Article de recherche

Établissement de cultures primaires enrichies en zone à partir du cortex surrénalen de la souris

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DOI :

10.3791/70403

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8 mai 2026

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1Division of Endocrinology, Boston Children's Hospital, 2Department of Pediatrics, Harvard Medical School, 3Harvard Stem Cell Institute, 4Institute of Biomedical Science, University of São Paulo, 5Broad Institute of MIT and Harvard

Dans cet article

Résumé

Une approche robuste et reproductible pour établir des cultures primaires 2D de cellules enrichies en zones gloméruloses et zones fasciculées a été développée pour le cortex surrénalien de la souris. Ce système préserve les caractéristiques moléculaires et fonctionnelles clés de chaque zone, permettant une étude ciblée des voies de signalisation, de la production d’hormones et du comportement des cellules corticales surrénales ex vivo.

Résumé

La glande surrénale de la souris est encapsulée par une couche cellulaire mésenchymatose (capsule) et contient un cortex sous-jacent organisé en zones concentriques distinctes avec des fonctions endocriniennes spécialisées : la zona glomeruleuse (zG), qui produit l’aldostérone, et la zona fasciculée (zF), qui produit la corticostérone. La moelle surrénalienne, située au centre de la glande, produit des catécholamines. Les études mécanistiques des cellules de chaque zone adrénocorticale ont été limitées par l’absence de modèles in vitro qui préservent leurs caractéristiques moléculaires, cellulaires et fonctionnelles spécifiques à chaque zone. Pour surmonter cette limitation, une approche de fractionnement a été développée utilisant la microdissection des glandes surrénales adultes de souris. Cette méthode sépare les cellules surrénales des souris mâles en une fraction externe enrichie en zG (OF), contenant des cellules capsule et zG, et une fraction interne enrichie en zF (FI), qui contient zF et cellules bulbeuses. Ces fractions ont été utilisées pour générer des cultures primaires bidimensionnelles (2D) enrichies pour les cellules zG ou zF. L’analyse de l’expression génique a confirmé que les cultures enrichies en zG expriment des niveaux élevés de marqueurs zG (Cyp11b2, Dab2 et Shh), ainsi qu’une augmentation des marqueurs de la voie Wnt/β-caténine (Wnt4, Lef1). En revanche, les cultures enrichies en zF ont montré une expression plus élevée des marqueurs zF (Cyp11b1 et Akr1b7) et des niveaux plus faibles de marqueurs de la voie Wnt/β-caténine, ce qui correspond à une signature transcriptionnelle zF. L’expression de marqueurs stéroïdogènes (Nr5a1, Star) a validé l’origine adrénocorticale des deux fractions cellulaires. La tyrosine hydroxylase indique la présence de cellules médullaires surrénales dans des cultures enrichies en zF. Sur le plan fonctionnel, les cultures enrichies en zG produisaient de l’aldostérone dans des conditions basales et montraient une production accrue en réponse à l’angiotensine II, au potassium et à l’hormone adrénocorticotrope (ACTH). Inversement, les cultures enrichies en zF produisaient de la corticostérone au départ et montraient une augmentation de la production en réponse à la stimulation de l’ACTH. Dans l’ensemble, ce protocole représente un modèle in vitro robuste, reproductible et biologiquement pertinent pour l’étude de la biologie du cortex surrénal. Ce système permet l’étude spécifique à une zone des voies de signalisation, des mécanismes moléculaires et des réponses physiologiques.

Introduction

Une fine capsule mésenchymateuse encapsule la glande surrénale de la souris, qui se compose de deux compartiments principaux : le cortex externe et la moelle moelleuse interne. Le cortex surrénal du mâle adulte est en outre divisé en zones distinctes, la zona gloméruleuse (zG) et la zona fasciculée (zF), chacune présentant des caractéristiques morphologiques et fonctionnellesuniques 1,2,3,4. La fonction principale du cortex surrénalien est la production d’hormones stéroïdes, notamment des minéralocorticoïdes (aldostérone) et des glucocorticoïdes (corticostérone chez la souris)5. Le zG est la région la plus externe et la plus compacte, constituée de cellules ovoïdes organisées en structures rosettes qui expriment l’aldostérone synthase (CYP11B2), permettant la production d’aldostérone 2,3,5,6,7. La sécrétion d’aldostérone est principalement régulée par le système rénine-angiotensine-aldostérone (RAAS), le potassium, et dans une moindre mesurel’ACTH 5,8. Le zF est composé de cellules plus grandes disposées dans des cordons/fascicules radiaux, constitue la majorité (~85 %) du cortex et est principalement régulé par l’ACTH 2,3,5,9. De multiples voies de signalisation orchestrent le développement, le maintien et la fonction des glandes surrénales en régulant la dynamique des cellules progénitrices, la zonation et l’activité stéroïdogénique. Parmi ceux-ci, le SF-1 (Facteur Stéroïdogène-1, Nr5a1) est un régulateur maître essentiel à la spécification adrénocorticale, à la prolifération et à la productiond’hormones 10. La signalisation hérissonique (Shh), active dans le zG, favorise l’expansion des cellules progénitrices et soutient le renouvellement cortical dans lezG 11, 12, 13.

La signalisation Wnt, en particulier via la voie canonique β-caténine, est cruciale pour la zonation surrénale et l’intégrité corticale. Chez la souris, la taille adrenotrocortique normale et la zonation sont régulées par un gradient d’activité de signalisation WNT s’étendant de la capsule jusqu’au zF. Ce gradient est soutenu par une expression localisée des ligands et potentisateurs WNT, principalement WNT4 dans le zG, et WNT2B et R-spondins (RSPO1 et/ou RSPO3) dans lacapsule 7,14,15,16,17,18,19,20,21,22 . Le cortex surrénalien est maintenu par le flux centripète des cellules progénitrices prolifératives situées dans la région zG sous-capsulaire/externe, ce qui donne lieu à des cellules zG différenciées migrant vers l’intérieur vers le zF. À mesure que les cellules passent du zG au zF, elles subissent des changements dans l’expression et la fonction des gènes appelés trans-différenciation. Ce modèle a été fortement soutenu par des études de traçage de lignées utilisant la lignée transgéniqueAS Cre/+ de souris, qui cible spécifiquement les cellules productrices d’aldostérone dans le zG 23,24,25.

Plusieurs approches in vitro ont été utilisées pour étudier la biologie surrénalienne basée sur la dissociation de la glande surrénaleentière 26,27,28. Par exemple, une étude a décrit la dissociation du cortex surrénalien pour des analyses électrophysiologiques et des pinces de patch27, et une autre étude a utilisé des cellules corticales surrénales dissociées pour étudier les mécanismes de signalisation liés à la physiologie surrénalienne et à la régulation de la pressionartérielle 26. Bien que ces méthodologies aient fourni d’importantes connaissances fonctionnelles, elles reposent sur des cellules issues de préparations surrénales complètes plutôt que sur la séparation des zones corticales avant la culture cellulaire.

Compte tenu de la complexité et de la diversité histologique de la glande surrénalienne, comprendre les rôles distincts de ses compartiments cellulaires est essentiel pour élucider les mécanismes sous-jacents à la fonction surrénalienne. Dans cette étude, des cultures cellulaires adrénocorticales primaires chez la souris enrichies en cellules zG ou zF ont été établies. Un avantage majeur de cette méthode est la génération de cultures cellulaires enrichies en zG, permettant la modulation expérimentale des voies de signalisation et des facteurs environnementaux pour mieux étudier son rôle spécifique dans la biologie du cortex surrénal. Cela inclut l’étude du maintien des cellules progénitrices, les mécanismes sous-jacents à la plasticité zonale et à la trans-différenciation vers le zF, ainsi que la modélisation de la composition de la matrice extracellulaire. Parallèlement, cette méthode génère des cultures cellulaires zF hautement enrichies, fournissant une plateforme complémentaire pour des études fonctionnelles et de signalisation spécifiques à chaque zone. Ensemble, ces caractéristiques fournissent un système robuste et expérimentalement contrôlé pour faire progresser la compréhension de la biologie surrénalienne.

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Protocole

Toutes les expériences ont été menées conformément aux protocoles approuvés par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Hôpital pour enfants de Boston (IACUC) sous le numéro d’approbation 00002611. Une liste complète de tous les matériaux utilisés dans ce protocole, y compris les réactifs, consommables et équipements, est fournie dans le tableau des matériaux, ainsi que les fabricants et numéros de catalogue correspondants afin d’assurer leur reproductibilité.

Cultures primaires de cellules de la zona gléméruleuse et de la zona fasciculée de la surrénale de souris
Les méthodes utilisées pour établir des cultures primaires de cellules adrénocorticales mâles adultes de type sauvage (Mus musculus, C57BL/6) dans cette étude ont été adaptées d’une procédure initialement développée pour les ratsSprague-Dawley 28. Pour confirmer la ségrégation et l’identité des populations cellulaires de zona glomerulosa et zona fasciculata, un modèle de traçage de la lignée a été utilisé avec des souris Cyp11b2tm1.1(cre)Brlt/+ (également appelées Cre) 1,2,3,4 et Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato-EGFP) Luo/J (également connues sous le nom de souris ROSAmT/mG)29.

Préparation avant la procédure
Matériaux
Deux jeux de pinces et ciseaux pour les incisions superficielles et un autre ensemble pour l’incision de la cavité abdominale (Figure supplémentaire 1A). Réchauffé le milieu de culture et le PBS (37 °C). J’ai préparé 2 plats (P60) avec DMEM/F-12. Préparé 3 plats (P60) avec du PBS chauffé pour laver les glandes en séquence (bain 1, 2 et 3) (Figures supplémentaires 1B, 1–3), et 1 plat pour maintenir la surrénale en solution (Figures supplémentaires 1B, 4). Préparé 2 plats (P60) avec du papier filtre stérile à la surface (Figures supplémentaires 1C, 1–2). Préparé 2 bols P60 contenant 500 μL de solution digestive et marqué pour la glomerulosa (zG) ou les fasciculates (zF) (Figures supplémentaires 1D, zG, zF). J’ai préparé 2 tubes, étiquetés zG et zF, et ajouté 4,5 mL de solution digestive.

Solutions
Pour préparer la solution digestive, la collagénase de type I (concentration finale 4 mg/mL) et la DNase I (concentration finale 0,04 mg/mL) ont été dissoutes dans 5 mL de milieu pur DMEM/F-12. Filtré la solution dans un tube de 50 mL à l’aide d’une seringue et d’un filtre 0,22 μM. La solution digestive doit être préparée fraîche à chaque fois.

Animaux
Pour obtenir des cultures primaires enrichies pour les cellules de la zona glomerulosa et de la zona fasciculante surrénales de souris, utilisez 10 à 15 jeunes mâles adultes, âgés d’environ 6 à 7 semaines. Les femelles ont des glandes surrénales légèrement plus grandes que les hommes, et n’importe quel sexe peut être utilisé selon ce protocole. Cependant, dans cette étude, seuls des mâles ont été utilisés pour éviter toute interférence potentielle de la zone X présente chez les jeunes femelles, assurant une séparation zonale précise. Les souris ont été euthanasiées par inhalation de CO₂ conformément aux directives institutionnelles de soins aux animaux. La mort a été confirmée par l’absence de respiration et de réponse réflexe. Les glandes surrénales ont été disséquées immédiatement, dans les 3 à 5 minutes suivant la confirmation du décès, afin de préserver la viabilité tissulaire.

Position et exposition de l’abdomen
La souris a été placée en position décubitus dorsale sur une surface plane stérile (Figure 1A). Le pelage de l’animal a été désinfecté à 70 % d’alcool. Des pinces et des ciseaux ont été utilisés pour les incisions cutanées, et le second ensemble pour l’incision de la cavité abdominale. Une incision initiale a été réalisée dans la région inguinale de l’abdomen, s’étendant latéralement vers le thorax des deux côtés pour exposer le péritoine (Figure 1B). La peau a été soigneusement rétractée, suivie de la musculature abdominale, pour exposer la cavité abdominale (Figure 1C). L’incision initiale doit être superficielle afin d’éviter des dommages aux organes internes. Avancez vers la couche musculaire par une incision prudente, puis exposez la cavité abdominale. Évitez la rupture des vaisseaux sanguins, car le saignement peut rendre difficile la localisation des glandes surrénales et retarder la collecte. Changez les instruments chirurgicaux pour minimiser la contamination microbienne.

Identification et collecte de la glande surrénale gauche
La glande surrénale gauche est située médialement et supérieure au rein gauche dans le rétropéritoine, avec une forme ovale et une coloration rose, entourée de tissu adipeux blanc (Figures 1D–G). Tout en déplaçant soigneusement les organes adjacents avec des pinces émoussées pour améliorer la visualisation, utilisez des ciseaux pour retirer la majeure partie du tissu adipeux en utilisant des coupures courtes et contrôlées, isolant ainsi la glande surrénalienne. Évitez de saisir directement la glande surrénale pour éviter d’endommager sa capsule. La glande a été placée immédiatement après l’isolement dans une boîte de culture P60 avec 10 mL de DMEM/F-12 préchauffé à 37 °C (Figure 1F).

Identification et collecte de la glande surrénale droite
La glande surrénale droite est située latéralement et supérieure au rein droit dans le rétropéritoine, avec une forme ovale et une coloration rose (Figures 1E–H). Identifier cette glande surrénale peut être plus difficile en raison de sa proximité avec d’autres organes, tels que le foie et le côlon ascendant, ainsi que les vaisseaux sanguins voisins. Tout en déplaçant soigneusement les organes adjacents avec des pinces émoussées pour améliorer la visualisation, utilisez des ciseaux pour retirer la majeure partie du tissu adipeux en utilisant des coupures courtes et contrôlées, isolant la glande surrénalienne tout en veillant à ne pas endommager la capsule. La glande a été placée immédiatement après l’isolement dans une boîte de culture P60 avec 10 mL de DMEM/F-12 préchauffé à 37 °C. Les surrénales sont combinées dans le même plat (Figure 1F). Pendant la procédure, il est essentiel de manipuler avec soin les principaux vaisseaux sanguins de la zone afin d’éviter des coupures accidentelles, qui peuvent provoquer des saignements et compliquer le processus de prélèvement. Les principaux vaisseaux à surveiller incluent les veines rénales et les artères rénales. J’ai recueilli la glande surrénale avec un peu de tissu adipeux adhésif. Cela facilite la manipulation de la glande et protège contre les dommages et la contamination de la capsule (Figure 1I).

Travail dans une hotte à écoulement laminaire stérile
Avant de transférer les glandes dans la hotte à flux laminaire, la plaque était nettoyée avec 70 % d’alcool. Les surrénales ont été lavées trois fois avec du PBS à température ambiante (25 °C) (dans les plats 1, 2 et 3 et collectées dans le plat 4) (Figure supplémentaire 1B). Le papier filtre aide à l’adhérence des graisses et assure de meilleurs résultats. Lors de la préparation de plusieurs glandes, les tissus séparés doivent être maintenus dans du DMEM pré-chauffé afin de préserver leur viabilité. La glande surrénale était saisie par le tissu adipeux adhérent (Figures 1I–J), et la graisse était soigneusement disséquée sur le papier filtre (Figure supplémentaire 1C, plat 1), à l’aide de pinces fines et de mouvements contrôlés pour éviter d’endommager la capsule. Le résultat attendu est une glande lisse et intacte, exempte d’excès de tissu adipeux et de tissu conjonctif, comme montré à la Figure 1K. Les glandes surrénales ont été transférées soigneusement sur du papier filtre frais (Figure supplémentaire 1C, plat 2) pour faciliter une microdissection précise. La capsule a été délicatement pincée avec de fines pinces, et à l’aide de la lame du scalpel, une incision radiale a été réalisée dans la glande sans complètement transpercer le tissu.

Le contenu interne du cortex était délicatement exposé en l’expulsant vers l’extérieur par l’incision par une légère pression mécanique avec les pinces. La capsule et le zG restaient connectés à l’extrémité des pinces, tandis que le matériau glandulaire expulsé interne correspondait au zF et à la médule. La digestion enzymatique ne doit être lancée qu’après que toutes les glandes ont été traitées (Figure 1L), en raison de la séparation mécanique des zones externes et internes.

Digestion
Deux tubes étaient identifiés comme OF (Fraction externe : capsule et zG) ou IF (Fraction interne : zF et moelle moelleuse) (Figure 1M). Un total de 4,5 mL de solution digérante préchauffée (37 °C) a été ajouté, et l’OF et l’IF ont été transférés dans les tubes appropriés. Les échantillons ont été incubés à 37 °C dans un incubateur humidifié avec 5 % de CO₂ pendant 30 minutes, et les tubes ont été doucement tournés toutes les 10 minutes, en les inversant manuellement 2 à 3 fois pour assurer une exposition uniforme à la solution enzymatique. Le temps nécessaire à la digestion peut varier en fonction de la qualité, de l’activité et des conditions de stockage de la collagénase. Après 30 minutes, le tissu était dissocié en pipettant 40 fois de haut en bas avec des mouvements lents et contrôlés, à l’aide d’une pipette sérologique de 5 mL pour générer une boue cellulaire. Après la dissociation du tissu, idéalement, aucun fragment visible ne devrait rester et le milieu devrait apparaître trouble. Si des fragments sont encore présents, une digestion supplémentaire de 15 minutes peut être envisagée.

Lavage et plaquage
Après la digestion, les cellules ont été lavées en ajoutant 45 mL de DMEM/F-12 pour éliminer l’enzyme résiduelle (Figure 1 M). Les échantillons ont été centrifugés à 150 × g pendant 12 minutes à température ambiante (25 °C). Après centrifugation, un petit granule compact avec une apparence légèrement rosée à jaune pâle est attendu, tandis que le surnageant doit rester clair et exempt de particules visibles. Le surnageant fut soigneusement retiré et jeté, en prenant soin de ne pas déranger la boule. Le pellet a été repoussé dans un milieu de culture préchauffé (37 °C) selon le volume final requis pour le placage (voir ci-dessous). Une densité de plaques optimale d’environ 70 % a été maintenue afin d’assurer la viabilité et la vigueur de la culture. Le nombre de cellules a été estimé à l’aide d’une chambre de comptage de Neubauer avant le plaquetage, et le nombre de cellules ensemencées a été ajusté selon la zone de la cuvette de culture pour obtenir la confluence souhaitée. Placez les cellules de fraction externe enrichies en zG (OF) à une densité d’environ un animal par puits (généralement ~1,5–2,5 × 104 cellules) et les cellules de fraction interne enrichies en zF à ~0,63 animaux par puits (généralement ~2,5–4,0 × 104 cellules) dans une plaque à 48 puits.

Entretien de la culture cellulaire
Les cellules ont été cultivées dans le milieu de culture décrit ci-dessus et maintenues dans des conditions standard dans un incubateur humidifié à 37 °C avec 5 % de CO₂. Après 24 heures de culture, le milieu a été remplacé pour éliminer les débris et les cellules sanguines résiduelles. Cette étape favorise une croissance optimale. La plaque était soigneusement atmosphérique, et un milieu frais préchauffé (37 °C) était ajouté. Attendez au moins 48 heures avant d’évaluer les cellules dans les expériences fonctionnelles. Il est recommandé d’attendre trois jours avant de réaliser des expériences fonctionnelles afin de s’assurer que les cultures sont bien établies. Une culture prolongée au-delà de cette période peut nécessiter la trypsinisation et le passage, ce qui peut entraîner la sélection cellulaire et la perte des caractéristiques primaires de la culture.

Analyse des données et procédures de soutien
Préparation de cultures cellulaires surrénales primaires
Des cultures primaires de glandes surrénales entières ont été établies selon les mêmes procédures pour la collecte, la digestion, le lavage et le plaque-tissus, et ont été utilisées comme témoins standard pour les tests moléculaires et fonctionnels.

Analyse de l’expression génique
Pour purifier l’ARN total des cellules OF et IF, les cellules cultivées ont été homogénéisées dans TRIReagent à l’aide du kit ARN, selon le protocole du fabricant. L’intégrité et la concentration de l’ARN ont été évaluées par spectrométrie. Le traitement ultérieur de l’ARN total impliquait la transcription inverse en ADNc à l’aide du kit de transcription inverse à haute capacité. L’analyse de l’expression génique a été réalisée par PCR quantitative en temps réel (qPCR) à l’aide du thermocycleur. Des doublons techniques étaient utilisés pour contrôler la variabilité. Le mélange universel TaqMan Universal PCR Master Mix et les amorces TaqMan pour souris ont été utilisés (Tableau 1). Une valeur de seuil de cycle (CT) était sélectionnée dans la plage d’amplification linéaire pour chaque échantillon effectué en double. Elle a été normalisée par les gènes témoins endogènes β-actine et la protéine ribosomique 18S (Rps18). Les niveaux d’expression relatifs ont été calculés à l’aide de la méthode 2–ΔΔCt 30. Les données de trois expériences différentes sont présentées en moyenne ± écart-type (DS). Nous avons réalisé trois expériences indépendantes.

Stimulation de la sécrétion d’aldostérone et de corticostérone dans les cultures primaires ZG et ZF
Des cultures primaires de cellules de la zona gloméruleuse (ZG) et de la zona fasciculata (ZF) ont été établies et maintenues à 37 °C dans une atmosphère humidifiée contenant 5 % de CO₂. Environ 5 × 104 cellules ont été placées par puits dans une plaque à 48 puits utilisant un milieu de croissance complet. Après quatre jours de culture continue, les mesures de sécrétion basale ont reflété la production hormonale cumulative sur cette période. Pour les tests de stimulation, le milieu était aspiré, et les cellules lavées une fois avec du sérum physiologique tamponné phosphate (PBS) pour éliminer les facteurs résiduels. Par la suite, 200 μL de milieu frais ont été ajoutés à chaque puits, et les tests suivants représentent une sécrétion stimulée aiguë dans une fenêtre de temps définie. Pour les tests de stimulation aldostérone, le milieu de culture a été complété par de l’angiotensine II (Ang II, 10 nM), du potassium (K+), sous forme de chlorure de potassium (KCl, 10 mM) et d’ACTH (10 nM). Le chlorure de sodium (NaCl, 10 mM) était utilisé comme point de contrôle du véhicule. Pour les tests de stimulation de la corticostérone, les mêmes procédures ont été suivies, mais le milieu a été complété par de l’ACTH (10 nM), de la forskoline (10 μM) ou du NaCl (10 mM) comme témoin du véhicule. Après 6 heures d’incubation à 37 °C et 5 % de CO₂, les surnatants de la culture ont été collectés et stockés à −80 °C pour une quantification hormonale ultérieure, comme décritprécédemment 31. Les cellules adhérentes restantes ont été lysées pour l’extraction des protéines, et les niveaux hormonaux ont été normalisés à la teneur totale en protéines du lysat correspondant.

Extraction des protéines et normalisation des mesures d’aldostérone et de corticostérone
L’extraction des protéines a été réalisée à l’aide d’un tampon de lyse et d’extraction RIPA, complétés par un cocktail inhibiteur de protéase halt 1x. Les cellules étaient resuspendues en pipettant 15 fois à l’aide d’une pointe de pipette P200, puis sononnées à l’aide d’un sonateur sonde. La concentration en protéines a été déterminée avec le kit de test protéique BCA selon les instructions du fabricant.

Mesure de l’aldostérone par radioimmunotest (RIA)
La concentration d’aldostérone dans les surnatants de culture cellulaire a été déterminée en suivant le protocole du fabricant. En résumé, 50 μL de surnageant et 150 μL de 1 % de BSA dans le PBS, ainsi que 500 μL du traceur radioactif aldostérone, ont été ajoutés aux tubes recouverts d’anticorps aldostérone. Après le mélange, les tubes étaient incubés à température ambiante (25 °C) pendant 18 heures. Ensuite, le mélange d’incubation était décanté, et la radioactivité dans les tubes comptabilisée à l’aide d’un compteur auto-gammaCobra II 31. Les niveaux d’aldostérone ont été normalisés en protéines totales, comme décrit précédemment.

Mesure de la corticostérone
Les concentrations de corticostérone dans les surnatants en culture cellulaire ont été mesurées à l’aide d’un kit d’immunosorbent lié à une enzyme compétitive (ELISA) spécifique à la corticostérone chez souris et rats, suivant le protocole du fabricant. Les niveaux de corticostérone ont été normalisés en protéines totales, comme décrit précédemmentà 32.

Immunocoloration
L’immunofluorescence a été réalisée à la fois sur des sections surrénales plongées en paraffine et sur des cellules cultivées sur des bâtons de verre prétraités recouverts de poly-L-lysine. Pour tous les échantillons, un blocage a été réalisé avec 5 % de sérum de chèvre normal (NGS) dans PBS, et les noyaux ont été contre-colorés avec DAPI (4′, 6-diamidino-2-phénylindole, 1:1000). Les lames et les couvertures ont été lavées trois fois pendant 5 minutes chacune, avec 0,1 % Tween-20 en PBS entre les étapes d’incubation. Après la coloration, les échantillons étaient montés avec du montage antifade et conservés dans l’obscurité jusqu’à l’imagerie. Sections tissulaires : les sections de paraffine surrénalienne ont été déparaffinées dans du xylène, puis rincées à travers une série éthanol graduée (100 %, 95 %, 70 %), et enfin rincées dans le PBS. La récupération d’antigènes a été réalisée dans le tampon Tris-EDTA (10 mM Tris base, 1 mM EDTA, 0,05 % Tween-20, pH 9,0) en chauffant à 95 °C pendant 20 minutes. Après refroidissement à température ambiante, les sections ont été lavées dans du PBS et bloquées avec 5 % de NGS dans le PBS pendant 1 heure. Les sections ont été incubées toute la nuit à 4 °C avec les anticorps primaires suivants dilués à 1:100 dans 5 % de GNS dans PBS : anti-Dab2 de souris, anti-GFP de poulet et anti-RFP de lapin. Les anticorps secondaires suivants ont été utilisés (1:300) : Alexa Fluor 594 anti-souris IgG, Alexa Fluor 594 anti-poulet IgY, et Alexa Fluor 647 anti-lapin de chèvre IgG.

Cellules cultivées : L’immunofluorescence sur les couvertures a été réalisée quatre jours après le plaque. Les cellules ont été fixées avec du paraformoldéhyde (PFA) préchauffé à 4 % à 37 °C pendant 15 minutes et lavées trois fois dans le PBS. Le blocage a été réalisé avec 5 % de NGS dans le PBS pendant 1 h à température ambiante. Les coverslips ont été incubés toute la nuit à 4 °C avec anti-Dab2 pour souris (1:100 en 5 % NGS/PBS), suivis d’Alexa Fluor 488 anti-souris (1:500).

Acquisition d’images : Des images en champ clair et en fluorescence (mGFP et mTomato) de cellules cultivées ont été obtenues à l’aide d’un système de microscope. La fluorescence mGFP a été capturée à l’aide d’un ensemble de filtres pour la fluorescence verte (excitation : 470 nM, émission : 525 nM), et la fluorescence mTomato a été capturée à l’aide d’un ensemble de filtres pour la fluorescence rouge (excitation : 585 nM, émission : 624 nM).

Logiciels et analyse statistique
Des résumés visuels, des schémas et des figures ont été créés à l’aide d’Adobe Illustrator 2023 (Adobe Inc., https://www.adobe.com/products/illustrator.html) et BioRender (https://www.biorender.com), consultés en mai 2025. Les données ont été analysées à l’aide de GraphPad Prism version 10.0. Disponible à : https://www.graphpad.com. Toutes les expériences ont été réalisées au moins en triple exemplaire et répétées indépendamment afin d’assurer la reproductibilité des résultats. Pour les comparaisons entre deux groupes, le test t de Student (apparié ou non, selon le cas) a été utilisé. Pour les comparaisons impliquant trois groupes ou plus, une analyse de variance (ANOVA) suivie du test post hoc approprié a été réalisée afin d’identifier les différences significatives entre les groupes. Les résultats sont présentés en moyenne ± SD. Une valeur p inférieure à 0,05 était considérée comme statistiquement significative.

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Résultats

Établissement et caractérisation de cultures cellulaires surrénales primaires enrichies en zone
Des cultures cellulaires surrénales primaires ont été établies avec succès à partir de l’OF, enrichies pour les cellules zG, et de l’IF, enrichies pour les cellules zF. Des images représentatives des cellules cultivées sont montrées dans la Figure 2A (OF–zG) et la Figure 2B (IF–zF). Pour évaluer l’enrichissement de...

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Discussion

Dans cette étude, un protocole affiné a été présenté pour générer des cultures cellulaires surrénales primaires de souris enrichies pour les cellules zG (OF) et zF (IF), qui reproduisent fidèlement l’identité zonale et la fonction stéroïdogène de chaque zone. Ce protocole devrait permettre une étude approfondie de la biologie cellulaire et moléculaire du cortex surrénalien dans un contexte spécifique à une zone, en soutenant l’étude des protéines, des voies de signalisation et des mécani...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt financier concurrent lié à cette étude.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par FAPESP (Fondation de recherche de São Paulo, Brésil), projet numéro 2024/14165–6 (BEPE – JLK), FAPESP : 2020/02988–7 (C.F.P.L), et soutenu par 2R01DK123694 (à DTB) ainsi que des fonds de la Division d’Endocrinologie de l’Hôpital pour enfants de Boston (DTB).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Tube conique (50 mL )Corning (Corning, NY, USA)352070Stérile
Filtre à seringue de 0,22 µmMilliporeSigma (Burlington, MA, USA)SLGV033RSFiltration de la solution de digestion
Seringue jetable de 10 mLBD Plastipak (Franklin Lakes, NJ, USA)300912Stérile
Pipette sérologique de 5 mLCorning (Corning, NY, USA)4487Stérile
Pipette sérologique de 10 mLCorning (Corning, NY, USA)4488Stérile
Embouts de pipette filtrés (P200)Axygen (Union City, CA, USA)TF-200-R-SStérile
Embouts de pipette filtrés (P1000)Axygen (Union City, CA, USA)TF-1000-R-SStérile
Plat de culture P60Corning (Corning, NY, USA)430166Traité pour la culture de tissus
Plat de 48 puitsCorning (Corning, NY, USA)3527Traité pour la culture de tissus
Papier filtre stérileN/AN/AÉlimination des graisses et support de dissection
Milieu DMEM/F-12Gibco, Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)11320033Formulation 1:1
Sérum bovin foetal (FBS)Gibco, Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)10082147Inactivé par la chaleur
Supplément ITSGibco, Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)41400045100X
Supplément GlutaMAXGibco, Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)35050061100X
Pénicilline-Streptomycine (100X)Gibco, Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)15140122Antibiotique
PBS 1XGibco, Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)10010023pH 7,4
Collagénase de type IGibco, Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)17100-017Digestion des tissus
DNase ISigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)DN25-1Digestion des tissus
Angiotensine II (Ang II)Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)A9525Stimulation hormonale
Hormone adrénocorticotrope (ACTH)Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)A0298Stimulation hormonale
ForskolineSigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)F6886Stimulation de l'AMPc
Chlorure de potassium (KCl)Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)P9541Stimulation de l'aldostérone
Chlorure de sodium (NaCl)Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)S7653Contrôle du véhicule
Petites ciseaux chirurgicauxFine Science Tools (Foster City, CA, USA)14060-09Dissection
Scalpel avec lame jetableFine Science Tools (Foster City, CA, USA)10003-12Microdissection
Pince fineFine Science Tools (Foster City, CA, USA)11252-00Dissection
Pince incurvéeFine Science Tools (Foster City, CA, USA)11251-10Dissection
Hotte à flux laminaireThermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)N/ATraitement des tissus stériles
IncubateurThermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)N/ACulture cellulaire
CentrifugeuseEppendorf (Hamburg, Germany)N/APéletat cellulaire
Chambre de comptage NeubauerHausser Scientific (Horsham, PA, USA)1490Comptage cellulaire
Tampon de lyse et d'extraction RIPAThermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)89901Extraction de protéines
Cocktail d'inhibiteurs de protéase HaltThermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)87786Extraction de protéines
Dismembrateur sonique Fisherbrand Modèle 120Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)FB120Sonication
Système RIATecan (Männedorf, Switzerland)MG13051Quantification des hormones
Compteur automatique Cobra II GammaBerthold Technologies (Bad Wildbad, Germany)N/AMesure de la radioactivité
Kit ELISA pour la corticostérone (96 puits)Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)55-CORMS-E01Mesure des hormones
Montant anti-évanouissement ProLong GoldThermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)P36930Milieu de montage
Anticorps primaire anti-Dab2 de sourisBD Biosciences (San Jose, CA, USA)610464Anticorps primaire
Anticorps primaire anti-GFP de pouletAves Labs (Tigard, OR, USA)GFP-1020Anticorps primaire
Anticorps primaire anti-RFP de lapinRockland Immunochemicals (Limerick, PA, USA)600-401-379Anticorps primaire
Anticorps secondaire Alexa Fluor 594 anti-sourInvitrogen (Carlsbad, CA, USA)A-11005Anticorps secondaire
Anticorps secondaire Alexa Fluor 594 anti-pouletInvitrogen (Carlsbad, CA, USA)A-11042Anticorps secondaire
Anticorps secondaire Alexa Fluor 647 anti-lapinInvitrogen (Carlsbad, CA, USA)A-21244Anticorps secondaire
Anticorps secondaire Alexa Fluor 488 anti-sourThermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)A-11001Anticorps secondaire
Système de microscope EVOSThermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)N/AImagerie
TRI ReagentSigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)T9424Extraction d'ARN
Kit Direct-zol RNAZymo Research (Irvine, CA, USA)R2050Purification d'ARN
NanoDrop ND-1000Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)

Références

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