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Article de méthode

Un nouveau système de culture 2D et 3D sans sérum, comprenant deux petites molécules pour la culture des cellules épithéliales des glandes lacrymales de souris

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DOI :

10.3791/70438

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10 février 2026

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1Department of Ophthalmology Optometry Center, China-Japan Union Hospital of Jilin University, 2Eye Institute & Affiliated Xiamen Eye Center, School of Medicine, Xiamen University, 3Huaxia Eye Hospital of Quanzhou, 4Shen Zhen Research Institute of Xiamen University

Dans cet article

Résumé

Un nouveau système de culture sans sérum utilisant la combinaison de petites molécules 2C (Y27632 et SB431542) est introduit pour étendre efficacement les cellules épithéliales des glandes lacrymales (LGEC) en cultures 2D et 3D, permettant un contrôle précis de leur prolifération et différenciation.

Résumé

La dysfonction des glandes lacrymales (LG) est une cause majeure de la sécheresse oculaire carence en eau, et les thérapies cellulaires et en ingénierie tissulaire montrent un potentiel significatif pour cette affection. Cependant, la disponibilité limitée de suffisamment de cellules de graines cultivées dans des conditions sans sérum a freiné leur application généralisée. Dans cette étude, nous avons développé un nouveau système de culture sans sérum utilisant deux petites molécules, Y27632 et SB431542 (2C), pour étendre efficacement les cellules épithéliales LG (LGEC). Pour la culture primaire 2D des LGEC, les LGEC ont été isolés de souris âgées de 6 à 8 semaines et digérés enzymatiquement à l’aide de Dispase II et de collagénase A. La suspension cellulaire résultante a été ensemencée dans des boîtes de culture à une densité de 7 500 cellules/cm2 et cultivée avec 2C pendant 12 à 14 jours. Lorsque la confluence cellulaire atteignait 80-90 %, la sous-culture était initiée à un ratio de 1:2. Pour la culture 3D, 10 000 LGEC P1 ont été resuspendus dans 10 μL de 2C et 10 μL de gel matricial, puis ensemencés au centre d’une plaque à 24 puits. Après une période de solidification de 30 minutes à 37 °C, 600 μL de 2C ont été ajoutés pour poursuivre la culture. Pour la différenciation, les sphéroïdes 3D ont été cultivés avec 2C pendant 7 jours, suivis d’un retrait de 2C et d’une culture continue pendant 7 jours supplémentaires. Les LGEC cultivés avec 2C ont présenté une forte prolifération, avec une expression élevée de la tige et des marqueurs de prolifération (Ki67, K14, P63, K5, K15 [P = 0,0011, 0,0002, 0,0012, 0,0003, 0,0014 respectivement]), et ont maintenu la morphologie et la capacité proliférative même après dix passages. De plus, en conditions 3D, les LGEC formaient des sphéroïdes avec des caractéristiques tige/progénitrice, qui se différenciaient en structures microglandulaires contenant plusieurs types cellulaires LG (AQP5, K19, α-SMA-positif) et des fonctions sécrétores matures après l’ablation de 2C. Cette approche devrait fournir une source stable de cellules graines pour l’ingénierie tissulaire et propose un nouveau modèle in vitro pour étudier la physiologie des LG.

Introduction

La glande lacrymale (LG) est essentielle à la production de la couche aqueuse du film lacrymal, ce qui est crucial pour maintenir l’homéostasie de la surfaceoculaire 1. Un dysfonctionnement du LG, causé par une blessure ou une inflammation, entraîne une maladie de l’œil sec carence en eau (ADDE). Cette affection peut entraîner une inflammation sévère de la surface oculaire, une maladie cornéenne chronique et, dans les cas graves, une perte de visionpermanente 2. Les traitements actuels pour l’ADDE gèrent principalement les symptômes, sans traiter le dysfonctionnement glandulaire sous-jacent, qui limite leur efficacité àlong terme 1. Le développement de thérapies ciblées pour le dysfonctionnement LG présente plusieurs défis, notamment l’absence de modèles in vitro simples et à long terme, qui limitent la compréhension de la physiopathologie de la LG et entravent le développement de thérapies efficaces. Bien que la transplantation cellulaire ait montré un potentiel pour favoriser la régénération LG, la capacité d’expansion limitée des cellules in vitro et la complexité des systèmes de culture existants présentent des obstacles importants à l’applicationclinique 1,3. Par conséquent, établir un système de culture simple et à long terme pour les LG adultes de souris est essentiel pour faire progresser la compréhension de la physiologie et de la pathologie des LG, ainsi que pour fournir une source fiable de cellules souches/progénitrices LG pour la réparation et la régénération des blessures LG.

Les systèmes de culture in vitro existants pour LG ont fait des progrès significatifs, mais rencontrent encore des limites notables. Beaucoup de ces méthodes reposent sur des milieux complétés en sérum, ce qui introduit plusieurs problèmes tels que la variabilité d’un lot à l’autre, des composants indéfinis, et le risque de contamination par les fibroblastes ou les cellulesmésenchymates 4,5,6,7,8. De plus, les systèmes à base de sérum sont inadaptés à l’étude des mécanismes pathogènes des maladies LG et posent des défis pour les thérapies de transplantation cellulaire en raison des risques potentiels de rejetimmunitaire 9. En réponse à ces limitations, plusieurs méthodes sans sérum ont été développées pour cultiver des cellules épithéliales LG (LGEC) chez des souris et des humains. Par exemple, Ueda et al. ont utilisé avec succès une méthode sans sérum pour cultiver des LGEC à partir de sourisnouveau-nées 10. Cependant, cette méthode était limitée par l’incapacité à faire passer les cellules par les sous-cultures et par la nécessité d’un grand nombre de glandes néonatales pour obtenir suffisamment de LGEC. De même, Kobayashi et al. ont développé un système de culture sans sérum avec la toxine du choléra, mais ont rencontré des difficultés à maintenir la morphologie cellulaire lors du passage11. Parmi les avancées récentes figurent le développement par Zhang et al. d’un système de culture 3D pour les cellules souches LG de souris et le système de culture d’organoïdes LG de Bannier-Hélaouët et al. pour la souris etl’humain 12,13,14,15. Cependant, ces systèmes reposent sur des formulations complexes de milieux contenant plusieurs petites molécules, des facteurs de croissance et des additifs, compliquant le processus de culture et limitant la scalabilité. Ces défis soulignent la nécessité d’un système de culture simplifié et efficace, sans sérum, capable de faciliter l’expansion efficiente des LGEC, tout en conservant leurs caractéristiques prolifératives et de tige/progéniteur pour des applications thérapeutiques et de recherches ultérieures.

Ces dernières années, le développement rapide de la reprogrammation chimique médiée par de petites molécules a introduit de nouvelles stratégies pour maintenir et étendre les cellules adultes primaires invitro 16. En régulant les voies de signalisation intracellulaires, les interactions cellule-matrice et l’adhésion cellulaire, les petites molécules améliorent significativement la prolifération et la plasticité cellulaires, améliorant l’efficacité de l’expansion cellulaire et le contrôle du destin17. En raison de leur production contrôlable, de leur faible immunogénicité et de leur intégration non génomique, les petites molécules sont idéales pour construire des systèmes in vitro permettant à l’expansion des cellules épithélialesadultes 16. Des combinaisons de différentes petites molécules ont démontré qu’elles maintiennent efficacement l’expansion in vitro de divers types cellulaires primaires, y compris les cellules souches épithéliales de la peau, cornéennes etconjonctivales 18,19,20. Par conséquent, développer une stratégie basée sur les petites molécules pour étendre les LGEC montre un potentiel pour de futures applications tant en recherche qu’en milieu thérapeutique.

Un système de culture sans sérum simple et efficace a été développé dans ce protocole en utilisant deux petites molécules, Y27632 et SB431542 (2C), pour soutenir l’expansion des LGEC. En combinant les avantages de ces deux molécules, un système sans sérum a été établi pour les cultures 2D et 3D. Les LGEC cultivés avec 2C ont montré une forte capacité proliférative et des caractéristiques de cellules souches/progénitrices, maintenant la morphologie typique des cellules épithéliales après au moins 10 voiages in vitro. Dans la culture 3D, les LGEC ont non seulement conservé les caractéristiques des cellules souches/progénitrices, mais ont également montré la capacité de se différencier davantage en structures sécrétoires après la suppression du 2C, formant des structures micro-glandulaires à fonction sécrétoire. Ce système sans sérum convient aux modèles in vitro de physiologie et pathologie LG, tout en fournissant une source importante de cellules pour l’ingénierie tissulaire LG et les applications régénératives. Cependant, le protocole actuel ne fournit qu’une exploration préliminaire de la culture 3D. La culture 3D à long terme dépasse actuellement le cadre de cette recherche. Il est important de noter que cette méthode est conçue spécifiquement pour les LGEC adultes de souris et peut ne pas être applicable à d’autres espèces sans optimisation supplémentaire.

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Protocole

Toutes les expériences ont été réalisées conformément aux règlements de l’Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) et du Comité d’éthique des animaux expérimentaux de l’Université du Jilin et de l’Université de Xiamen.

REMARQUE : Toutes les procédures de culture cellulaire ont été réalisées dans une armoire de biosécurité stérilisée aux UV dans la salle d’opération cellulaire.

1. Culture primaire des LGEC

  1. Isolement du tissu LG
    1. Euthanasiez les souris anesthésiées C57BL/6J (âgées de 6 à 8 semaines) par luxation cervicale et désinfectez la région de l’oreille (autour du LG) avec 75 % d’éthanol pour éviter toute contamination.
    2. Effectuez une incision du canthus externe à la peau sous l’oreille pour exposer le LG. À l’aide de pinces et ciseaux lisses stériles, séparez soigneusement le LG du tissu environnant (glandes parotides et tissu conjonctif) sous un microscope de dissection pour obtenir le LG.
    3. Placez le LG dans un milieu de pré-récupération de tissu (DMEM avec 10 % de pénicilline-streptomycine-amphotéricine) dans un tube microcentrifuge de 1,5 mL, en maintenant le tissu sur la glace pour minimiser la dégradation.
  2. Préparation des tissus
    1. Transférez les LG dans un nouveau milieu de prélèvement froid dans un plat de 3,5 cm.
    2. Retirez tout reste de poils de souris, puis retirez la capsule de tissu conjonctif entourant les LG. Isolez le tissu glandulaire en utilisant des pinces lisses pour retirer le tissu conjonctif entre les lobules.
      REMARQUE : Assurez-vous que la capsule à la surface du lobule et le tissu conjonctif entre les lobules soient bien retirés afin d’exposer les conduits entre les lobules, ce qui facilitera la pénétration de la solution digestive lors du processus digestif ultérieur.
    3. Transférez le tissu dans un nouveau milieu de collecte et lavez-le pendant 5 à 10 minutes pour éviter toute contamination.
  3. Digestion enzymatique
    1. Placez les LG dans un tube microcentrifuge de 1,5 mL contenant une solution digestive (milieu sans sérum complété avec 2 mg/mL de Dispase II et 2 mg/mL de collagénase A). (Tableau supplémentaire 1).
      REMARQUE : 1 mL de solution digestive est nécessaire pour 4 LG.
    2. Disséquez finement le tissu LG à l’aide de microciseaux en petits morceaux (environ 0,5-1 mm³) à l’intérieur du tube.
    3. Incubez le tube de la microcentrifuge à 37 °C avec 5 % deCO-2 pendant 2,5 à 3 heures. Toutes les 30 à 60 minutes, mélangez doucement les tissus dans la solution digestive pour assurer une digestion enzymatique approfondie.
  4. Isolement et récolte des LGEC
    1. Secouez le tube de la microcentrifugeuse plusieurs fois après la fin du temps de digestion. Pipettez la solution digestive plusieurs fois pour décomposer le tissu en cellules individuelles ou en petits amas cellulaires. Observez au microscope pour confirmer la progression de la digestion.
      REMARQUE : Lorsque plus aucune particule visible ne reste dans la solution digestive et qu’un grand nombre de cellules individuelles, ainsi que d’agrégats cellulaires en forme de conduit, sont observés au microscope, cela stoppe le processus digestif.
    2. Centrifugez le tube à 300 x g pendant 5 minutes à température ambiante, puis jetez le milieu digestif.
    3. Resuspendez le granule cellulaire dans 1 mL de DPBS stérile et centrifugez à nouveau à 1000 x g pendant 3 minutes à température ambiante pour éliminer les enzymes digestives restantes.
    4. Répétez l’étape 1.4.3, retirez le surnageant, puis resuspendez la pellete cellulaire dans 500 μL de milieu sans sérum.
  5. Ensemencement et culture primaire des LGEC
    1. Préparez le milieu de culture LGECs en complétant un milieu sans sérum avec 1 % de pénicilline-streptomycine et 2C (10 μM Y27632 et 10 μM SB431542). (Tableau supplémentaire 1)
    2. Semez les cellules en plaques de culture standard non traitées de 24 puits à une densité de 7,5 x 10³ cellules/cm² à l’aide d’un milieu 2C sans sérum.
    3. Après l’ensemencement, tapez doucement les bords de la plaque de culture pour assurer une distribution cellulaire uniforme. Placez la plaque dans un incubateur à 37 °C avec 5 % de CO2.
    4. Changez le milieu de culture pour la première fois 72 heures après la semie. Ensuite, changez de médium tous les 2-3 jours.
      REMARQUE : Évitez de perturber la culture pendant les 72 premières heures. Pour le premier changement de milieu, ne lavez pas les cellules avec du DPBS. Il suffit d’enlever l’ancien médium et d’ajouter un substrat frais.

2. Sous-culture des LGEC

REMARQUE : Sous-culture lorsque la confluence cellulaire atteint 80-90 %, ce qui se produit généralement environ 14 jours après la culture primaire.

  1. Retirez le milieu de culture et lavez doucement les cellules deux fois avec du DPBS stérile.
  2. Ajoutez 250 μL de Trypsine-EDTA à 0,25 % et incubez à 37 °C avec 5 % deCO2 pendant 10 à 15 minutes. Une fois que les jonctions serrées se dissocient et que les cellules se rassemblent, ajoutez un volume égal de solution inhibitrice de trypsine définie pour interrompre la digestion.
    REMARQUE : Si des cellules plates et grandes adhérentes sont observées lors de la culture primaire, traiter la culture avec 0,25 % de Trypsine-EDTA pendant 5 minutes afin d’éliminer ces cellules hétérogènes. Ensuite, traiter à nouveau la culture avec 0,25 % de Trypsine-EDTA pendant 5 minutes supplémentaires pour mieux digérer et obtenir une population plus pure de LGEC pour le passage ultérieur.
  3. Mélangez la suspension à cellules en pipettant avec une pipette de 1 mL, puis transférez dans un tube centrifugeuse de 1,5 mL et centrifugez à 1000 x g pendant 3 minutes à température ambiante. Jetez le surnageant.
  4. Lavez les cellules avec un DPBS stérile et centrifugez à nouveau pour collecter les LGEC.
  5. Resuspendez les LGEC dans un milieu de culture 2C et semez à un ratio de 1:2 pour la sous-culture. Mélangez doucement les cellules en secouant la plaque de culture et incubez à 37 °C avec 5 % deCO2.
    REMARQUE : Un sous-culture à un ratio 1:2 signifie que, lorsque la confluence cellulaire atteint 80-90 %, les LGEC sont digérées d’une plaque de puits et réparties uniformément en deux nouvelles plaques de puits.
  6. Changez le substrat le troisième jour après le semis, puis changez le milieu tous les 2-3 jours, selon l’état des cellules.
  7. Observez la morphologie cellulaire quotidiennement sous un microscope à contraste de phase inversé et documentez avec des photographies.

3. Culture tridimensionnelle (3D) des LGEC

REMARQUE : L’expérience de culture 3D utilise des LGEC P1. Lorsque les LGEC P1 atteignent une confluence de 80-90 % après 7 jours de culture avec 2C, ils sont utilisés pour la culture 3D.

  1. Étapes de préparation
    1. Transférez le gel matriciel (Tableau supplémentaire 1) du congélateur à -20 °C vers un réfrigérateur à 4 °C pour le décongélation nocturne.
    2. Placez les embouts de pipette nécessaires dans le congélateur à -20 °C pour assurer un pré-refroidissement correct.
    3. Préchauffez la plaque de culture à 24 puits en la plaçant dans un incubateur à 37 °C, 5 % deCO2 , 2 h avant de commencer la culture 3D.
    4. Préparez une glacière et placez plusieurs tubes de microcentrifuge de 1,5 mL à l’intérieur pour le pré-refroidissement. Stérilisez la glacière dans un meuble de biosécurité avant utilisation.
  2. Culture 3D des LGEC
    1. Obtenez les LGEC P1, comme décrit aux étapes 2.1 à 2.4.
    2. Resuspendez la granule cellulaire dans un milieu de culture 2C, puis ajustez la densité cellulaire à 1 × 10⁴ cellules par 10 μL.
    3. Prenez le gel matriciel décongelé du réfrigérateur à 4 °C et les embouts de pipette pré-refroidis du congélateur à -20 °C, et placez-les dans la glacière à l’intérieur de l’armoire de biosécurité.
    4. Retirez la plaque de culture préchauffée à 24 puits de l’incubateur et placez-la dans l’armoire de biosécurité.
    5. Ajoutez un volume approprié de suspension cellulaire, mélangé à du gel matriciel dans un ratio 1:1, à l’aide de pointes de pipette pré-refroidies. Mélangez doucement pour assurer une répartition uniforme.
    6. Pipette 20 μL du mélange de l’étape 3.2.5 avec précaution au centre de chaque puits de la plaque préchauffée à 24 puits.
    7. Inversez la plaque et incubez-la dans un incubateur à 37 °C, 5 % de CO2 , pendant 30 minutes pour permettre au gel matriciel de se solidifier.
    8. Une fois le gel matriciel solidifié, ajoutez 600 μL de milieu de culture 2C à chaque puits.
    9. Incubez la plaque de culture dans un incubateur à 37 °C, 5 % de CO2 pendant 14 jours. Changez le substrat le troisième jour après le semis et tous les 2-3 jours par la suite, selon l’état de la cellule.
    10. Observez quotidiennement la formation des sphéroïdes 3D sous un microscope à contraste de phase inversé et capturez des images pour la documentation.
  3. Différenciation des sphéroïdes LGEC 3D
    1. Cultivez les sphéroïdes LGEC 3D comme décrit à l’étape 3.2.
    2. Après 7 jours de culture, retirez le milieu de culture 2C et lavez doucement les cellules deux fois avec du DPBS pour éliminer les résidus de 2C. Faites attention à ne pas déranger le gel matriciel.
    3. Ajoutez un milieu sans sérum sans 2C (Null) et continuez la culture pendant 7 jours supplémentaires pour induire la différenciation.
    4. Changez de milieu tous les 2-3 jours pendant la période de culture.
    5. Observez quotidiennement les changements morphologiques des sphéroïdes 3D induits sous un microscope à contraste de phase inversé et capturez des images pour la documentation.

4. Encastrement et coupe congelée de sphéroïdes 3D LGEC différenciés

REMARQUE : La différenciation des sphéroïdes 3D est induite comme décrit à la section 3.3. Après 7 jours de différenciation, suivez les étapes ci-dessous pour un plongement optimal à température de coupe (OCT) et un coupement congelé des sphéroïdes 3D différenciés.

  1. Aspirez le milieu culturel le long des bords du puits. Lavez doucement les sphéroïdes différenciés trois fois avec du DPBS stérile.
  2. Ajoutez 1 mL de paraformaldéhyde à 4 % (PFA) au puits dans une armoire de biosécurité ou une hotte à fumées et fixez les sphéroïdes à température ambiante pendant 10 minutes.
  3. Lavez doucement les sphéroïdes trois fois avec du DPBS stérile, chaque lavage durant 10 minutes, pour retirer le fixateur.
  4. Utilisez une spatule pour gratter soigneusement la structure en forme de dôme en gel 3D sphéroïdien et transférez-la dans un tube microcentrifuge de 5 mL contenant une solution de saccharose à 20 %.
  5. Incubez le tube toute la nuit à 4 °C jusqu’à ce que la structure du dôme se stabilise au fond du tube.
  6. Retirez la structure du dôme de la solution de saccharose, retirez soigneusement tout résidu de saccharose, et intégrez-la dans un composé OCT. Congelez dans de l’azote liquide et conservez à -80 °C.
  7. Avant de colorer, préparez des sections de 10 μm d’épaisseur à l’aide d’un microtome congelant.

5. Détection de la fonction de sécrétion des sphéroïdes 3D LGEC différenciés

  1. Collecte d’échantillons
    1. Induire la différenciation des sphéroïdes 3D comme décrit à la section 3.3.
    2. Après 7 jours de différenciation, retirez le milieu de culture et lavez les sphéroïdes 3D trois fois avec du DPBS.
    3. Ajoutez 500 μL de milieu sans sérum sans 2°C et faites éclore à 37 °C avec 5 % deCO2 pendant 2 heures.
    4. Prélever le milieu de culture et le transférer dans un tube microcentrifuge de 1,5 mL comme échantillon de base pour mesurer la concentration en lactoferrine (LTF) avant la stimulation de la pilocarpine.
    5. Lavez doucement les sphéroïdes 3D trois fois avec un DPBS stérile.
    6. Ajoutez 500 μL de milieu sans sérum contenant 1 μg/mL de pilocarpine et incubez les sphéroïdes 3D à 37 °C avec 5 % deCO2 pendant 24 heures.
    7. Après l’incubation, il faut recueillir le milieu de culture dans un tube microcentrifuge de 1,5 mL (pour mesurer la concentration de LTF après la stimulation pilocarpine).
    8. Centrifugez les échantillons collectés du milieu de culture à 4 °C à 1000 × g pendant 20 minutes. Récupérez le surnageant et stockez-le à -80 °C pour une utilisation ultérieure.
  2. Dilution de l’échantillon
    1. Récupérez les échantillons du congélateur à -80 °C et laissez-les complètement décongeler à température ambiante.
    2. Prendre 5 μL de l’échantillon et le diluer avec 495 μL de tampon de dilution de l’échantillon issu du kit d’immunosorbent lié aux enzymes (ELISA) pour préparer une dilution de 100 fois.
  3. Préparation des réactifs
    1. Apportez tous les réactifs du kit ELISA à température ambiante 20 minutes avant utilisation.
    2. Préparez le tampon de lavage : Calculez la quantité requise en fonction du nombre d’échantillons, puis diluez le tampon de lavage concentré avec de l’eau distillée (1:24).
    3. Préparez la solution de fonctionnement standard :
      1. Centrifugez la norme lyophilisée à 10 000 × g pendant 1 minute. Ajoutez 1 mL de diluant standard de référence et d’échantillonnage, laissez reposer 10 minutes, puis inversez doucement plusieurs fois.
      2. Après qu’il s’est complètement dissous, mélangez soigneusement avec une pipette. Cette reconstitution produit une solution fonctionnelle de 2000 pg/mL.
    4. Effectuer des dilutions en série selon les instructions du kit pour préparer le gradient de concentration standard suivant : 2000, 1000, 500, 250, 125, 62,5, 31,25, 0 pg/mL.
    5. Préparez la solution active par anticorps de détection biotinylée :
      1. Calculez le volume requis pour le test (50 μL/puits). Centrifugez l’anticorps de détection biotinylée concentré à 800 × g pendant 1 minute, puis diluez l’anticorps de détection biotinylée concentré à 50× en une solution de travail 1× à l’aide d’un diluant anticorps de détection biotinylée.
      2. Préparez la solution juste avant utilisation, en produisant un peu plus que la quantité calculée, en ajoutant généralement 100 à 200 μL de plus que nécessaire.
    6. Préparez la solution de travail conjuguée de peroxydase au raifort (HRP) :
      1. Calculez le volume requis pour l’expérience (50 μL/puits). Centrifugez le conjugué concentré HRP à 800 × g pendant 1 minute, puis diluez-le à une concentration de travail 1x en utilisant un diluant conjugué HRP.
      2. Préparez la solution juste avant utilisation, en produisant un peu plus que la quantité calculée, en ajoutant généralement 100 à 200 μL de plus que nécessaire.
  4. Procédure d’analyse ELISA
    1. Déterminez les puits pour l’étalon dilué, le blanc et les échantillons, avec 3 réplications pour chacun. Ajoutez 25 μL de la solution de travail standard, de l’échantillon blanc ou diluée dans les puits correspondants. Couvrez la plaque avec le scellant fourni dans le kit et faites éclore à 37 °C pendant 90 minutes.
      REMARQUE : Les solutions doivent être ajoutées au fond du puits micro ELISA. Évitez autant que possible de toucher la paroi intérieure et de provoquer de la mousse.
    2. Décantez le liquide des puits sans laver. Ajoutez immédiatement 50 μL de la solution active par anticorps de détection biotinylée dans chaque puits. Couvrez la plaque d’un nouveau scellant et faites éclore à 37 °C pendant 60 minutes.
    3. Décantez le liquide des puits et ajoutez 350 μL de tampon de lavage préparé à chaque puits. Faites tremper pendant 1 minute, puis aspirez ou décantez le liquide de chaque puits et séchez avec du papier absorbant propre. Répétez cette étape de lavage 3 fois.
      REMARQUE : Ne laissez pas les puits sécher pendant le lavage.
    4. Ajoutez 50 μL de la solution de travail conjuguée HRP préparée à chaque puits. Couvrez la plaque d’un nouveau scellant et incubez à 37 °C pendant 30 minutes.
    5. Décantez le liquide des puits et répétez le processus de lavage cinq fois avec un tampon de lavage comme décrit à l’étape 5.4.3.
    6. Ajoutez 50 μL de réactif substrat à chaque puits. Couvrez la plaque avec un nouveau scellant et faites éclore à 37 °C dans le noir pendant 15 minutes.
    7. Ajoutez 25 μL de solution d’arrêt à chaque puits pour terminer la réaction. Assurez-vous que la solution d’arrêt est ajoutée dans le même ordre que la solution substrat.
    8. Déterminez immédiatement la densité optique (valeur OD) de chaque puits à 450 nm à l’aide d’un lecteur de microplaques.

6. Isolation de l’ARN

  1. Collecte d’échantillons
    1. Pour le tissu LG
      1. Isoler le tissu LG extraorbitaire de souris adultes comme décrit dans les sections 1.1.2-1.1.2.
      2. Immergez le tissu LG fraîchement isolé dans du PBS pour laver tout sang.
      3. Étalez l’humidité de surface du LG avec du papier filtre et placez le tissu dans un tube microcentrifuge de 1,5 mL contenant 1 mL de réactif d’extraction d’ARN (Tableau supplémentaire 1), maintenant le tube sur la glace.
        REMARQUE : Effectuez des étapes de broyage avant l’extraction de l’ARN afin d’assurer la lyse complète du tissu.
      4. Ajoutez deux billes de meulage en acier propres au tube de la microcentrifuge, puis placez le tube dans un moulin pré-refroidi, haute vitesse et basse température.
      5. Réglez les paramètres du moulin : fréquence 70 Hz, temps de mouture 45 s, temps pause 15 s, et répétez pendant 10 cycles. Serrez la poignée du bouchon du meulin et commencez à moudre.
      6. Placez le tube sur de la glace ou conservez-le à -80 °C pour une extraction d’ARN ultérieure une fois le broyage terminé.
    2. Pour les LGEC
      1. Retirez le milieu de culture et lavez les cellules trois fois avec du DPBS stérile lorsque les LGEC atteignent une confluence de 80-90 %.
      2. Ajoutez 600 μL de réactif d’extraction d’ARN à chaque puits (pour une plaque de 24 puits) et incubez à température ambiante pendant 5 à 10 minutes.
      3. Utilisez une pipette de 1 mL pour faire une pipette répétée de la solution réactive d’extraction d’ARN dans chaque puits afin d’assurer une lyse cellulaire complète.
      4. Transférez la solution dans un tube microcentrifuge de 1,5 mL.
      5. Placez le tube sur de la glace ou conservez-le à -80 °C pour une extraction d’ARN ultérieure.
    3. Pour les sphéroïdes LGEC 3D
      1. Collectez des sphéroïdes 3D LGEC non différenciés et différenciés cultivés pendant 14 jours comme décrit aux étapes 3.2-3.3. Ajoutez 1 mL de solution digestive (milieu sans sérum contenant 1 mg/mL de Dispase II) dans chaque puits, afin d’assurer que la structure gélifique en forme de dôme en forme de matrice sphéroïde 3D soit entièrement couverte. Incuber à 37 °C avec 5 % deCO2 pendant 30 minutes.
      2. Transférez la solution digestive contenant les sphéroïdes 3D dans un tube microcentrifuge de 1,5 mL à l’aide d’une pipette de 1 mL. Centrifugez à 1000 × g pendant 3 minutes pour collecter la pastille sphéroïde.
      3. Lavez la pellete avec 1 mL de DPBS et centrifugez à 1000 × g pendant 3 minutes pour récupérer à nouveau la pellete.
      4. Ajoutez 600 μL de réactif d’extraction d’ARN (par 20 μL de gel matriciel) et incubez à température ambiante pendant 5 à 10 minutes.
      5. Mélangez soigneusement à l’aide d’une pipette de 1 mL pour assurer une lyse complète des sphéroïdes 3D.
      6. Placez le tube sur de la glace ou conservez-le à -80 °C pour une extraction d’ARN ultérieure.
  2. Extraction d’ARN
    REMARQUE : Portez un équipement de protection individuelle approprié (blouse de laboratoire, gants, masque) et effectuez toutes les procédures impliquant le chloroforme et l’isopropanol dans une hotte à fumée. Éliminer les flux de déchets chimiques dans des conteneurs désignés pour déchets dangereux étiquetés pour la production de déchets dangereux, en suivant les protocoles institutionnels d’élimination des déchets.
    1. Ajoutez du chloroforme (volume 1/5 du réactif d’extraction ARN) au tube centrifugeuse contenant l’échantillon d’ARN dans le réactif d’extraction ARN (à partir de l’étape 6.1).
      REMARQUE : Effectuez la procédure dans une hotte à fumée.
    2. Mélangez soigneusement à l’aide d’un vortex et incubez à température ambiante pendant 10 minutes jusqu’à la séparation de phase.
    3. Centrifugez à 14 000 x g pendant 10 minutes à 4 °C.
      REMARQUE : Après centrifugation, le liquide se sépare en trois couches, l’ARN étant dans la phase aqueuse transparente la plus haute.
    4. Préparez un nouveau tube centrifugeuse sans RNase de 1,5 mL et ajoutez de l’isopropanol (moitié du volume du réactif d’extraction ARN) dans une hotte à fumée.
    5. Pipeter la phase aqueuse transparente la plus haute (moitié du volume du réactif d’extraction d’ARN) avec soin dans le nouveau tube sans RNase.
      REMARQUE : Veillez à ne pas contaminer la couche centrale lors du pipetage.
    6. Inversez le tube plusieurs fois pour mélanger et incubez à température ambiante pendant 10 minutes. Ensuite, centrifugez à nouveau à 14 000 x g pendant 10 minutes à 4 °C.
    7. Éliminez le surnageant et ajoutez 500 μL d’éthanol à 75 % pour laver la pastille en inversant le tube. Centrifugeuse à nouveau à 14 000 x g pendant 5 minutes à 4 °C.
    8. Répétez l’étape 6.2.7. Jetez le surnageant et effectuez une centrifugation rapide pour éliminer tout liquide résiduel.
    9. Placez le tube sur de la glace dans la hotte à fumée, ouvrez le couvercle, puis laissez sécher à l’air libre pendant 10 à 20 minutes jusqu’à ce que la granule blanche devienne semi-transparente.
    10. Ajoutez 20 μL d’eau sans RNase pour dissoudre le pellet. Mesurez la concentration et la pureté de l’ARN à l’aide d’un spectrophotomètre.
      REMARQUE : Si la concentration d’ARN est trop élevée, diluez avec une quantité appropriée d’eau sans RNase.
    11. Placer la solution d’ARN sur de la glace ou la stocker à -80 °C pour le processus de transcription inverse qui suit.

7. RT-PCR quantitative (qRT-PCR)

  1. Transcription inversée
    1. Ajoutez les composants suivants en séquence au tube de réaction PCR selon les instructions du fabricant : 800 ng d’ARN total (calculez le volume en fonction de sa concentration), 4 μL de SuperMix 5x All-in-One pour la q-PCR, 1 μL de détacheur d’ADNG, et de l’eau sans RNase pour porter le volume total à 20 μL.
    2. Mélangez délicatement les composants. Réglez la machine PCR aux conditions suivantes : 55 °C pendant 6 minutes, 80 °C pendant 1 minute, puis 12 °C indéfiniment.
    3. Stockez l’ADNc à -20 °C ou conservez-le au frais pour le processus qRT-PCR après la réaction de transcription inverse.
  2. qRT-PCR
    1. Préparez la solution de pré-mélange qRT-PCR pour cibler différents gènes comme suit : 5 μL de 2x Green qPCR SuperMix, 0,2 μL d’amorçage direct (10 μM), 0,2 μL d’amorçage inversé (10 μM) et 3,6 μL d’eau sans nucléase. Mélangez doucement et placez-le sur de la glace.
    2. Ajoutez 9 μL du prémélange qRT-PCR (préparé à l’étape 7.2.1) et 1 μL d’ADNc (préparé à l’étape 7.1) dans les tubes qRT-PCR selon le plan expérimental.
    3. Centrifugez les tubes à 1000 × g à température ambiante pendant 2 minutes.
    4. Placez les tubes dans la machine de PCR quantitative à fluorescence pour détection.
      REMARQUE : Utilisez une méthode en trois étapes avec le programme suivant selon les instructions du fabricant du réactif : 94 °C pendant 30 s, 94 °C pendant 5 s, 60 °C pendant 15 s, et 72 °C pendant 10 s. Commencez à faire des cycles à partir de l’étape 2 pendant 40 à 45 cycles.
    5. Effectuer une analyse quantitative en utilisant la méthode comparative CT (2-ΔΔCt).
      REMARQUE : Chaque jeu de données doit être répété au moins trois fois indépendamment afin d’assurer la fiabilité des résultats.

8. Coloration par immunofluorescence

REMARQUE : La coloration par immunofluorescence est réalisée sur des LGEC cultivés dans des plaques à 24 puits avec des taux de confluence de 70 à 80 % ou sur des sections gelées de structures 3D différenciées de LGECs.

  1. Pour les LGEC
    1. Retirez le milieu de culture des puits et lavez les cellules trois fois avec du PBS.
    2. Ajoutez 500 μL de PFA à 4 % dans chaque puits dans une armoire de biosécurité ou une hotte à fumées et faites couver à température ambiante pendant 15 minutes pour fixer les cellules.
    3. Lavez les cellules trois fois avec du PBS, chaque lavage durant 5 minutes.
    4. Ajoutez 500 μL de 0,2 % de Triton X-100 pour recouvrir les cellules et incubez à température ambiante pendant 20 minutes pour perméabiliser la membrane cellulaire.
    5. Lavez les cellules trois fois avec du PBS, chaque lavage durant 10 minutes.
    6. Retirez le PBS et utilisez un marqueur immunohistochimique pour tracer un cercle autour de chaque puits de la plaque à 24 puits. Ajoutez 50 μL de 2 % de BSA à chaque puits pour recouvrir les cellules. Incubez à température ambiante pendant 1 h pour le blocage.
    7. Retirez le BSA et ajoutez 50 μL de l’anticorps primaire dilué (Tableau supplémentaire 1) pour couvrir les LGEC. Incubez à 4 °C pendant 16 à 18 heures.
    8. Retirez l’anticorps primaire et répétez l’étape 8.1.5.
    9. Ajoutez 50 μL d’anticorps secondaire fluorescent à chaque puits pour couvrir les LGEC. Incubez à température ambiante dans le noir pendant 1 heure.
    10. Répétez l’étape 8.1.5, en évitant l’exposition à la lumière.
    11. Ajoutez 50 μL de solution 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) pour recouvrir les LGEC et observez la coloration au microscope à fluorescence.
  2. Pour les sphéroïdes LGEC 3D
    1. Préparez les sections sphéroïdes 3D LGEC comme décrit à l’étape 4. Effectuez la coloration par immunofluorescence comme indiqué aux étapes 8.1.2-8.1.11.

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Résultats

Établir un système de culture LGECs sans sérum en utilisant 2C
Dans ce protocole, l’objectif était d’établir un système de culture plus simple et plus efficace pour étendre les LGEC primaires de souris. Après un dépistage approfondi, une combinaison 2C sans sérum, composée uniquement de Y27632 et SB431542, a été développée avec succès, permettant une expansion in vitro à long terme des LGEC. Après une digestion enzymatique mixte, les LGEC primaires ont commen...

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Discussion

Comme décrit dans l’introduction, plusieurs systèmes de culture sans sérum pour les cellules LG ont été développés ces dernièresannées 10, 11, 12, 13. Cependant, beaucoup de ces méthodes présentent des limites, notamment une faible prolifération cellulaire et l’incapacité d’obtenir une expansion à grande échelle in vitro10,11

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Déclarations de divulgation

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (82471048, 82271045) ; le programme de science et technologie de Shenzhen (JCYJ20240813145510014) ; le projet spécial Health Research Talents de la province du Jilin (2023SCZ63, 2024SCZ53, 2025SCZ65) ; et le projet de plan de développement scientifique et technologique (YDZJ202601ZYTS389) de la province du Jilin.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
  ;-20° ; C Réfrigérateur ultra-basse températureHaier
  ;-80° ; C Réfrigérateur ultra-basse températureHaier
0,25 % de trypsine-EDTAGibco25200056
1,5 mL de tube microcentrifugeuse   ;KirgenKG2211Sans Rnase
Antenne de culture cellulaire de 35 mmLABSELECT12111
4 & deg ; C RéfrigérateurHaier
4 % de paraformoldéhyde (PFA)ServicebioG1101
4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI)Yeasen708939ES03Conserver à -20 & degrés C, crosse à 1 mg/mL, 500x, diluer à 1x avec 1x PBS
Tube centrifugeuse de 5 mL   ;ACMECAC17457
Tube centrifugeuse de 50 mL & nbsp ;LABSELECTCT-002-50-SS
Anticorps anti-alpha musculaire lisse actine du lapinAbcamab5694Diluer avec le tampon de dilution d’anticorps à 1:100  ;
Anticorps anti-AQP5 du lapin  ; ABclonalA9927Diluer avec le tampon de dilution d’anticorps à 1:100  ;
Anticorps anti-cytokératine 14 du lapinAbcamab181595Diluer avec le tampon de dilution des anticorps à 1:200  ;
Anti-Cytokératine 19  ; Anticorps de lapinAbcamAB52625Diluer avec le tampon de dilution d’anticorps à 1:400  ;
Anticorps anti-Ki67 contre le lapinAbcamab16667Diluer avec le tampon de dilution des anticorps à 1:200  ;
Armoire de biosécuritéSterilGARD
Albumine sérique bovine (BSA) & nbsp ;Yeasen36101ES60Magasinez à 4° ; C
Souris C57BL/6JCentre des animaux de laboratoire de l’Université de Xiamen
Plaque de culture cellulaireLABSELECT1131224-puits
Incubateur cellulaireEppendorf
CentrifugeuseEppendorf
ChloroformeHUSHI10006818ATTENTION, opérations dans une hotte à fumée
CO2  ; Incubateur à température constanteEppendorf
Collagénase ARoche10103586001Conserver à -20 & degrés C, stock à 200 mg/mL, 100x
Solution définie d’inhibiteur de trypsine (DTI)GibcoR007100
DermaLife K Kératinocyte Medium Complet (Medium sans sérum) & nbsp ;Life LineLL-0007Magasiner à 4 °Deg ; C
D-HanksBiosharpBL559A  ;Utilisé pour diluer la Dispase II
Diméthylsulfoxyde (DMSO)SigmaD4540Utilisé pour diluer Y27632 et SB431542
Dispase IISigmaD4693Conserver à -20 & degrés C, stock à 200 mg/mL, 100x
DMEM de base (1X)GibcoC11995500BT
Anti-Rabbit IgG (H+L) Anticorps secondaire fortement adsorbé croisé, Alexa Fluor 488InvitrogenA-21206Diluez avec le tampon de dilution d’anticorps à 1:300
Solution tampon phosphate de Dulbecco (DPBS)ServicebioG4200
Absolu de l’éthanolHUSHI10009218PRÉCAUTION, À utiliser pour préparer d’autres dilutions d’éthanol & nbsp ;
Microtome de congélationLeica
Moulin à basse température à haute vitesseServicebio
Microscope à fluorescence inverséeLeica
Microscope inverséOlympe
Isopropanol  ;HUSHI80109270
Microscope confocal à balayage laser FV3000OLYMPUS
Centrifugeuse basse température et haute vitesseEppendorf
Kit de test immunosorbent lié à l’enzyme LTF (ELISA) & nbsp ;ElabscienceE-MSEL-M0047Conserver à -20 & degrés C
Gel matriciel (Matrigel)82703MogengelAliquot et stockez à -20 degrés ; C
MicropipettorEppendorf
Lecteur de microplaquesThermo Fisher Scientific
Eau sans nucléaseBiosharpBL510B
Composé OCTScigen4586
PBS,1 & horaires ; (pH7.4)ServicebioG4202
Amplificateur PCRBIO-RAD
Pénicilline-StreptomycineBiosharpBL505A
Pénicilline-Streptomycine-AmphotéricineBiosharpBL142A
Kit PerfectStart Green qPCR SuperMixTransGen BiotechAQ601-01-V2Conserver à -20 & degrés C
PerfectStart Uni RT& Kit qPCRTransGen BiotechAUQ-01Conserver à -20 & degrés C
Pilocarpine  ;AladdinP424663Conserver à -20 & degrés C, 2500x
Amorce AQP5 & nbsp ; séquence :
Avant : CATGAACCCAGCCCGATC
TT
Retour : CTTCTGCTCCCATCCCAT
CC		Sangon Biotech
Amorce K14  ; séquence :
Avant : CCCACCTTTCATCTTCC
CAATT
Retour : AAGCCTGAGCAGGTAGCAG		Sangon Biotech
Amorce K15 & nbsp ; séquence :
Avant : GAGGTGGCGTCTAACACA
GA
Retour : TCTGAGCCTCCATCTCAC
AG		Sangon Biotech
Amorce K19  ; séquence :
Avant : ATTACTGCCCTGAGGAGC
CA
Retour : TTCAGCTCCTCAATCCGA
GC		Sangon Biotech
Amorce K5 & nbsp ; séquence :
Avant : CTCAGAGCTGAGGAACAT
GC
Retour : AGCTCCGCATCAAAGAAC
AT		Sangon Biotech
Primer Ki67  ; séquence :
Avant : ACCATCATTGACCGCTCC
TT
Retour : TTGACCTTCCCCATCAGG
GT		Sangon Biotech
Primer LTF  ; séquence :
Avant : CAGGAGCCAACAAATGTG
CC
Retour : TTGTACTGGTCCCTTTCG
GC		Sangon Biotech
Amorce P63 & nbsp ; séquence :
Avant : ATGTCACCGAGGTTGTG
AAA
Retour : GAATTCAGTGCCAACCTGTG		Sangon Biotech
Amorce SOX10 & nbsp ; séquence :
Avant : ATCAGCCACGAGGTAATG
TCCAAC
Retour : ACTGCCCAGCCCGTAGCC		Sangon Biotech
Primer &alpha ;-SMA  ; séquence :
Avant : CTCCCTGGAGAAGAGCTA
CG
Retour : CGCTGACTCCATCCCAAT
GA		Sangon Biotech
Instrument de PCR quantitative à fluorescence en temps réelRoche
Réactif d’extraction totale d’ARN isolateur d’ARNVazymeR401-01ATTENTION, opérations dans une hotte à fumée
SB431542  ;ApexbioA8249Conserver à -20 & degrés C, d’origine à 20 mM, 2000x
Spectrophotomètre NanoDrop 1000Thermo Fisher ScientificMesurer la concentration d’ARN
SaccharoseMacklinS818046Dissous avec de l’eau distillée
Triton X-100SolarbioT8200
Système de purification de l’eau ultra pureMillipore
Tampon universel de dilution d’anticorpsÉpizymePS119Magasiner à 4 °Deg ; C
Y27632  ;ApexbioB1293Conserver à -20 & degrés C, d’origine à 20 mM, 2000x

Références

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