Visualisation et analyse quantitative de l’activation de PARP1/PARP2 induite par la génotoxine dans les cellules à l’aide d’un rapporteur à base de protéines de fusion fluorescentes

Résumé

Nous décrivons ici une méthode de visualisation cellulaire, de localisation subcellulaire et d’analyse quantitative des foyers enrichis en poly(ADP-ribose) (PAR) dans des cellules de mammifères fixes. Ce test permet de quantifier les sites d’activation de PARP induite par des dommages à l’ADN, y compris ceux associés à la réparation par excision de bases ou à la réparation de rupture simple brin, dans les noyaux des cellules exposées à la génotoxine.

Résumé

Le poly(ADP-ribose) (PAR) est un polymère d’ADP-ribose synthétisé par quatre membres de la famille d’enzymes ADP-ribose-polymérases — PARP1, PARP2, PARP5a et PARP5b. Cependant, seuls PARP1 et PARP2 synthétisent la PAR en réponse aux ruptures d’ADN. La PAR est définie comme une modification post-traductionnelle de la protéine, mais il est également démontré qu’elle existe sous forme de modification de l’ADN ou de l’ARN. Les niveaux de PAR sont également régulés par le PARG, une glycohydrolase de PAR qui, avec PARP1 et PARP2, module le niveau cellulaire de PAR induit par des dommages à l’ADN. La synthèse dynamique et la dégradation de la PAR sont essentielles à son rôle régulateur dans la réparation de l’ADN et à la réponse aux dommages de l’ADN, qui à leur tour affectent la réorganisation, la réplication, la transcription et la mort cellulaire. L’activation de PARP1/PARP2 et l’accumulation de PAR peuvent être considérées comme des sites de réparation continue par excision de la base ou de réparation de rupture simple brin de l’ADN ; cependant, de nombreux activateurs de PARP1/PARP2 sont également associés au stress de réplication et à d’autres processus métaboliques de l’ADN. Une fois formées, les chaînes PAR facilitent le recrutement de facteurs de réparation de l’ADN et de réponse aux dommages à l’ADN (DDR) vers les sites de dommages à l’ADN ou d’insulte génomique via leurs domaines de liaison PAR (PBD). Dix PBD différents reconnaissent diverses régions de la molécule de PAR, notamment le motif de liaison à la PAR, le doigt de zinc liant à la PAR, le domaine WWE et le macrodomaine, entre autres PBD. Pour faciliter l’analyse cellulaire de la dynamique de la PAR, nous avons utilisé des PBD fusionnés à une protéine fluorescente verte améliorée (EGFP) afin d’optimiser la quantification cellulaire des foyers de PAR. Nous décrivons un test utilisant un fragment de RNF146 codant pour le domaine PBD/WWE, lié à EGFP, afin de visualiser et quantifier l’accumulation de PAR aux sites d’insulte génomique et de BER ou SSBR en cours. Nous décrivons des étapes expérimentales, incluant la production de particules lentivirales, la transduction de la lignée cellulaire cible, le traitement des cellules de mammifères pour induire des dommages génomiques à l’ADN, l’acquisition de micrographies à fluorescence confocale et la quantification semi-automatisée des données.

Introduction

Ce protocole décrit le test LivePAR, qui permet la visualisation et l’analyse quantitative du poly(ADP-ribose) (PAR) sur les sites d’insulte génomique, principalement associés à la réparation par excision de base (BER) ou à la réparation par rupture simple brin (SSBR), dans les cellules de ^{mammifères 1,2,3}. Le BER est une voie de réparation cruciale de l’ADN qui élimine les bases endommagées ou modifiées de l’ADN (pour des revues sur le BER et la PARylation, voir 4,5,6,7). La BER commence par des ADN glycosylases qui reconnaissent et excisent les bases^{modifiées 4}, laissant un site apurinique/apyrimidinique (AP), par exemple la glycosylase de la méthyle purine (MPG), qui excise les bases^{méthylées 8,9}, ou la 8-oxoguanine glycosylase (OGG1), qui excise l'8-oxo-oxoG ^9,10. Les sites AP sont ensuite clivés par l’endonucléase AP 1 (APE1)11,12,13, créant une entaille dans la colonne vertébrale de l’ADN. Une polymérase, à savoir ADN polymérase β (Polβ)^14,15, ajuste et comble le vide en utilisant le brin intact comme modèle, et enfin, les ligases ADN scellent le brin^{réparé 16,17}, par exemple la ligase d’ADN I ou la ligase III de l’ADN.

Les acteurs clés du BER et du SSBR sont les poly(ADP-ribose) polypolymérases 1 et 2 (PARP1/PARP2)^18,19,20, des enzymes qui détectent rapidement les ruptures de brins d’ADN lors du BER ou du SSBR. En détectant ces ruptures, PARP1/PARP2 catalyse l’ajout de polymères ADP-ribose, à lui-même et à d’autres protéines — un processus appelé PARylation (pour la revue,^{voir 6}) — en hydrolysant ^NAD+. Cela crée un échafaudage protéique dynamique (PAR) qui recrute d’autres facteurs de réparation de l’ADN vers le site de dommage, améliorant ainsi la fidélité de la réparation de l’ADN. Pour gérer cet échafaudage dynamique de PAR, plusieurs protéines contribuent à l’hydrolyse et à l’élimination des chaînes de PAR, notamment l’hydrolase acceptrice d’ADP-ribose 3 (ARH3), l’hydrolase glycosyle terminale ADP-ribose 1 (TARG1), la mono-ADP-ribosyl hydrolase 1/2 (MacroD1/2) et la poly(ADP-ribose) glycohydrolase (PARG⁾ 6,21,22,23,24,25,26 . Cependant, le PARG est principalement responsable de ce^{processus 21,27} et joue un rôle crucial dans la réponse aux dommages à l’ADN (DDR^)28,29.

PARG est donc critiquement liée à la fonction de PARP1 et PARP2. Alors que PARP1 et PARP2 créent les polymères PAR, PARG agit comme une enzyme de « nettoyage », hydrolysant ces polymères et inversant effectivement la PARylation^30,31. Ce processus est essentiel pour compléter à la fois le BER et le SSBR et pour permettre le recyclage de PARP1/PARP2 afin de répondre à de nouveaux dommages à l’ADN. Par conséquent, PARP1, PARP2, PARylation et PARG fonctionnent de manière coordonnée, garantissant une réparation efficace et réversible de l’ADN grâce à BER et SSBR ^4,6.

L’étendue de la PARylation peut être influencée par divers facteurs et joue un rôle essentiel dans la réponse globale aux dommages de^{l’ADN 32}. Ces facteurs incluent l’exposition à des génotoxines qui ajoutent des adducts aux bases de l’ADN, telles que le N-méthyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine (MNNG), le méthylméthanassulfonate (MMS), le peroxyde d’hydrogène (_H2O2) ou l’hydroperoxyde de tert-butyle (tBuOOH). De plus, l’étendue de la PARylation peut être influencée par des molécules qui modulent le processus de PARylation, telles que le riboside de dihydronicotinamide (NRH), un précurseur de NAD⁺, qui améliore l’activation de PARP en augmentant les niveaux de NAD⁺, ou FK866, un inhibiteur de NAMPT, qui peut diminuer les niveaux de ^NAD+ et réguler négativement l’activation de^{PARP 3}. Enfin, des mutations génétiques ou l’inhibition par de petites molécules d’enzymes telles que PARP1/PARP2, PARG ou d’autres protéines de réparation de l’ADN (par exemple, des défauts dans le BER ou des facteurs de recombinaison homologues tels que BRCA1/BRCA2) peuvent modifier l’activation^{de PARP} 33,34,35,36.

Le test LivePAR utilise un fragment de la protéine annulaire 146 (RNF146) qui code pour un domaine WWE (acides aminés 100–182), lié à une protéine à fluorescence verte améliorée (EGFP⁾³. Le domaine WWE est un domaine globulaire nommé d’après les résidus conservés tryptophane (W) et glutamate (E) dans son site^{de liaison 37}. Les domaines WWE se lient à l’iso-ADP-ribose, la plus petite unité structurelle interne au sein des chaînes^{PAR 38,39}. RNF146 est une ligase d’ubiquitine E3 qui reconnaît l’iso-ADP-ribose ^38,40 et qui cible les protéines impliquées dans le BER (XRCC1, ligase d’ADN III et PARP1) pour la dégradation^{protéosomale 41}. Relier ce domaine WWE à EGFP permet de visualiser et de détecter les sites de parylation induits par la génotoxine dans les cellules de mammifères. Dans ce protocole, nous décrivons la génération de lignées cellulaires stables exprimant le rapporteur LivePAR (Figure 1A), l’induction de dommages à l’ADN pour activer PARP1/PARP2, la production de PAR, ainsi que l’acquisition et l’analyse des données de microscopie à fluorescence confocale (Figure 1).

Le plasmide pMD2.g(VSVG) fournit la glycoprotéine de l’enveloppe virale (VSVG), qui élargit la gamme cellulaire que le virus peut infecter par rapport à la protéine d’enveloppe lentivirale native. Le plasmide pRSV-REV fournit la protéine de l’élément régulateur (REV), un transactivateur crucial qui se lie à l’ARN viral et active la transcription des gènes viraux ; Il est essentiel pour une réplication virale efficace. Le plasmide pMDLg/pRRE fournit plusieurs composants clés de l’emballage interne, à savoir gag, qui code la matrice (MA), la capside (CA) et les protéines nucléocapsides (NC), pol, qui code les enzymes nécessaires à la réplication virale et à l’intégration dans le génome de la cellule hôte, et l’élément régulateur de l’ARN (RRE), un élément d’ARN qui améliore l’efficacité de la traduction de l’ARN viral et de l’emballage de l’ARN génomique. Le plasmide pLV-EF1A-LivePAR-Hygro (Figure 1A) contient de l’ADNc codant pour la protéine de fluorescence verte améliorée (EGFP) qui est fusionnée à l’extrémité C du domaine WWE de RNF146 (acides aminés 100–182), un domaine protéique qui se lie aux chaînes poly(ADP-ribose), et le vecteur code également pour une cassette de résistance à l’hygromycine. Le virus est isolé du surnageant de la culture cellulaire et peut être stocké à -80 °C ou utilisé immédiatement pour la transduction (Figure 1B).

Protocole

1. Production de lentivirus

REMARQUE : Ce protocole utilise un système d’emballage lentiviral de troisième^{génération 42,43} pour générer des cellules exprimant un signaleur PAR génétiquement codé. Les particules lentivirales sont produites dans des cellules 293FT à l’aide d’un système à quatre plasmides comprenant enveloppe, régulateurs et composants d’emballage, ainsi que la construction pLV-EF1A-LivePAR-Hygro codant un domaine WWE marqué EGFP de RNF146, qui lie les chaînes poly(ADP-ribose). Le virus résultant est utilisé pour générer des lignées cellulaires stables afin de visualiser et quantifier l’accumulation de PAR.

1. Culture de cellules à faible passage de 293FT dans DMEM contenant 10 % de FBS et 1 % de Pen/Streptocoque dans une atmosphère humidifiée à 37 °C et 5 % de CO₂. Assurez-vous que les cellules 293FT n’ont pas été cultivées plus de 3 semaines.
   REMARQUE : Nous utilisons régulièrement des cellules de 293 pieds avec des numéros de passage allant de 3 à 10. Les cellules 293FT ont été transformées et immortalisées par le gros antigène T SV40. Ces cellules possèdent une grande efficacité de transfection, essentielle pour la production de protéines recombinantes et les études d’expression génique. Ils réagissent bien à la fois aux méthodes de transfection à base de lipides et de transduction virale.
2. Plaque 1,7 × 10⁵ cellules de 293 FT sur une plaque de culture tissulaire de 60 mm dans un volume final de 5,5 mL de milieu de culture le jour 1. Retournez les cellules à l’incubateur pendant 24 heures.
3. Le deuxième jour (le jour de la transfection), ajoutez 375 μL de milieu DMEM sans FBS ni sans plume/streptococcoque dans un tube de microcentrifugation stérile de 1,5 mL. Ensuite, ajoutez 10 μL d’un réactif de transfection à base de lipides, 4 μg du plasmide pLV-EF1A-LivePAR-Hygro, 2 μg du plasmide pMD2.g(VSVG), 2 μg du plasmide pRSV-REV et 2 μg du plasmide pMDLg/pRRE. Tapotez doucement le tube de microcentrifugation pour mélanger le milieu, le réactif de transfection et l’ADN plasmidique (évitez le vortex). Incuber pendant 15 à 30 minutes à température ambiante pour permettre la formation d’un complexe ADN/réactif de transfection.
4. Ajoutez le mélange plasmide/réactif de transfection dans la boîte de 60 mm contenant les cellules de 293 pieds à transfecter sans retirer le milieu, goutte à goutte. Retournez les cellules à l’incubateur pendant 48 heures.
   REMARQUE : Cette période permet la production et la libération des particules lentivirales dans le milieu de croissance.
5. Le quatrième jour, il faut prélever le milieu de culture des cellules transfectées de 293FT pour isoler les particules de lentivirus. Filtrez à travers un filtre stérile de 0,45 μm pour séparer les débris cellulaires des particules lentivirales.
6. Déterminez le titre du lentivirus avec les réactifs disponibles (optionnel).
   REMARQUE : Cette méthode donne généralement 10⁵ à^{10 6} unités infectieuses par mL (IFU/mL), ce qui correspond à une multiplicité approximative d’infections (MOI) de ~5 lorsqu’elle est utilisée comme indiqué dans l’étape de transduction ci-dessous.
7. Aliquote, le milieu contenant les particules de lentivirus est transformé en quatre cryovials stériles (1,0 mL par tube) et stockés à -80 °C.

2. Transduction

REMARQUE : Cette section décrit le protocole de transduction lentivirale utilisé pour introduire un transgène dans les lignées cellulaires (Figure 1B). Il a été constamment efficace dans notre laboratoire^{1, 3, 33, 37, 44, 45}.

1. Cultivez une lignée cellulaire de choix (faible nombre de passages) dans le milieu approprié dans une atmosphère humidifiée à 37 °C et 5 % de_CO2.
   REMARQUE : Commencez par un passage précoce du type cellulaire nécessaire. Un nouveau flacon de cellules doit être décongelé et passé au moins une fois avant de semer pour la transduction.
2. Le premier jour, semez 1 × 10⁵–1,5 × 10⁵ cellules par puits, sur chaque puits d’une plaque de 6 puits dans 2 mL de milieu de croissance. Retournez les cellules dans l’incubateur pendant 24 heures.
3. Au deuxième jour (le jour de la transduction), assurez-vous que les cellules sont entre 20 % et 40 % de confluent. Ajoutez 1 mL de virus, 1 mL de milieux de croissance et 2 μL de polybrene (2 mg/mL de bouillon) dans un tube conique de 15 mL et mélangez doucement par inversion (évitez le vortex).
   REMARQUE : La polybrene est utilisée lors de la transduction du lentivirus pour prévenir la répulsion électrostatique entre les particules virales et la membrane cellulaire. Comme la polybrène est chargée positivement, elle interagit avec les glycoprotéines virales chargées négativement, neutralisant ainsi leur charge. De plus, le polybrene se lie aux glycosaminoglycanes dans le milieu de culture cellulaire, empêchant ainsi leur interaction avec le virus. Polybrene améliore donc considérablement l’efficacité de la transduction.
4. Retirez le milieu de croissance de la plaque à 6 puits et ajoutez le mélange virus/milieu/polybrene à chaque puits. Placez les cellules avec le mélange de transduction dans un incubateur contenant une atmosphère humidifiée à 32 ^°C et 5 % de_CO2 pendant 16 à 18 heures.
   REMARQUE : Incuber des cellules à 32 °C pendant la nuit lors de la transduction lentivirale est une pratique courante, bien que non essentielle, qui augmente significativement l’efficacité de l’infection virale. Abaisser la température ralentit le métabolisme cellulaire, réduisant ainsi les défenses cellulaires et augmentant la susceptibilité aux infections virales.
5. Au troisième jour, remplacer le milieu des cellules transmises par le virus par un nouveau substrat et les transférer dans un incubateur à 37 °C. Incubez pendant 48 heures.
   REMARQUE : Ces 2 jours suffisent pour que les cellules produisent le transgène RNF146(100–182)-EGFP et deviennent résistantes à l’hygromycine.
6. Pour développer les lignées cellulaires polyclonales stables exprimant le transgène RNF146(100–182)-EGFP, commencez ensuite la sélection de l’hygromycine après 2 jours d’incubation comme indiqué à l’étape 2.5.
   1. Alternativement, élargir cette population de cellules transduites en l’absence d’hygromycine et l’utiliser pour l’analyse PAR au cours des 10 à 14 jours suivants (transduction transitoire), comme décrit^{précédemment 1}.
7. Transférez les cellules sur une plaque de 100 mm une fois qu’elles ont grandi en présence d’hygromycine et divorez autant que nécessaire.
8. Préparez des stocks cryo des cellules transduites pour une utilisation future.
9. Valider l’expression du transgène RNF146(100–182)-EGFP par microscopie confocale comme décrit à la section 3. Le transgène RNF146(100–182)-EGFP sera exprimé dans toute la cellule.
10. Valider l’expression du transgène RNF146(100–182)-EGFP par immunoblotting, comme décrit ailleurs ^1,37.

3. Microscopie confocale et analyse

REMARQUE : Cette section du protocole détaille la préparation des couches de couverture, l’ensemencement des cellules exprimant le LivePAR, l’exposition aux traitements (tBuOOH, MNNG, PARGi, PARPi et/ou NRH), ainsi que la préparation des cellules fixes sur lames de microscope pour l’imagerie confocale et l’analyse des foyers PAR (Figure 1C). Il décrit également l’utilisation du logiciel ImageJ et d’une macro personnalisée pour la quantification semi-automatisée des foyers PAR. Ce protocole peut être utilisé pour étudier l’influence de divers facteurs (par exemple, petites molécules, knockouts de protéines BER) sur la PARylation dépendante des dommages à l’ADN et a été utilisé avec succès dans notre laboratoire^34,37.

1. Préparation du couvre-slip
   1. Faites tremper 20 × bâtons de 20 mm pendant 20 minutes dans de l’éther diéthylique dans un récipient en verre dans une hotte à fumée.
      REMARQUE : Utilisez une hotte à vapeur lorsque vous travaillez avec de l’éther diéthylique en raison de son inflammabilité et de ses risques potentiels.
   2. Retirez l’éther diéthylique et lavez les couvertures en concentrations décroissantes d’éthanol [100 %, 70 %, 50 %, puis 0 % (ddH₂O)].
   3. Retirez l’eau et faites tremper les manteaux pendant 20 minutes dans un 1N HCl avec une légère agitation.
   4. Retirez le HCl et lavez les hobbies 3 fois avec_{ddH 2}0.
   5. Conservez les couvertures dans 70 % d’éthanol à 4 °C jusqu’à utilisation.
2. Placage des cellules
   1. Placez deux bâtons stériles de 20 × 20 mm dans une boîte de culture cellulaire de 60 mm côte à côte. Préparez autant de plats que nécessaire pour l’expérience. Assurez-vous que tout l’éthanol s’est évaporé avant d’ajouter des cellules à la plaque contenant les couverdisses. Éliminez tout résidu d’éthanol en ajoutant du PBS stérile dans le plat pendant 10 à 15 minutes ; retirer le PBS avant de semer les cellules.
   2. Semez 200 000 cellules exprimant du LivePAR par antenne de culture cellulaire. Laissez les cellules adhérer 24 à 36 heures aux couches de revêtement, conditionnez le milieu et commencez à se répliquer (à croître).
3. Induction des foyers PAR
   1. Exposez les cellules exprimant LivePAR à 100 μM NRH, 10 μM PARGi, et 10 μM MNNG ou 40 μM tBuOOH. De plus, pour tester la formation de PARP1/PARP2 dépendante de PARP1/PARP2, inhibez PARP1/PARP2 en ajoutant 10 μM de PARPi. Ajoutez les composés directement dans le milieu contenant les cellules des couvertures et faites doucement tourner le milieu dans les plats de culture cellulaire pour répartir les composés. Incubez les plats de 60 mm à 37 °C pendant 60 à 90 minutes.
      REMARQUE : La NRH est utilisée pour garantir que des niveaux suffisants de NAD⁺ cellulaire sont disponibles pour une PARylation optimale médiée par PARP1/^PARP2 33,46,47. PARGi est utilisé pour empêcher que les chaînes PAR synthétisées par PARP1/PARP2 ne soient décomposées par PARG. Le MNNG ou tBuOOH est utilisé pour induire les modifications de la base de l’ADN afin d’initier le BER, ce qui conduit à l’activation de PARP1/PARP2. PARPi est utilisé pour confirmer que le signal (foyers) résulte de l’activation de PARP1/PARP2.
4. Fixation des cellules et montage des couvertures
   1. Retirez le médium et lavez avec du PBS.
      REMARQUE : Un lavage une ou deux fois avec PBS est important, car le milieu utilisé pour cultiver les cellules contient une forte concentration de protéines sériques. Le lavage avec PBS enlève aussi les résidus de MNNG ou de tBuOOH encore présents dans le substrat.
   2. Préfixez dans 4 % de formaldéhyde dans le PBS pendant 15 minutes à température ambiante. Laver les cellules 3 fois avec PBS.
   3. Corrigez en ajoutant 3 mL de méthanol froid (-20 ^°C) : acétone (7:3) aux cellules. Placez les plats à -20 ^°C pendant 9 minutes.
   4. Retirez le méthanol : l’acétone. Laver 3 fois avec du PBS.
   5. Pipette 15 μL de milieu anti-décoloration contenant du DAPI sur les lames en verre. Montez délicatement les gaines de couverture sur le support de montage avec les cellules tournées vers l’intérieur, minimisant ainsi les bulles.
   6. Centrez, fixez et scellez les côtés de la housse de couverture sur la lame en verre en appliquant une petite quantité d’émail transparent pour clous sur les côtés de la gaine. Placez les lames dans le noir pour laisser sécher l’émail des ongles (~10 min). Conservez les lames dans le noir à 4 °C jusqu’à ce qu’elles soient prêtes à l’image.
5. Cellules d’imagerie
   1. Imagez toutes les lames au moins 10x à un grossissement de 63×, à l’aide d’un microscope confocal. Détecter les foyers PAR à l’aide du laser 488 nm et la coloration nucléaire (DAPI) avec le laser 405 nm (par exemple, voir Figure 2).
6. Analyse des images confocales
   1. Créez un fichier texte contenant le texte suivant et nommez-le « LivePAR_Macro ». Ce macro facilite la quantification « automatique » des foyers de PAR dans les noyaux des cellules exprimant LivePAR :
      macro « DAPI positive staining [1] » {
      tit=getTitle() ;
      run(« Duplique... », « titre=DAPI doublon ») ;
      selectWindow (« DAPI »)
      run(« 8-bit ») ;
      run (« Split Channels »)
      selectWindow(« C2-« +"DAPI ») ;
      close() ;
      selectWindow(« C1-« +"DAPI ») ;
      run (« Gaussian Blur... », « Sigma=3 ») ;
      setAutoThreshold(« Default ») ;
      run (« Make Binary ») ;
      run(« Invertir »)
      run (« Combler les trous »)
      run (« Bassin versant »)
      run(« Analyser les particules... », « taille=50,00-Infini circularité=0,00-1,00 montre=Contours ajouter exclure inclure in_situ ») ;
      renom(« DAPI_"+tit) ;
      selectWindow(« DAPI_"+tit) ;
      close() ;
      }
      macro « PAR [2] » {
      setBatchMode(true) ;
      run(« 8-bit ») ;
      t=getTitle() ;
      run(« Duplicate... », « title=GB1 duplicate ») ;
      run(« Duplique... », « titre=GB20 dupliqué ») ;
      selectWindow (« GB20 »)
      run(« Gaussian Blur... », « radius=20 stack ») ;
      selectWindow(« GB1 ») ;
      run(« Gaussian Blur... », « radius=1 stack ») ;
      imageCalculator (« Soustraire créer une pile « , « GB1 », « GB20 ») ;
      selectWindow(« GB1 ») ;
      close() ;
      selectWindow(« GB20 ») ;
      close() ;
      selectWindow (« Résultat de GB1 ») ;
      renom(« Blank_GB1-GB20_"+t) ;
      titre = getTitle() ;
      run (« Split Channels »)
      selectWindow(« C1-« +title) ;
      close() ;
      selectWindow(« C2-« +title) ;
      setThreshold(90,255) //la valeur 90 peut être modifiée pour tenir compte de la variabilité expérimentale
      run(« Analyser les particules... », « taille=0,00-200 circularité=0,00-1,00 montre=Masques résumer ») ;
      close (« C2-»+titre) ;
      selectWindow(« Masque de C2-« +titre) ;
      Close () ;
      setBatchMode(faux) ;
      }
   2. Téléchargez et installez ImageJ sur l’ordinateur (https://imagej.net/ij/download.html).
   3. Ouvrez ImageJ et installez la macro (fichier texte : LivePAR_Macro) en cliquant sur Plugins | Macros | Installez.
   4. Ouvrez tous les fichiers confocaux dans ImageJ et enregistrez-les comme fichiers *.tif pour préserver les fichiers originaux.
   5. Ouvrez un tableau Excel et enregistrez-le comme [date]_[Cell Line]_Foci Analyse.
   6. Analysez un fichier *.tif à la fois. Appuyez sur 1 pour trouver les noyaux ; lorsqu’une fenêtre intitulée ROI Manager s’ouvre, sélectionnez toutes les entrées de la fenêtre et appuyez sur ajouter pour superposer la zone du noyau sur l’image originale. Supprimez les noyaux mal identifiés. Dessinez le noyau à l’aide de l’outil de sélection à main levée et appuyez sur 2 pour quantifier les foyers PAR.
      REMARQUE : N’incluez pas les noyaux qui ne sont pas entièrement à l’intérieur du référentiel.
   7. Sélectionnez chaque noyau dans le gestionnaire de ROI un par un et appuyez sur 2. Un décompte apparaîtra indiquant le nombre de foyers au sein du noyau sélectionné. Une fois que les foyers de tous les noyaux du fichier ont été notés, copiez-collez les informations dans le tableur ouvert.
   8. Répétez les étapes 3.6.6 et 3.6.7 avec tous les fichiers *.tif.
   9. Tracez les foyers PAR par noyau dans le logiciel choisi (par exemple, voir Figure 3).

Résultats

Les cellules exprimant la sonde LivePAR peuvent être générées en produisant un lentivirus codant pour la protéine de fusion RNF146(100-182)-EGFP (Figure 1A). Les cellules peuvent être évaluées après une expression transitoire jusqu’à deux semaines après la transduction ou comme lignées cellulaires stables après sélection en hygromycine (Figure 1B⁾¹. Après un traitement par génotoxine, les foyers de PAR in...

Discussion

Le test LivePAR a été développé pour détecter les sites de dommages à l’ADN génomique nucléaire où PARP1/PARP2 synthétise activement des chaînes PAR. Pour cela, un fragment de RNF146 codant le domaine WWE (acides aminés 100–182) a été fusionné à EGFP 1,2,3,37. Les sondes PAR supplémentaires que nous avons décrites codent pour l’EGFP fusionnées aux résidus d’aci...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Réactifs, Produits chimiques et Peptides
0,45 & micro ; Filtres steriflip m Durapore	Sigma-Aldrich	Cat# SE1M003M00
Housses de microscope 20 x 20 mm	Thermo Fisher Scientific	Cat# 22-170-371
Acétone	Thermo Fisher Scientific	Cat# A18-1
Antennes de culture cellulaire, 100 mm	VWR	Cat# 25382-166
Plats de culture cellulaire, 60 mm	Fisher Scientific	Cat# 430166
Plaques de culture cellulaire, 6 puits	VWR	Cat# 62406-161
Cryovials, 2 mL	VWR	Cat# 89499-722
Éther diéthylique	Thermo Fisher Scientific	Cat# 60-29-7
Diméthylsulfoxyde	Thermo Fisher Scientific	Cat# BP231-1
Filtres stériles jetables, 0,45 & micro ; m	Sigma-Aldrich	Cat# SE1M003M00
DMEM	Corning	Cat# 15-017-CV
Éthanol, 200 proof	Laboratoires de décontamination	Cat# 2701
Lames de microscope en verre	Thermo Fisher Scientific	Cat# 12-544-4
Sérum fœtal bovin inactivé par la chaleur	Atlanta Biologics	Cat# S11150
Acide chlorhydrique	Thermo Fisher Scientific	Cat# A144-212
Hygromycine	Thermo Fisher Scientific	Cat# 10687010
Gros lingettes Kim	Kimberly-Clark	Cat# 34256
Lenti-X GoStix Plus Kit	Takara	Cat# 631280
Méthanol	Thermo Fisher Scientific	Cat# A452SK-4
MNNG	Molport	Cat# N493990
NRH (1-[(2R,3R,4S,5R)-3,4-Dihydroxy-5-(hydroxyméthyle) tétrahydrofurane-2-yl]-4H-pyridine-3-carboxamide)	Marie Migaud ou  ; NuChem Sciences Inc
Inhibiteur de PARG (PDD00017273)	Sigma-Aldrich	Cat# SML1781
Inhibiteur de PARPi (Veliparib, ABT-888)	MedChemExpress  ;	Cat# HY-10129
Pénicilline/streptomycine	Gibco	Cat# 15140-122
Polybrene	Sigma-Aldrich	Cat# TR-1003-G
tBuOh	Thermo Fisher Scientific	Cat# 180345000
TransIT-x2 (Réactif de transfection)	Mirus	Cat# MIR-6006
Triton-X100	VWR	Cat# 0694
Trypsine-EDTA	Thermo Fisher Scientific	Cat# 25200-056
Vectashield (H-1000) médium de montage anti-décoloration	Thermo Fisher Scientific	Cat# NC1695563
Lignes cellulaires  ;   ;
293-FT  ;	Thermo Fisher Scientific	Cat# R70007
(dérivé de cellules rénales embryonnaires humaines transformées avec l’antigène T grand SV40)	Thermo Fisher Scientific	Cat# R70007
LN428  ;	Don généreux de la part	N/A
(Lignée cellulaire de tumeur de glioblastome humain)	Dr Ian Pollack (Université de Pittsburgh)	N/A
RPE-1  ;	ATCC	Cat# CRL-4000
(cellules épithéliales du pigment rétinien humain immortalisé par hTERT)	ATCC	Cat# CRL-4000
U2OS  ;	ATCC	Cat# HTB-96
(Gamme cellulaire d’ostéosarcome humain)	ATCC	Cat# HTB-96
ADN recombinant
pMDLg/pRRE	Action de laboratoire # 253	Addgene, Cat# 12251
pRSV-Rev	Actions de laboratoire # 254	Addgene, Cat# 12253
pMD2.G	Action de laboratoire # 252	Addgene, Cat# 12259
pLV-EF1A-LivePAR-Hygro (LivePAR est le domaine WWE de RNF146, résidus d’acides aminés 100-182, fusionnés à EGFP ; contient une cassette de résistance à l’hygromycine)	Action de laboratoire # 1727	Addgene, Cat# 176063  ;
Logiciels et algorithmes  ;
Adobe Illustrator (pour la préparation des figures)	Adobe Systems	Version 2024
GraphPad Prism	GraphPad	Version 10.5.0  ; (Mac OS X)
ImageJ	NIH	https://imagej.net/ij/download.html