcentage de neutrophiles CD64 positifs [CD64 %]), IFN-γ (par test immunosorbent lié aux enzymes [ELISA]), la protéine C-réactive (CRP ; par immunoturbidimétrie) et le taux de sédimentation des érythrocytes (ESR ; par méthode Westergren). Des échantillons de crauvores de patients ont été prélevés sur un milieu Löwenstein-Jensen (L-J) et dans le système automatisé MGIT 960. L’efficacité diagnostique des biomarqueurs individuels et combinés a été évaluée grâce à l’analyse de la courbe des caractéristiques opérationnelles du récepteur (ROC), et un modèle de régression logistique a été développé pour la détection combinée. Des niveaux significativement élevés de l’IFN-γ et du CD64 ont été observés chez les patients atteints d’ATB par rapport aux témoins sains (P<0,05). Un modèle diagnostique incorporant les deux biomarqueurs avait une aire sous la courbe (AUC) de 0,838, avec une sensibilité de 84,00 % et une spécificité de 76,00 %. Les deux marqueurs ont diminué après intervention thérapeutique (P<0,05), montrant les valeurs les plus basses chez les patients négatifs en culture (P<0,05). De plus, le modèle combiné a montré une utilité prédictive pour la conversion en culture, atteignant un AUC de 0,756 (sensibilité de 65,71 %, spécificité de 80,00 % ; P<0,001). La détection combinée de l’IFN-γ et du CD64 peut diagnostiquer efficacement l’apparition de l’ATB chez les personnes âgées immunodéprimées, fournissant ainsi une référence pour la pratique clinique.
La tuberculose pulmonaire (TB), une maladie infectieuse chronique causée par Mycobacterium tuberculosis (MTB), provoque plus de 10 millions de nouveaux cas dans le monde chaque année et constitue la principale cause de décès due à un seul agent pathogèneinfectieux 1. Cliniquement, les populations à haut risque d’ATB incluent les personnes immunodéprimées, les patients diabétiques, les fumeurs de longue date, les contacts étroits de cas de tuberculose et les personnesâgées 2. Parmi ces groupes, les personnes âgées présentant une immunité altérée présentent un risque nettement accru d’ATB3. Le diagnostic précis et précoce de la tuberculose active (ATB) est crucial pour le pronostic, compte tenu de sa transmissibilité et du risque de progressionsévère 4. Pourtant, les stratégies actuelles, reposant sur la symptomatologie, l’imagerie et les tests d’expectoration, manquent de biomarqueurs spécifiques, créant un vide diagnostiquecritique 5. Cette incertitude diagnostique est aggravée par l’absence d’indicateurs dynamiques d’évaluation de la gravité, conduisant souvent à un traitement empirique qui ne répond pas aux besoins individuelsdes patients 6. Par conséquent, l’identification de biomarqueurs très sensibles et spécifiques est impérative pour améliorer la différenciation et la stratification précoces de l’ATB.
L’interféron-γ (IFN-γ), une cytokine centrale dans la réponse des lymphocytes T aux antigènes spécifiques du MTB, reflète l’état d’activation immunitaire de l’ATB, avec des niveaux sériques élevés facilitant son diagnostic ; de plus, il a une valeur pour différencier l’infection tuberculeuse latente (LTBI) etl’ATB 7,8. Bien que précieux, son utilité est compromise par une spécificité limitée due à l’interférence de la vaccination contre le bacille Calmette-Guerin et d’autresinfections 9. Inversement, les neutrophiles constituent la première population de cellules immunitaires recrutées dans les poumons et infiltrent les lésions d’ATB, où leur implication dans l’amplification inflammatoire est liée à la surexpression de CD64, le récepteur Fc-gamma I10 à haute affinité. Néanmoins, aucune étude antérieure n’a combiné IFN-γ et neutrophile CD64 pour évaluer leur utilité diagnostique et pronostique synergique pour l’ATB, en particulier chez les personnes âgées immunodéprimées, une cohorte présentant des défis diagnostiques uniques en raison de réponses immunitaires atténuées et de présentations cliniques atypiques.
Cette étude a sélectionné IFN-γ et CD64 pour leurs rôles complémentaires dans l’immunité anti-MTB adaptative et innée, l’accessibilité aux essais cliniques et la valeur diagnostique indépendante rapportée dans des études antérieures, sans évaluation combinée à ce jour chez des patients âgés immunodéprimés. L’étude combine l’IFN-γ sérique (mesuré via un test immunosorbent lié aux enzymes [ELISA], reflétant l’immunité adaptative des lymphocytes T) et le neutrophile CD64 (mesuré par cytométrie en flux, refletant l’activation immunitaire innée et la charge inflammatoire), avec une performance diagnostique évaluée via l’analyse de la courbe des caractéristiques opérantes du récepteur (ROC) et la modélisation de régression logistique. L’utilité de ce test combiné pour le diagnostic et le suivi de la progression de la maladie ATB chez les personnes âgées immunodéprimées a été systématiquement évaluée.
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Le protocole d’étude a reçu l’approbation du Conseil d’éthique institutionnelle du cinquième hôpital populaire de Ganzhou, Ganzhou, Jiangxi, Chine. Un consentement éclairé écrit a été obtenu de toutes les personnes ayant participé à l’étude. Toutes les procédures impliquant Mycobacterium tuberculosis (MTB) viable ont été réalisées dans une installation de confinement de niveau de biosécurité 3 (BSL-3), en pleine conformité avec les directives nationales de biosécurité pour la manipulation des agents pathogènes infectieux. Pour la liquéfaction des crachats médiée par NaOH, les opérateurs portaient un équipement de protection individuelle complet (respirateurs N95, gants en nitrile, blouses résistantes aux fluides et visières) pour éviter l’exposition à des produits chimiques et aux aérosols. Les réactifs et l’équipement utilisés sont listés dans le tableau des matériaux.
1. Participants à la recherche
Le protocole de l’étude commence par l’inscription et le consentement éclairé des participants éligibles et se termine par l’achèvement de l’analyse statistique de tous les critères principaux et secondaires. Cette étude rétrospective monocentrique a recruté des patients ATB (groupe ATB) et des témoins sains (groupe témoin) de notre hôpital entre mai 2023 et mai 2025, toutes les procédures ayant été réalisées avant l’analyse des données. Le diagramme de flux de l’étude est illustré à la Figure 1. Les groupes ATB et témoins étaient comparables au départ, sans différences significatives dans les caractéristiques démographiques et les comorbidités chroniques courantes (P>0,05, Tableau 1), confirmant l’homogénéité des deux groupes.
2. Estimation de la taille de l’échantillon
La taille de l’échantillon a été estimée à partir de données préliminaires de 10 sujets, qui montraient des niveaux médians d’IFN-γ de 20 pg/mL chez les patients ATB contre 10 pg/mL chez les témoins sains. Pour détecter une différence significative (en supposant un niveau de signification [α]=0,05, à deux côtés ; puissance de test [1-β]=80 % ; taille d’effet moyenne [Cohen’s d≈1,2]), une analyse avec le logiciel PASS 15.0 a donné un minimum de 42 participants par groupe (puissance réelle=81,2 %, α=0,05, à deux côtés). En tenant compte d’un taux d’abandon de 10 % à 15 %, nous avons finalement recruté un total de 100 sujets (50 par groupe) après un criblage selon les critères de l’étude.
3. Collecte d’échantillons de test
3 à 5 mL de sang veineux à jeun ont été prélevés sur chaque patient. Le sang a été prélevé directement dans un tube EDTA pour une analyse du CD64 par cytométrie en flux et un tube activateur de caillots pour la séparation sérique. Le sérum a ensuite été analysé pour évaluer les niveaux de protéine réactive C (γ CRP) et de taux de sédimentation des érythrocytes (ESR).
4. Cytométrie en flux
Le sang total (100 μL) a été incubé avec un cocktail d’anticorps prémélangé (5 μL chacun de CD16-FITC, CD14-APC et CD64-PE) pendant 20 minutes à température ambiante dans l’obscurité. Les érythrocytes ont ensuite été lysés avec 1 mL de solution lysante BD FACS pendant 10 minutes, protégés de la lumière. Après centrifugation (centrifugation à 300 × g pendant 5 minutes à température ambiante), le surnageant était abandonné. Le reste de la granule cellulaire a été lavé deux fois avec du sérum physiologique tamponné phosphate (PBS) puis finalement resuspendu dans 500 μL de PBS pour une acquisition immédiate sur le cytomètre de flux. Pour l’analyse, nous avons d’abord verrouillé la population leucocytaire en utilisant les paramètres de diffusion directe (FSC) et de dispersion latérale (SSC). Les neutrophiles ont ensuite été identifiés sélectivement dans cette porte comme étant négatifs pour les événements CD14-APC (hors monocytes) et positifs pour CD16-FITC. La population CD64-positive a été définie à l’aide d’un contrôle isotype apparié, la porte étant définie pour inclure <1 % des événements de contrôle isotype ; le pourcentage de neutrophiles positifs CD64 (CD64 %) a été calculé comme la proportion de neutrophiles verrouillés se situant à l’intérieur de cette porte positive. Pour des raisons de contrôle qualité, l’étude a inclus un échantillon témoin sain dans chaque expérience afin d’établir une plage de base d’IMF (15–30). Tout échantillon d’IMF persistant au-dessus de 30 a été noté. L’étalonnage quotidien de l’instrument était également effectué à l’aide de billes BD CS&T pour maintenir une compensation de fluorescence et des réglages de tension constants. Paramètres d’acquisition de l’instrument : L’acquisition cytométrique en flux a été réalisée sur un cytomètre en flux, avec un minimum de 10 000 événements neutrophiles à la porte collectés par échantillon. Les tensions de diffusion directe (FSC) et de diffusion latérale (SSC) étaient réglées respectivement à 350 V et 280 V. Les tensions des canaux de fluorescence étaient optimisées quotidiennement à l’aide de billes BD CS&T afin d’assurer une détection et une compensation cohérentes. Points de contrôle de la qualité visuelle : (1) La population de leucocytes a été clairement résolue sur les parcelles FSC/SSC sans contamination significative par les débris ; (2) La grille neutrophile a été confirmée comme étant CD14-négative et CD16-positive, avec une contamination par <5 % de monocytes ; (3) L’histogramme de fluorescence CD64 était unimodal sans coloration non spécifique significative.
5. ELISA
Le sérum était séparé par centrifugation, et le test était réalisé selon les instructions du fabricant pour le kit ELISA. En résumé, 50 μL d’échantillons de sérum standard ou test ont été distribués dans des puits recouverts d’anticorps et incubés à 37 °C pendant 90 minutes. Les étapes suivantes ont impliqué l’ajout séquentiel d’un anticorps anti-humain biotinylé d’IFN-γ (100 μL), du complexe streptavidine et peroxydase de raifort (HRP) (100 μL), du substrat chromogénique et de la solution d’arrêt. Un algorithme d’ajustement à quatre paramètres a été appliqué à la courbe standard pour calculer les concentrations finales d’IFN-γ en pg/mL. Contrôle qualité : La validité de l’essai exigeait que les valeurs de QC basses/moyennes/élevées (15,6, 62,5, 250 pg/mL) se situent dans la plage spécifiée ± 2 DC, avec des coefficients de variation intra et inter-essais (CV) maintenus respectivement inférieurs à 8 % et 10 %.
6. Dosage immunoturbidimétrique
Après centrifugation, les niveaux de CRP sérique ont été déterminés à l’aide d’un analyseur biochimique automatisé avec un kit immunoturbidimétrique amélioré par particules de latex adapté, selon le protocole standardisé du fabricant. Le test reposait sur l’agglutination de la CRP avec des anticorps spécifiques liés à des particules de latex, ce qui augmentait la turbidité en proportion directe de la concentration de CRP et était quantifié photométriquement. Contrôle qualité : Chaque lot de test comprenait des sérums de contrôle qualité à faible concentration (< 3 mg/L) et à haute concentration (>100 mg/L) (Beckman). Les valeurs obtenues devaient se situer dans la plage acceptable spécifiée par le fabricant (±3 SD). La CV intra-essais a été maintenue à ≤5 %, et la CV inter-essais à ≤8 %.
7. Méthode de Westergren
Le sang veineux dans le tube activateur de caillots a été laissé debout pendant 1 heure. Le plasma était ensuite aspiré dans un tube Westergren de 1,6 mL et placé verticalement dans un analyseur ESR à 37 °C pendant 1 heure. Le résultat était automatiquement calculé et rapporté comme la hauteur de sédimentation en mm/h. Contrôle qualité : L’analyseur était calibré quotidiennement à l’aide d’un tube de sédimentation standard pour l’étalonnage du point zéro.
8. Culture du VTT
Les échantillons d’expectorations ont été liquéfiés avec 4 % de NaOH, neutralisés puis centrifugés (centrifugation à 1200 × g pendant 15 minutes à température ambiante), suivies d’un retrait du surnageant. Les sédiments obtenus ont été inoculés sur un milieu Löwenstein-Jensen (L-J) (2-3 gouttes par tube). Les cultures ont été incubées à 37°C dans un incubateur à température constante et examinées chaque semaine pour détecter la croissance de la colonie. Un résultat positif a été défini par l’apparition de colonies typiques ressemblant à des chou-flois en ≥2 semaines. Contrôle qualité : Les mesures de contrôle qualité comprenaient des contrôles simultanés négatifs (sérum stérile) et positifs (H37Rv) dans chaque lot, ainsi que des tests mensuels de stérilité du milieu de culture.
9. Traitement et suivi
Tous les patients atteints d’ATB ont reçu un traitement antituberculeux standardisé de première intention (schéma de 2 HRZE/4 HR : phase intensive de 2 mois avec isoniazide, rifampicine, pyrazinamide, éthambutol ; phase de continuation de 4 mois avec isoniazide et rifampicine). Une culture mycobactérienne d’expectorations a été réalisée au départ et 2 mois après le début du traitement afin d’évaluer la conversion en culture.
10. Élimination des déchets
Les déchets biodangereux (y compris des échantillons de sang résiduel, des échantillons d’expectorations et des matériaux de culture MTB) ont été décontaminés par autoclavage à 121 °C pendant 30 minutes avant l’élimination finale. Les déchets chimiques (y compris la solution de NaOH, le tampon de lyse et les réactifs fluorescents de coloration) étaient collectés dans des contenants scellés et désignés pour déchets dangereux, puis éliminés conformément aux protocoles institutionnels de gestion des déchets chimiques.
11. Méthodes statistiques
L’analyse de l’étude utilisait SPSS 30.0. Les données catégorielles (par exemple, le genre) ont été comparées par des tests du chi-carré. La normalité des données continues a été vérifiée via le test de Shapiro-Wilk, et l’homogénéité de la variance via le test de Levene. Les données continues normalement distribuées avec variance homogène ont été comparées à l’aide de tests t à échantillons indépendants ; les données anormalement distribuées ont été comparées à l’aide du test Mann-Whitney U. L’analyse de la courbe ROC a été réalisée à l’aide du module « ROC Curve », avec un statut diagnostique binaire (ATB vs. contrôle) comme variable d’état et les niveaux de biomarqueurs comme variable de test. Le modèle diagnostique combiné a été construit via une régression logistique binaire, avec IFN-γ et CD64 entrés comme variables indépendantes continues et l’état diagnostique (ATB=1, contrôle=0) comme variable dépendante. La formule de régression était : Logit(P) = -3,274 + 0,082×IFN-γ (pg/mL) + 0,115×CD64 %. La valeur de coupure pour la détection combinée était basée sur la probabilité prédite par le modèle, le seuil optimal étant déterminé par l’indice de Youden. Des probabilités prédites par le modèle ont été utilisées pour générer la courbe ROC combinée. Les corrélations ont été calculées à l’aide du coefficient de Pearson. Une valeur P<0,05 définit la signification statistique.
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
L’efficacité diagnostique de la détection combinée de l’IFN-γ et du CD64 dans l’ATB
Comparé au groupe témoin, le taux moyen de NIF-γ sérique dans le groupe ATB a augmenté de 22,57 % (21,84 ± 4,23 contre 16,91 ± 4,41 pg/mL, P<0,05), et la moyenne CD64 % a augmenté de 24,97 % (14,90 ± 4,04 contre 11,18 ± 3,56, P<0,05). L’analyse de la courbe ROC a indiqué que l’IFN-γ présentait une sensibilité diagnostique de 64,00 % et une spécificité de 86,00 % pour l’ATB (AUC=0,803, ...
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Cette étude propose un cadre diagnostique et pronostique intégré à double biomarqueur combinant IFN-γ sérique (un marqueur de l’immunité adaptative des lymphocytes T) et le neutrophile CD64 (marqueur de l’activation immunitaire innée) pour l’ATB chez les patients âgés immunodéprimés, une population à haut risque avec des besoins cliniques non satisfaits, pour des tests tuberculeux précis et non invasifs. La prise en charge de l’ATB est complexe par sa nature infectieuse et son potentiel ...
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Les auteurs déclarent ne pas exister de conflit d’intérêts.
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Analyseur biochimique automatique AU5800 | Beckman Coulter | B04077 | Un instrument utilisé pour détecter et analyser les substances chimiques de la vie. |
| CD14-APC | Agilent | 8730057 | Un anticorps marqué fluorescentement pour la cytométrie en flux qui reconnaît spécifiquement l’antigène CD14. |
| CD16-FITC | Agilent | 8920064 | Un anticorps marqué fluorescentement pour la cytométrie de flux qui reconnaît spécifiquement l’antigène CD16. |
| CD64-PE | Agilent | 8730119 | Un anticorps marqué fluorescentement pour la cytométrie de flux qui reconnaît spécifiquement l’antigène CD64. |
| Cytométrie en flux CytoFLEX LX | Beckman Coulter | C00445 | Un analyseur cellulaire qui mesure l’intensité de fluorescence des marqueurs cellulaires colorés. |
| IFN-& gamma ; Kit ELISA | Wuhan Jilid Biotechnology Co., LTD | J20272 | Un outil basé sur le test sandwich à double anticorps pour la détection de l’IFN-& gamma ; des concentrations. |
| Médium L-J | Shandong Topu Biological Engineering Co., LTD | M1607 | Un milieu utilisé pour l’isolement et la culture de mycobactéries telles que Mycobacterium tuberculosis. |
| PASS | NCSS | v.15.0 | Un logiciel pour soutenir les analyses de puissance et les calculs de taille d’échantillon. |
| SPSS | IBM | v.30.0 | Un logiciel pour le traitement des données, l’analyse et la visualisation de données. |
| Analyseur de sédimentation des érythrocytes XS-1000i | Sysmex | V147451 | Un dispositif médical utilisé pour les analyses sanguines cliniques. |